國產細胞角蛋白19片段CYFRA21-1化學發(fā)光定量檢測試劑盒的性能評估*

方宜臻，葉輝銘，劉江武，金宏偉，林永志，顏水堤，于 洋，高 磊，徐飛海，張忠英△

(1.廈門大學附屬中山醫(yī)院檢驗科，福建廈門 361000；2.廈門萬泰凱瑞生物技術有限公司，福建廈門 361000)

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·臨床研究·

國產細胞角蛋白19片段CYFRA21-1化學發(fā)光定量檢測試劑盒的性能評估*

方宜臻1，葉輝銘1，劉江武2，金宏偉1，林永志1，顏水堤1，于 洋1，高 磊2，徐飛海2，張忠英1△

(1.廈門大學附屬中山醫(yī)院檢驗科，福建廈門 361000；2.廈門萬泰凱瑞生物技術有限公司，福建廈門 361000)

目的 對廈門萬泰凱瑞生物技術有限公司的細胞角蛋白19片段非小細胞肺原相關抗原21-1(CYFRA21-1)化學發(fā)光定量檢測試劑盒進行分析性能評估。方法 依據《體外診斷試劑分析性能評估系列指導原則》等文件對試劑盒的敏感性、線性范圍、可報告范圍、準確度、精密度、交叉反應等性能進行評估，同時與電化學發(fā)光法平行比對，檢測配對血清/血漿結果的一致性。結果 該試劑盒檢測最低限為0.1 ng/mL；線性范圍為 0.1～1 000.0 ng/mL；可報告范圍達0.1～2 000.0 ng/mL；批內精密度為6.15%～9.46%，批間精密度為7.57%～11.00%；回收率達99.60%；與多種常見腫瘤抗原無交叉反應；輕度溶血、膽紅素小于或等于340 μmol/L、三酰甘油小于或等于18.1 μmol/L及類風濕因子小于或等于400 U/mL時，對試劑無顯著干擾；與電化學發(fā)光法檢測總符合率為98.56%，一致性良好(P<0.05，Kappa=0.965)；血清、血漿標本檢測一致性良好(P<0.05，Kappa=0.936)。結論 廈門萬泰凱瑞生物技術有限公司生產的細胞角蛋白19片段CYFRA21-1化學發(fā)光定量檢測試劑盒各項性能評估良好，可滿足臨床檢測要求。

細胞角蛋白19片段； 試劑； 化學發(fā)光免疫分析法； 方法學評價

細胞角蛋白是一種構成上皮組織中間纖維亞單位的結構蛋白，是細胞骨架的重要組成部分[1]。人體中約有20種相對分子質量為(40～70)×103的角蛋白，其中細胞角蛋白19在正常狀態(tài)下水平極低，當細胞惡性變時大量細胞角蛋白19的可溶性片段釋放入血，通過2種特異性單克隆抗體KS19.1和BM19.21可測定出相對分子質量約為30×103的細胞角蛋白19片段[2]。眾多研究發(fā)現，血液、尿液中的細胞角蛋白19片段是一種重要腫瘤標志物，在非小細胞肺癌[3]、鼻咽癌[4-5]、膀胱癌[6-8]、食管癌等腫瘤中均具有良好的臨床診斷價值[9]。

目前，非小細胞肺癌相關抗原21-1(CYFRA21-1)的檢測方法主要以電化學發(fā)光法和化學發(fā)光法免疫分析法為主，2種方法具有高敏感性、高特異性、高穩(wěn)定性等優(yōu)點，但是95.00%以上的市場份額都被國外品牌所占領，且試劑盒成本昂貴。因此，開發(fā)具有自主知識產權，評估并使用性能穩(wěn)定、優(yōu)良的國產CYFRA21-1化學發(fā)光法免疫分析試劑盒是打破國外品牌長期壟斷局面的有效途徑，能大大降低臨床檢驗CYFRA21-1的成本，降低醫(yī)療費用。

