7種甘肅道地藥材凝血活性初步分析

袁毅君，趙　麗，焦成瑾，陳　荃

（天水師范學(xué)院 生物工程與技術(shù)學(xué)院，甘肅 天水 741001）

7種甘肅道地藥材凝血活性初步分析

袁毅君，趙麗，焦成瑾，陳荃

（天水師范學(xué)院 生物工程與技術(shù)學(xué)院，甘肅 天水 741001）

目的：檢測(cè)7種甘肅道地藥材對(duì)雞、兔紅細(xì)胞的凝集活性。方法：將7種藥材分別用PBS（磷酸緩沖液）浸提，浸提液分別對(duì)兔和雞紅細(xì)胞進(jìn)行凝集活性測(cè)定，以檢測(cè)7種藥材的最低效價(jià)。結(jié)果：7種中藥浸提液對(duì)紅細(xì)胞表現(xiàn)不同的凝集活性，具有較高凝集活性的為防風(fēng)對(duì)兔紅細(xì)胞效價(jià)23；大黃對(duì)雞紅細(xì)胞效價(jià)25.結(jié)論：7種中藥均有不同的凝集活性，同種中藥對(duì)不同紅細(xì)胞的凝集活性不同。

道地藥材；凝血活性；凝集素；效價(jià)

凝集素是一類(lèi)糖結(jié)合專(zhuān)一性的非免疫來(lái)源的能凝集細(xì)胞或沉淀含糖大分子的蛋白質(zhì)或糖蛋白，普遍分布于微生物、植物與動(dòng)物中的細(xì)胞凝集因子，具有凝集紅細(xì)胞的作用。[1-3]凝集素廣泛分布于豆科、茄科、大戟科、禾本科、百合科和石蒜科等眾多植物類(lèi)群以及菌類(lèi)中。已發(fā)現(xiàn)的植物凝集素近千種，其中以豆科植物最多，豆科植物凝集素有600多種。近年來(lái)通過(guò)分離鑒定，對(duì)它們的性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)及功能做了大量研究，許多工作已深入到基因水平。對(duì)植物凝集素的研究主要集中在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)等方面，在血型鑒定，調(diào)節(jié)免疫機(jī)能，骨髓移植，促進(jìn)有絲分裂作用，抑制腫瘤生長(zhǎng)，抗病毒，診斷與鑒別診斷，參與人類(lèi)很多疾病過(guò)程以及在植物病蟲(chóng)害防治，生物固氮等方面都有研究和應(yīng)用。[4-7]另外，凝集素已經(jīng)成為某些疾病的預(yù)警分子，如在腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中與腫瘤細(xì)胞的侵襲能力相關(guān)，在腫瘤組織中都有異常表達(dá)，即可作為多種惡性腫瘤和癌前病變的早期檢測(cè)標(biāo)志物，也可作為腫瘤預(yù)后評(píng)價(jià)的參考指標(biāo)。[8-9]因此凝集素的生化特性和生物學(xué)功能已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。

甘肅省為我國(guó)中草藥重要產(chǎn)地之一，出口量占90%.本區(qū)盛產(chǎn)黃芪、紅芪、紋黨、岷當(dāng)、大黃等藥材。[10,11]藥理研究證明來(lái)自道地藥材黃芪、紅芪、黨參、當(dāng)歸的多糖具有增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、抗衰老、抗炎等多種作用。[12-14]黃芪的不同提取物包括黃芪總提取物、黃芪多糖或黃芪皂甙以及紅芪多糖，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。[15-17]有關(guān)甘肅道地藥材凝集素凝集活性的初步研究方面少見(jiàn)報(bào)道。[18-19]本項(xiàng)工作收集產(chǎn)于甘肅本地的7種中藥材，作用于兩種紅細(xì)胞對(duì)其凝集活性進(jìn)行初步測(cè)定，旨在為道地藥材的藥理活性的研究提供相關(guān)資料。

1　材料與方法

1.1中藥材

7種藥材均采購(gòu)于產(chǎn)地，見(jiàn)表1.為未炮制處理的原藥材，粉碎過(guò)篩，冷藏備用。

表1　7種藥材產(chǎn)地

1.2主要試劑與儀器

所用試劑均為AR級(jí)，包括：PBS緩沖液（氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀）、阿氏液（檸檬酸、檸檬酸鈉、氯化鈉、葡萄糖）等。

Olympus倒置顯微鏡及其顯微攝像系統(tǒng)（JA?PAN）；電子恒溫干燥箱（型號(hào)：GZX-DH-40X45-13S，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（型號(hào)：TGL-20M，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司）；電子天平（型號(hào)：SHIMADZU AUY220）；數(shù)控超聲波清洗儀（型號(hào)：KQ-50DB，昆山市超聲波儀器有限公司）等。

1.3阿氏液、PBS緩沖液的制備[20]

阿氏液：稱(chēng)取葡萄糖2.05g、檸檬酸鈉0.88g、檸檬酸0.055g、氯化鈉0.42g，蒸餾水溶解定容至100ml，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

