D—乳酸大腸桿菌工程菌的馴化及其補料發(fā)酵研究

文瑤++周瑋++付相敏++趙筱++王金華++王永澤

摘要：以前期構建的D-乳酸大腸桿菌（Escherichia coli）工程菌LHY02為出發(fā)菌株，通過在乳酸鹽中對菌株進行馴化的方式來解除乳酸根對菌體的抑制作用；采用葡萄糖分批補加方式緩解高含量葡萄糖的阻遏效應，擬進一步提高大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸的產(chǎn)量、生產(chǎn)強度和糖酸轉(zhuǎn)化率。結果表明，馴化后的菌株LHY201在16%的葡萄糖發(fā)酵中D-乳酸產(chǎn)量比馴化前提高了36.7%。LHY201結合葡萄糖進行補料發(fā)酵（補料方式為8%+8%+4%），乳酸產(chǎn)量、發(fā)酵時間、糖酸轉(zhuǎn)化率以及生產(chǎn)強度分別為185.7 g/L、48 h、93.8%、3.87 g/L/h，D-乳酸光學純度達到99.6%，相比一次性添加20%葡萄糖的分批發(fā)酵，乳酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率分別提高了21.1%和21.2%，發(fā)酵周期縮短了一半。

關鍵詞：大腸桿菌工程菌；D-乳酸；馴化；補料發(fā)酵

中圖分類號：Q533+.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）18-4771-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.18.035

D-乳酸作為一種重要的手性中間體，是合成多種手性物質(zhì)的前體，在醫(yī)藥、農(nóng)藥、化工及耐熱型聚乳酸合成材料等方面的應用十分廣泛，其生產(chǎn)具有重要的實用價值。但相對于L-乳酸發(fā)酵生產(chǎn)而言，D-乳酸尚未實現(xiàn)大規(guī)模的生產(chǎn)和應用[1]。目前已有一些菌株能較高產(chǎn)量生產(chǎn)D-乳酸，如芽孢乳桿菌（Sporolactobacillus sp. CASD）經(jīng)過發(fā)酵花生粕，D-乳酸產(chǎn)量高達207 g/L[2]；經(jīng)過工程改造的肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）能利用甘油產(chǎn)142.1 g/L的D-乳酸，原料轉(zhuǎn)化率達到0.82 g/g[3]；同樣經(jīng)過工程改造的嗜堿芽孢桿菌產(chǎn)量可達143.99 g/L且生產(chǎn)強度可達3.04 g/L/h[4]；棒狀乳桿菌（Lactobacillus coryniformis）配合同步糖化工藝發(fā)酵新鮮的甜土豆，產(chǎn)量達到186.40 g/L，生產(chǎn)強度保持在 2.55～3.11 g/L/h[5]。

大腸桿菌具有遺傳背景清楚、營養(yǎng)要求低等優(yōu)點，在D-乳酸發(fā)酵中也引起了越來越多學者的重視。借助基因敲除手段配合兩階段發(fā)酵工藝，大腸桿菌Escherichia coli B0013-050B能產(chǎn)111.9 g/L高純度的D-乳酸[6]；選用為Ca（OH）2為發(fā)酵中和劑，大腸桿菌Escherichia coli ALS974能產(chǎn)138 g/L 的D-乳酸，生產(chǎn)強度高達6.3 g/L/h[7]；而課題組前期構建的一株出發(fā)菌株為Escherichia coli W的工程菌Escherichia coli HBUT-D，在6 t的發(fā)酵規(guī)模下，采用中途一次補料的方式，能產(chǎn)126 g/L D-乳酸，生產(chǎn)強度高達6 g/L/h[1]?？傮w來看，這些菌株發(fā)酵生產(chǎn)強度都較高，但大腸桿菌發(fā)酵D-乳酸的產(chǎn)量仍相對較低。

進一步提高大腸桿菌D-乳酸發(fā)酵產(chǎn)量，需更多的發(fā)酵原料，但微生物在發(fā)酵過程往往受到發(fā)酵原料中葡萄糖的阻遏及產(chǎn)物的抑制，繼續(xù)提高發(fā)酵原料中的葡萄糖含量會造成發(fā)酵殘?zhí)沁^高，限制了D-乳酸產(chǎn)量的提升[1]；而且從前期的研究中還意識到，隨著乳酸產(chǎn)物在發(fā)酵過程中的不斷增加，產(chǎn)物乳酸根對發(fā)酵的抑制現(xiàn)象將會更明顯[8]。