廈門萬泰凱瑞生物技術有限公司與本實驗室合作，對廈門萬泰公司的細胞角蛋白19片段CYFRA21-1定量檢測試劑盒的敏感性、線性范圍、交叉反應等性能進行評價，同時與德國羅氏公司的CYFRA21-1定量測定試劑盒(電化學發(fā)光法)進行平行比對，結果顯示國產試劑各性能指標良好?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 (1)比對血清：2013年7月患者血清標本中選取348例標本，用于試劑A、B平行比對試驗。(2)準確度驗證試驗血清：標本庫選取1例健康人血清，用于準確度驗證試驗。(3)可報告范圍試驗血清：標本庫中選取5例不同CYFRA21-1水平低值標本和3例不同CYFRA21-1水平高值標本用于可報告范圍驗證試驗。(4)精密度試驗標本：標本庫中選取選1例低值及1例高值血清(血清標本1、血清標本2)用于精密度試驗。(5)血清/血漿相關性分析標本：收集2013年7月99例子患者配對血清/血漿標本共99對198例，用于血清/血漿一致性分析。(6)交叉反應試驗標本：標本庫中選取42例甲胎蛋白(AFP)、腫瘤抗原(CA)12-5、CA15-3、CA19-9、癌胚抗原(CEA)、鱗狀細胞癌相關性抗原(SCC)分別為陽性且CYFRA21-1經電化學發(fā)光法檢測為陰性的標本，用于交叉反應試驗。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 采用CARIS系列化學發(fā)光儀(廈門優(yōu)邁科醫(yī)學儀器有限公司)，COBAS e601(德國羅氏公司)。

1.2.2 試劑 (1)試劑A：廈門萬泰凱瑞生物技術有限公司生產的細胞角蛋白19片段CYFRA21-1定量檢測試劑盒(批號RM2013031501、RM2013031601、RM2013031701)；(2)試劑B：德國羅氏公司的非小細胞肺癌相關抗原21-1定量測定試劑盒(批號173353)；(3)干擾物：膽紅素(Aladdin Chemistry Co.Ltd，批號39340)、三酰甘油(Aladdin Chemistry Co.Ltd，批號55543)、類風濕因子(Biorbyt，批號D6987)；(4)L系列參考品(廈門萬泰凱瑞生物技術有限公司，批號20130326)；(5)參考品M(0水平校準品，廈門萬泰凱瑞生物技術有限公司，批號20130326)；(6)企業(yè)一級校準品(廈門萬泰凱瑞生物技術有限公司，批號20130314)。

1.3 方法

1.3.1 分析敏感性評價 試劑A檢測梯度稀釋的L系列參考品并擬合劑量反應曲線，同時重復測定0水平校準品20次，計算最低檢測限。

1.3.2 線性范圍評價 參考CLSI EP-6A文件提供的方案并依據《體外診斷試劑分析性能評估系列指導原則》[10]，用試劑A 檢測梯度稀釋的企業(yè)一級校準品，以校準品水平對數為X，測定水平平均值對數為Y建立回歸方程并計算偏離直線平均差異(ADL)，評價其線性范圍。

1.3.3 可報告范圍評價 參考CLSI EP-6A文件并依據《體外診斷試劑分析性能評估系列指導原則》[10]，試劑A重復檢測5個水平的低值標本(Y1、Y2、Y3、Y4、Y5)及3個不同水平的高值標本(H1、H2、H3)。變異系數(CV)≤10.00%的最低水平作為可報告范圍低限。高值標本還原水平與理論水平偏差不超過(±10.00)%時，其還原水平為可報告范圍高限。

1.3.4 準確度評價 20 μL稀釋校準品加入180 μL健康人血清制得混合血清，將稀釋校準品、正常人血清及混合血清重復測量3次，參考 CLSI EP9-A2文件并根據《體外診斷試劑分析性能評估系列指導原則》計算準確度[11]。