PBS緩沖液：稱(chēng)取氯化鈉1.44g、磷酸二氫鈉0.296g、磷酸氫二鉀0.086g，蒸餾水溶解定容至200ml，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.42%紅細(xì)胞懸液制備[7，19，21]

使用吸有肝素的注射器自兔耳緣靜脈抽取血液或雞自翼下靜脈抽取血液。將新鮮血液以阿氏液5倍體積稀釋混勻，4℃冰箱保存。臨用時(shí)0.85%生理鹽水離心洗滌4次（1500r/min，5min）。棄上清液和界面白細(xì)胞層，至細(xì)胞壓積值恒定。用阿氏液配成壓積比為2%的紅細(xì)胞懸液。

1.5中藥材浸提液的制備[22]

分別稱(chēng)取7種中藥材粉末各2g，于燒杯中各加入20ml的PBS緩沖液，充分?jǐn)嚢韬螅胖?℃冰箱浸泡24h.用尼龍布將各種中藥材浸提液過(guò)濾，濾液離心，10000r/min，10min，4℃.離心后轉(zhuǎn)移上清，4℃冰箱保存待用。

1.6凝集現(xiàn)象觀察與效價(jià)測(cè)定[22]

取雙凹載片，做好標(biāo)記，設(shè)PBS為空白對(duì)照。用微量移液槍在第一張載片加入中藥材浸提液25μl，并依次倍比稀釋?zhuān)叫袠?個(gè)，最后加入兔紅細(xì)胞懸液（rabbit Red Blood Cell，rRBC）25μl，混勻后靜置20～30min，肉眼和顯微鏡觀察紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象并確定凝集效價(jià)。通過(guò)Olympus數(shù)碼攝像系統(tǒng)選取典型凝集現(xiàn)象玻片進(jìn)行顯微拍照。

用同樣方法進(jìn)行雞紅細(xì)胞（chicken Red Blood Cell，cRBC）凝集現(xiàn)象觀察與凝集效價(jià)評(píng)定。

2　結(jié)　果

2.17種中藥的凝血現(xiàn)象

結(jié)果見(jiàn)圖1.圖1中A與B圖為PBS對(duì)照，從圖1中的A與B圖顯示細(xì)胞之間比較松散，呈單個(gè)分散狀，并且細(xì)胞保持著原有的形態(tài)，分別以7種道地藥材浸提液處理雞紅細(xì)胞（chicken Red Blood Cell，cRBC）與兔紅細(xì)胞（rabbit Red Blood Cell， rRBC）后，觀察凝集反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，板藍(lán)根、大黃、當(dāng)歸、黨參、防風(fēng)、甘草、黃芪有明顯的凝集現(xiàn)象出現(xiàn)，不同的中藥凝集效果不同，具體結(jié)果見(jiàn)圖1 C-P圖。凝集反應(yīng)發(fā)生時(shí)，凝集的紅細(xì)胞呈片狀，如板藍(lán)根和甘草的浸提液作用于cRBC或rRBC后呈現(xiàn)的凝集現(xiàn)象；還有凝集紅細(xì)胞成團(tuán)塊，如防風(fēng)的浸提液作用于cRBC或rRBC后的凝集現(xiàn)象；或凝集紅細(xì)胞成串珠狀，如大黃浸提液作用于cRBC或rRBC后的凝集現(xiàn)象；或凝集紅細(xì)胞狀態(tài)介于上述現(xiàn)象之間，如當(dāng)歸、黨參、黃芪。圖1 D、K圖顯示rRBC或cRBC的形態(tài)出現(xiàn)了輕微變形。由于中草藥中所含成分復(fù)雜，因而浸提液對(duì)細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生影響。

圖1　7種道地藥材對(duì)雞紅細(xì)胞和兔紅細(xì)胞的凝集效應(yīng)

2.27種中藥浸提液凝集效價(jià)測(cè)定結(jié)果[18]

中藥材中提取的凝集素生物活性的大小通常用凝集效價(jià)來(lái)表示，即能引起凝集現(xiàn)象的凝集素的最高稀釋倍數(shù)2n表示(n為中藥材待測(cè)樣品所含凝集素的稀釋倍數(shù)，稀釋倍數(shù)越高其生物活性就越高)，實(shí)驗(yàn)中的7種道地藥材的凝集素活性見(jiàn)表2.

由表2可見(jiàn)，所檢測(cè)的7種藥材分屬5科，使cRBC凝集的效價(jià)最高為大黃32（25），最低為甘草2（21）；使rRBC凝集的效價(jià)最高為防風(fēng)8（23），最低為甘草2（21）。將藥材中提取的凝集素的凝集效價(jià)分為四級(jí)（見(jiàn)表2），一級(jí)效價(jià)為>128；二級(jí)效價(jià)為32～64；三級(jí)效價(jià)為8～16；四級(jí)效價(jià)<8.則cRBC凝集效價(jià)：二級(jí)計(jì)1種為大黃；三級(jí)計(jì)5種為板藍(lán)根、當(dāng)歸、黨參、防風(fēng)、黃芪；四級(jí)計(jì)1種為甘草。rRBC凝集效價(jià)：三級(jí)效價(jià)計(jì)1種是防風(fēng)；四級(jí)效價(jià)計(jì)6種分別為板藍(lán)根、大黃、當(dāng)歸、黨參、甘草、黃芪。