因此本研究擬以前期構建的工程菌Escherichia coli LHY02為研究出發(fā)菌株，通過在不同濃度的乳酸鹽對菌株進行馴化，提高其對乳酸鹽的耐受性，同時通過分批補料的發(fā)酵方式緩解高濃度葡萄糖的阻遏效應，最終達到進一步提高大腸桿菌D-乳酸的發(fā)酵產(chǎn)量、生產(chǎn)強度及糖酸轉(zhuǎn)化率的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 試驗所采用大腸桿菌E.coli LHY02（ΔfocA-pflB ΔfrdABCD ΔadhE ΔackA：pflBp6-acEF-lpd）由本實驗室構建，能高效利用葡萄糖或木糖發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸，在無氧條件下生長良好，保存在-80 ℃甘油管中。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）LB平板培養(yǎng)基（g/L）。蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉5，瓊脂20，121 ℃滅菌20 min。

2）乳酸鈉馴化培養(yǎng)基。參照文獻[9]配置NBS培養(yǎng)基，按試驗設計添加0～14%的乳酸鈉和20 g/L的葡萄糖（單獨滅菌，滅菌條件為115 ℃滅菌30 min）。

3）發(fā)酵種子培養(yǎng)基。配置NBS培養(yǎng)基并滅菌，葡萄糖（20 g/L）單獨滅菌后加入NBS培養(yǎng)基。

4）發(fā)酵培養(yǎng)基。3 L NBS培養(yǎng)基，按試驗需求分別添加一定量的葡萄糖。

1.2 方法

1.2.1 LHY02的耐乳酸鹽馴化 將平板上生長良好的單菌落挑取4～6個接種至100 mL含有2%乳酸鈉的馴化培養(yǎng)基中（培養(yǎng)基中加入20 mg左右已滅菌的CaCO3粉末），37 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)代培養(yǎng)，每代測菌體生物量（OD600），當連續(xù)數(shù)代OD600值變化較小時，按2%的接種量轉(zhuǎn)接至100 mL含4%乳酸鈉的新鮮馴化培養(yǎng)基中，繼續(xù)轉(zhuǎn)代培養(yǎng)，依此類推，逐漸將乳酸鈉添加量提高到12%，并在此濃度下反復馴化培養(yǎng)直至OD600值趨于平穩(wěn)，對馴化后的菌株命名為LHY201。

1.2.2 馴化后菌株的分批發(fā)酵 馴化前的菌株LHY02和馴化后的菌株LHY201分批發(fā)酵的操作和條件為：挑選LB平板上活化好的4～6個單菌落接發(fā)酵種子培養(yǎng)基中，150 r/min、37 ℃培養(yǎng)至OD600達到1.2～1.5左右。按10%的接種量接種至裝有3 L的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵。發(fā)酵條件為：150 r/min、37 ℃，通過流加4 mol/L Ca（OH）2控制發(fā)酵液pH為7。定時取樣，檢測樣品中菌體生物量（OD600值）、殘留葡萄糖濃度、D-乳酸含量及其光學純度、副產(chǎn)物琥珀酸和乙酸等雜酸的含量。計算時，選取3次平行發(fā)酵結果作為最終發(fā)酵數(shù)據(jù)。

1.2.3 LHY201補料分批發(fā)酵 補料分批發(fā)酵時，發(fā)酵參數(shù)與分批發(fā)酵一致，差異為葡萄糖的補加方式。采用兩種葡萄糖補加方式：①發(fā)酵培養(yǎng)基初始葡萄糖濃度80 g/L，當葡萄糖濃度降至約10 g/L時，通過一次性補加高濃度的葡萄糖（800 g/L）； ②發(fā)酵過程中分兩次補加葡萄糖。發(fā)酵培養(yǎng)基基礎葡萄糖（底糖）濃度為80 g/L，當葡萄糖濃度降至10 g/L左右時進行補加，第一次補加高濃度葡萄糖（800 g/L）；當葡萄糖濃度再次約降為10 g/L時補充至葡萄糖40 g/L。定時取樣，檢測樣品中菌體生物量（OD600值）、殘留葡萄糖濃度、D-乳酸含量及其光學純度、副產(chǎn)物琥珀酸和乙酸等雜酸的含量。計算時，選取3次平行發(fā)酵結果作為最終發(fā)酵數(shù)據(jù)。