1.3.5 精密度評價 基于《YYT 1175-2010 腫瘤標志物定量測定試劑(化學發(fā)光免疫分析法)》的有關要求并參考CLSI EP5-A文件[12]，用3批試劑(批號：RM2013031501、RM2013031601、RM2013031701)檢測血清標本1、2并計算批內和批間CV。

1.3.6 干擾試驗 參考CLSI EP7-A文件并依據《體外診斷試劑分析性能評估系列指導原則》[13]，用3批試劑(批號RM2013031501、RM2013031601、RM2013031701)分別檢測同一患者溶血前與溶血后的血清標本，考察輕度溶血對試劑準確度的影響；用健康人血清稀釋膽紅素溶液、三酰甘油溶液及類風濕因子溶液，測試膽紅素、三酰甘油及類風濕因子對試劑檢測準確度的影響。計算添加干擾因素前后的百分偏差(Bias)，以超過±10.00%判定為存在干擾。

1.3.7 交叉反應驗證 試劑A檢測42例交叉反應試驗標本，用于交叉反應的驗證。

1.3.8 試劑A與試劑B平行比對試驗 試劑A、B平行測定347例患者血清CYFRA21-1水平，以試劑B的結果為X，試劑A結果為Y，構建線性回歸方程。同時，根據各試劑的參考范圍將結果判為CYFRA21-1異常或正常，計算總符合率并進行一致性分析和相關性分析。

1.3.9 血漿/血清相關性分析 試劑A檢測99對198例配對血清/血漿標本，比較血清、血漿標本檢測結果的一致性、相關性并以血漿檢測結果為Y，血清檢測結果為X進行簡單線性回歸分析。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用多項回歸分析并計算ADL，當ADL小于相應臨界值時認為多項式具有臨床可接受的非線性；一致性評價采用Kappa一致性檢驗，相關性分析采用Pearson相關性分析，線性回歸分析采用簡單線性回歸分析，當P<0.05時表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 分析敏感性評價 劑量反應曲線見圖1，試劑A最低檢測水平平均值為0.095 2 ng/mL，該試劑盒最低檢出限為0.1 ng/mL。

圖1 試劑A (RM2013031501)的劑量反應曲線

2.2 線性范圍評價 檢測結果，見表1。PctBnd取5.00%時， ADL均小于其臨界值具有臨床可接受的非線性，見表2。因此，本試劑盒線性范圍為0.1～1 000.0 ng/mL。

表1 試劑A(RM2013031501)對企業(yè)一級校準品梯度稀釋的檢測結果(ng/mL)

表2 試劑A(RM2013031501)多項式回歸方程及線性檢驗

注：-表示無數據。

2.3 可報告范圍評價 可報告范圍的結果，見表3、4。水平為0.076～0.206 ng/mL時，CV值均小于10.0%，所以0.1 ng/mL為可報告范圍低限。高值標本進行2倍稀釋時，CV值小于5.00%且還原水平與理論水平的偏差Bias均小于10.00%，可報告范圍高限為2 000.0 ng/mL，因此該試劑盒可報告范圍為0.1～2 000.0 ng/mL。

表3 試劑A(RM2013031501)可報告范圍下限檢測結果

表4 試劑A(RM2013031501)可報告范圍上限檢測結果

2.4 準確度評價 回收率為95.60%～103.70%，平均回收率為99.60%，定量準確性良好。

2.5 精密度評價 批內精密度為6.15%～9.46%，批間精密度為7.57%～11.00%，試劑盒的重復性良好，見表5。

2.6 干擾試驗 溶血、膽紅素、三酰甘油及類風濕因子對試劑A影響較小，添加干擾因素后的Bias均在10.00%以內。見表6。

表5 試劑A精密度

注：血清標本1批間CV為7.57%，血清標本2批間CV為11.00%。

表6 不同干擾因素對試劑檢測結果的影響

2.7 交叉反應驗證 AFP、CA125、CA15-3、CA19-9、CEA、SCC對試劑A的交叉反應物水平分別為：31.54～244.72 ng/mL、104.8～516.2 U/mL、72.63～189 U/mL、134.2～801.3 U/mL、119.9～379.6 ng/mL、11.9～35.8 ng/mL，試劑A對多種腫瘤抗原交叉反應試驗結果均為陰性。