表2　7種中藥浸提液凝集效價(jià)

3　討　論

所檢測(cè)的7種產(chǎn)于甘肅的道地藥材，以PBS制備的浸提液對(duì)兔紅細(xì)胞和雞紅細(xì)胞均顯示出凝集活性，但凝集效價(jià)在不同的紅細(xì)胞不同。同時(shí)表明PBS適合提取所采集的7種道地藥材中的凝集素。被測(cè)7種中藥的浸提液提取后對(duì)紅細(xì)胞表現(xiàn)不同的凝集活性，防風(fēng)對(duì)兔紅細(xì)胞具有較高凝集活性：23；大黃對(duì)雞紅細(xì)胞：25.并且同一種中藥對(duì)不同血細(xì)胞的凝集活性也存在明顯差異。7種中藥材中如當(dāng)歸、防風(fēng)同屬于傘形科，甘草、黃芪同屬于豆科，但各自的凝集效應(yīng)存在明顯差異，與其凝集素的含量不同或其所含有的凝集素種類(lèi)、性質(zhì)不同有關(guān)。

植物凝集素與細(xì)胞表面糖分子結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞與分子間、細(xì)胞與細(xì)胞間的信號(hào)識(shí)別；引發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列生化反應(yīng)，如誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬。[2]轉(zhuǎn)移程度高的腫瘤細(xì)胞高水平表達(dá)凝集素，參與同相鄰腫瘤細(xì)胞或寄主細(xì)胞的識(shí)別與粘附。[9]半夏凝集素在0.5或l mg/mL時(shí)抑制Hela細(xì)胞增殖；[23]駱駝蓬凝集素顯著抑制Hela細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡發(fā)生，對(duì)人類(lèi)食管癌細(xì)胞(Eca-109)和人類(lèi)肝癌細(xì)胞(BEL-7404)也有抗增殖活性。[24]蒙古黃芪凝集素(AMML)通過(guò)S期阻滯抑制K562細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。表明AMML是一個(gè)有效的細(xì)胞周期阻滯劑和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑，為其在腫瘤防治中的應(yīng)用提供重要的依據(jù)。[25]板藍(lán)根凝集素具有促進(jìn)胸腺淋巴細(xì)胞分裂的能力，提高機(jī)體免疫能力，顯著預(yù)防與良好治療流感病毒。僅馬藍(lán)板藍(lán)根凝集素具有血凝活性。抑毒試驗(yàn)證明板藍(lán)根凝集素的效價(jià)與其抑制流感病毒的作用成正相關(guān)，凝集活性不同最主要在種屬差異與地域差異。[19,26,27]植物凝集素有明顯的增強(qiáng)免疫、抗腫瘤和殺傷癌細(xì)胞的活性，未來(lái)可作為抗腫瘤藥物進(jìn)行開(kāi)發(fā)并應(yīng)用于臨床。

顯然甘肅道地藥材凝集素方面的研究還處于起步階段，有關(guān)凝集素的分離、純化與單體獲得，其分子結(jié)構(gòu)解析與道地藥材來(lái)源的凝集素多種藥理活性仍需進(jìn)一步的研究開(kāi)發(fā)。凝集素的生物活性研究將對(duì)道地藥材多種藥理活性的闡明也有重要意義。

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〔責(zé)任編輯王小風(fēng)〕

The Preliminary Analysis of Agglutinating Activity of Seven Kinds of Genuine Medicinal Materials in Gansu

Yuan Yijun1,Jiao ChengJin,Chen Quan,Zhao Li
(College of Bioengineering and Technology,Tianshui Normal University,Tianshui Gansu741001,China)

Objective:To test the agglutinating activity about seven kinds of Genuine Medicinal Materials in Gansu react with the red blood cells of chicken and rabbit respectively.Methods:Selected seven medicinal herbs were ex?tracted with PBS,then extracts agglutinating activity were detected with the red blood cells from rabbit and chicken respectively,determined the lowest titer of the herbs.Results:The agglutination activities of the lectins varied in the seven herbs extracts,and the higher agglutinating activity of the herb lectins in the two different blood cells are fol?lows:the titer of extracts from Radix Saposhnikoviae with the rabbit red blood cells is 23;but the titer of extracts from Radix et Rhizoma Rhel with chicken red blood cells is 25.Conclusion:Seven kinds of Chinese herbs present better agglutinating activity,the same Chinese herbs has different agglutinating activity with different erythrocyte samples.

Genuine Medicinal Materials;agglutinating activity;lectin;titer

R932

A

1671-1351（2016）05-0015-04

2016-06-11

袁毅君（1966-），女，甘肅天水人，天水師范學(xué)院生物工程與技術(shù)學(xué)院教授，博士。

國(guó)家自然基金項(xiàng)目“基于抑制硫氧還蛋白還原酶活性的甘肅道地藥材抗癌成分篩選”（81360619）階段性成果