1.2.4 發(fā)酵液的檢測

1）OD值的測定。如發(fā)酵液中無Ca（OH）2，可直接用分光光度計測量600 nm條件下的吸光度；如發(fā)酵過程中使用了Ca（OH）2中和劑，可取1 mL發(fā)酵液用3 mol/L鹽酸進行定量稀釋后于600 nm處測吸光度（以同等稀釋的鹽酸為空白對照）。

2）發(fā)酵液中葡萄糖的測定。葡萄糖濃度采用生物傳感器進行檢測。取1 mL發(fā)酵液，離心5 min（4 000 r/min），上清液經(jīng)去離子水稀釋100倍后測定。用 1 g/L的葡萄糖標樣對傳感器進行定標后即可測定。

3）發(fā)酵液中乳酸及有機酸副產(chǎn)物乙酸、琥珀酸的測定。取1 mL發(fā)酵液經(jīng)過9 mL 2%的H2SO4處理，充分反應后經(jīng)10 000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)0.22 μm微濾膜過濾處理后，用液相色譜法測定乳酸及副產(chǎn)物乙酸和琥珀酸。液相色譜條件依照文獻[10]所描述的方法。

4）D-乳酸光學純度的測定。參照文獻[10]中的檢測方法檢測L-乳酸和D-乳酸含量及光學純度。

2 結果與分析

2.1 LHY02耐乳酸鹽馴化的結果

大腸桿菌發(fā)酵D-乳酸的產(chǎn)量、轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強度往往受到如下幾個方面的影響：①大多乳酸發(fā)酵過程中容易產(chǎn)生有機酸副產(chǎn)物（如乙酸、琥珀酸），影響了產(chǎn)量和光學純度[11]；②在乳酸發(fā)酵中，代謝產(chǎn)物積累到一定濃度也會抑制菌體的生長，表明乳酸根是抑制菌體生長的主要代謝產(chǎn)物，當乳酸達到一定濃度時，就對菌體生長產(chǎn)生抑制作用[12]。

為了解決大腸桿菌發(fā)酵D-乳酸中面臨的這些問題，研究者們從菌種的構建和馴化等方面著手研究，并取得了一定的成效。由于大腸桿菌遺傳背景清晰，因此借助于基因敲除技術，阻斷雜酸代謝途徑，使主產(chǎn)物D-乳酸的產(chǎn)量有了較大的提升，同時還大大提高了D-乳酸產(chǎn)物的化學純度及光學純度，目前已成功構建一批大腸桿菌工程菌用于D-乳酸的發(fā)酵[6，7，13]。本實驗室前期以大腸桿菌B為出發(fā)菌株，通過染色體基因敲除技術結合無氧啟動子融合表達技術，使菌株能夠在微氧條件下良好生長，從而能促進乳酸產(chǎn)量提高。所構建的菌株LHY02表現(xiàn)出良好的D-乳酸發(fā)酵性能[8]。但是，從前期的研究中意識到，隨著乳酸產(chǎn)物在發(fā)酵過程中的不斷增加，產(chǎn)物乳酸根對發(fā)酵的抑制現(xiàn)象將會更明顯[11]。

面對這個問題，首先采用了馴化手段來進一步提高大腸桿菌工程菌對乳酸的發(fā)酵能力。馴化是提高微生物對不良環(huán)境因子耐受性的一種重要手段，已有研究表明，產(chǎn)乳酸菌經(jīng)過馴化，菌株對產(chǎn)物乳酸的耐受性顯著提高，經(jīng)過馴化的菌株生物量提升了18%[14]。

因此在大腸桿菌傳代時，逐步提高乳酸鈉的含量，來改善大腸桿菌LHY02對乳酸根的耐受性。從表1的結果來看，經(jīng)過22代馴化后得到的菌株LHY201，其在12%乳酸鹽條件下培養(yǎng)所得OD600 nm為0.37，較馴化前數(shù)值有較大的降低。但相對一些在乳酸根含量超過10%就完全不能生長的產(chǎn)乳酸的菌株[15]，LHY201仍表現(xiàn)出較好的生長性能。