圖2 A、B試劑血清CYFRA21-1檢測結果線性相關擬合

2.8 試劑A與試劑B平行比對試驗 試劑A與試劑B呈良好的線性關系，線性回歸方程為Y=1.524X-1.889(R2=0.975，P<0.05)，見圖2。同時，一致性比較及相關性分析的結果顯示試劑A與試劑B具有良好的一致性(Kappa=0.971，P<0.05)及相關性(r=0.987，P<0.05)，總符合率為98.56%。

2.9 血漿/血清相關性分析 配對血漿/血清標本的測定結果具有良好一致性(Kappa=0.936，P<0.05)及相關性(r=0.949，P<0.05)，線性回歸方程為Y=0.947X+0.242(R2=0.900，P<0.05)，見圖3，因此試劑A對血清和血漿的檢測結果差異無統(tǒng)計學意義。

圖3 血清、血漿CYFRA21-1測定結果線性相關擬合圖

3 討 論

CYFRA21-1是一種臨床腫瘤標志物，尤其對非小細胞肺癌有重要診斷價值。目前，國內檢測CYFRA21-1多以羅氏、雅培等國外品牌為主，臨床檢驗成本昂貴。因此，國產CYFRA21-1化學發(fā)光免疫試劑盒的研究、應用和推廣對降低醫(yī)療費用、提升患者滿意度具有重要社會意義。萬泰凱瑞生物技術有限公司與本實驗室合作，對廈門萬泰凱瑞生物技術有限公司的細胞角蛋白19片段CYFRA21-1化學發(fā)光定量檢測試劑盒的敏感性、線性范圍、可報告范圍、準確度、精密度、干擾試驗、交叉反應進行評估，并與試劑B(化學發(fā)光法)進行平行比對，結果顯示，該試劑盒各項檢測性能均可滿足臨床檢驗要求，且適用于血清及血漿標本。

干擾試驗結果表明膽紅素、三酰甘油及類風濕因子不會對檢測結果造成影響，但本試驗添加的外源性膽紅素、三酰甘油、類風濕因子水平分別為0～340 μmol/L、0～18.1 mmol/L和0～400 U/mL，因此，對于膽紅素水平高于340 μmol/L、高乳糜濁度及高類風濕因子水平標本，本試劑盒的抗干擾能力還有待進一步改良。同時，溶血前后血清標本檢測結果顯示，輕度溶血對檢測結果影響較小，但中、重度溶血對該試劑盒的抗干擾能力還未驗證，臨床上應避免中、重度溶血對本試劑盒檢測結果的影響。

在方法學平行比對試驗中，試劑A與試劑B(電化學發(fā)光法)有較好相關性，其檢測結果與電化學發(fā)光法等效，而線性范圍高于電化學發(fā)光法(電化學發(fā)光法的檢測范圍為0.1～500 ng/mL，試劑A為0.1～1 000.0 ng/mL)。同時，試劑A可報告范圍為0.1～2000.0 ng/mL，高于電化學發(fā)光法的0.1～1000.0 ng/mL，表明該試劑盒相較于電化學發(fā)光法不僅有價格優(yōu)勢，部分指標性能更優(yōu)于羅氏，有廣闊的應用前景。

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廈門市重點實驗室基金資助項目(3502Z20130006)；福建省科技計劃項目(2011D018)?！?/p>

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.22.031

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1673-4130(2016)22-3177-04

2016-05-21

2016-08-14)