2.2 馴化后菌株分批發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸的效果

為了進一步考察乳酸根對菌株的馴化效果，以馴化前的菌株LHY02為對照，考察了LHY201在含16%高濃度葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中的發(fā)酵效果。發(fā)酵罐中菌體生長情況見圖1。由圖1可知，菌株LHY02和LHY201最大OD600 nm分別達到2.84和5.04。經(jīng)過馴化，菌體OD600 nm提高了77.5%，表明馴化后菌株LHY201在發(fā)酵時擁有較好的生長性能。

乳酸的產(chǎn)量與發(fā)酵菌體的生長有著密切的關系[15]。馴化后的生物量提高，會反映到產(chǎn)物生成和底物的消耗上。從圖1可以發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵到56 h， LHY201乳酸產(chǎn)量達到138.1 g/L，相對于出發(fā)菌株LHY02產(chǎn)量（101.0 g/L）提高了36.7%。同時葡萄糖的消耗也隨之增加，殘?zhí)橇恳灿兴档?，馴化前菌株發(fā)酵殘?zhí)菫?1.2 g/L，馴化后的菌株發(fā)酵時殘?zhí)墙禐?3.3 g/L。

為了進一步驗證LHY201的發(fā)酵性能，對其在不同濃度的葡萄糖（8%、16%、20%）條件下進行了分批發(fā)酵（表2）。LHY201利用8%的葡萄糖進行發(fā)酵，糖酸轉(zhuǎn)化率達98.3%，發(fā)酵在26 h結束，未檢測到殘?zhí)?。初糖濃度提高?6%時，由于添加Ca（OH）2的原因，發(fā)酵液終體積達到3.51 L，測得乳酸118.0 g/L，按稀釋率換算乳酸產(chǎn)量138.1 g/L；葡萄糖濃度進一步提高到20%時，發(fā)酵液體積達到3.62 L，測得乳酸為127.0 g/L，按稀釋率最終換算得乳酸產(chǎn)量為153.3 g/L。相比8%的初糖，葡萄糖提高到16%和20%時，乳酸產(chǎn)量明顯增加，但是糖酸轉(zhuǎn)化率有所下降，分別為86.4%和77.4%，發(fā)酵周期長且均有一定量的殘?zhí)钱a(chǎn)生。

2.3 馴化后的菌株LHY201的補料分批發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸

進一步提高大腸桿菌D-乳酸發(fā)酵產(chǎn)量，需要高濃度的葡萄糖原料，但是，發(fā)酵過程中，高濃度的葡萄糖會產(chǎn)生阻遏效應，使菌體無法利用碳源而導致發(fā)酵停滯[16]。同時，高濃度的葡萄糖會導致發(fā)酵液滲透壓過高而影響菌體生長，如在培養(yǎng)基中一次性添加10%的葡萄糖，就發(fā)現(xiàn)菌體的生長和乳酸發(fā)酵能力受到明顯地抑制[9]。

補料發(fā)酵能部分解除葡萄糖阻遏效應，更是一種常用的提高微生物發(fā)酵產(chǎn)量及生產(chǎn)強度的手段[17]。目前D-乳酸發(fā)酵產(chǎn)量較高的報道中，幾乎都采用了補料發(fā)酵的辦法。如芽孢乳桿菌Sporolactobacillus sp. CASD經(jīng)過發(fā)酵花生粕，D-乳酸產(chǎn)量高達207 g/L[2]，研究者探索了多次補料和單次補料產(chǎn)D-乳酸效果，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過程中多次補料相對于單次補料，D-乳酸產(chǎn)量和生產(chǎn)強度較高而糖酸轉(zhuǎn)化率較低；同樣經(jīng)過工程改造的嗜堿芽孢桿菌發(fā)酵D-乳酸時，其主要補料方式為加入8%的葡萄糖作為底糖，然后當發(fā)酵液殘?zhí)堑陀?0 g/L時流加高濃度的葡萄糖，產(chǎn)量可達143.99 g/L且生產(chǎn)強度可達3.04 g/L/h[4]。課題組前期構建的大腸桿菌工程菌在6 t的發(fā)酵規(guī)模下，采用中途一次補料的方式（8%的葡萄糖作為底糖，補加5%的葡萄糖），能產(chǎn)126 g/L D-乳酸，生產(chǎn)強度高達6 g/L/h[1]。

在馴化菌株的基礎上，嘗試用補料分批發(fā)酵的方法來進一步提高乳酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率，并對分批發(fā)酵及補料分批發(fā)酵進行了對比。補料發(fā)酵中采用較低的初糖濃度（80 g/L），菌體能很快適應環(huán)境，提前進入產(chǎn)酸期；發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛认陆抵?0 g/L左右時進行補加葡萄糖。具體補加葡萄糖方式為：8%+8%和8%+8%+4%。

采用8%+8%的葡萄糖添加方式進行發(fā)酵（圖2），發(fā)酵到24 h還剩殘?zhí)?.21 g/L，此時補加葡萄糖80 g/L。發(fā)酵到38 h葡萄糖完全耗盡，最終發(fā)酵液體積達3.97 L，此時測得乳酸產(chǎn)量為115.3 g/L，折算稀釋率，換算得乳酸最終產(chǎn)量為152.6 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率達95.4%，生產(chǎn)強度4.02 g/L/h。從圖2中還可以看到發(fā)酵副產(chǎn)物琥珀酸和乙酸分別為1.49 g/L、3.06 g/L，含量相對較小。

采用8%+8%+4%的葡萄糖添加方式（圖3），分兩次補加葡萄糖，整個發(fā)酵過程歷時48 h，糖酸轉(zhuǎn)化率為93.8%，導致的發(fā)酵液最終體積達到4.35 L，測得乳酸產(chǎn)量為128.1 g/L，根據(jù)稀釋率換算得乳酸最終產(chǎn)量為185.7 g/L。發(fā)酵副產(chǎn)物乙酸和琥珀酸分別為5.41 g/L和3.76 g/L。

從表3可以看出，相比分批發(fā)酵，補料分批發(fā)酵縮短了發(fā)酵時間，發(fā)酵結束后未檢測到殘?zhí)?。采用補料方式為8%+8%進行葡萄糖補料發(fā)酵，發(fā)酵38 h，產(chǎn)乳酸152.6 g/L，相比一次性添加16%的葡萄糖，乳酸產(chǎn)量提高了10.5%，發(fā)酵周期縮短了18 h，糖酸轉(zhuǎn)化率增加了10.4%。采用補料方式為8%+8%+4%進行葡萄糖補料發(fā)酵，乳酸產(chǎn)量為185.7 g/L，相比一次性添加20%葡萄糖的分批發(fā)酵，乳酸產(chǎn)量提高了21.1%，發(fā)酵周期縮短了一半，糖酸轉(zhuǎn)化率增加了21.2%?？梢姡ㄟ^補料發(fā)酵不但D-乳酸發(fā)酵產(chǎn)量提高，還可解決分批發(fā)酵中殘?zhí)嵌嗉疤撬徂D(zhuǎn)化率不高的問題。

3 小結

經(jīng)過高含量（12%）乳酸鈉的馴化，可獲得對乳酸鹽有較好耐性的菌株（LHY201），其生物量相對于出發(fā)菌株（LHY02）提高了77.5%。作為生長與產(chǎn)物合成同步的發(fā)酵類型，馴化菌株LHY201表現(xiàn)出了較好產(chǎn)D-乳酸性能。利用16%葡萄糖進行分批發(fā)酵時，乳酸產(chǎn)量達到138.1 g/L，相對于出發(fā)菌株LHY02產(chǎn)量提高了36.7%。

相比分批發(fā)酵，補料分批發(fā)酵大大縮短了發(fā)酵時間，且D-乳酸發(fā)酵產(chǎn)量、生產(chǎn)強度及糖酸轉(zhuǎn)化率都相應提高。采用補料方式為8%+8%進行葡萄糖補料發(fā)酵，發(fā)酵38 h，產(chǎn)乳酸152.6 g/L，相比一次性添加16%的葡萄糖，乳酸產(chǎn)量提高了10.5%，發(fā)酵周期縮短了18 h，糖酸轉(zhuǎn)化率增加了10.4%。采用補料方式為8%+8%+4%進行葡萄糖補料發(fā)酵，乳酸產(chǎn)量為185.7 g/L，相比一次性添加20%葡萄糖的分批發(fā)酵，乳酸產(chǎn)量提高了21.1%，發(fā)酵周期縮短了一半，糖酸轉(zhuǎn)化率增加了21.2%。

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