油菜莖基潰瘍病菌與黑脛病菌菌絲的生長動態(tài)

葉蕓++張建坤++王琴++徐雪++王振華

摘要：比較了油菜莖基潰瘍病菌（Leptosphaeria maculans）和油菜黑脛病菌（L. biglobosa）在不同培養(yǎng)溫度和2種培養(yǎng)基上的菌絲生長動態(tài)。結果表明，在PDA和V8培養(yǎng)基平板上都生長良好，油菜莖基潰瘍病菌培養(yǎng)溫度在28 ℃時，油菜黑脛病菌培養(yǎng)溫度在25 ℃或28 ℃時，在PDA平板上菌絲生長最好；油菜黑脛病菌與油菜莖基潰瘍病菌菌落生長速度相比，在最適培養(yǎng)溫度（25 ℃或28 ℃）和相同的培養(yǎng)時間 （21 d）內，二者在PDA平板上的菌落生長速度分別為5～7 mm/d和2.0 mm/d，前者的菌落直徑約90 mm，是后者的2倍。因此，在溫度為25 ℃或28 ℃的條件下，PDA培養(yǎng)基最適合這2種病菌的生長。

關鍵詞：油菜莖基潰瘍病菌（Leptosphaeria maculans）；油菜黑脛病菌（L. biglobosa）；菌絲生長

中圖分類號：S435.654 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）18-4708-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.18.021

油菜莖基潰瘍病菌（Leptosphaeria maculans）和油菜黑脛病菌（L. biglobosa）均為莖點霉屬真菌，可引起油菜嚴重的病害[1-6]。由于頻繁的油菜國際間貿易，黑脛病原菌目前已擴散到世界多數(shù)油菜生產國，導致病害的發(fā)生。油菜的子葉、真葉、莖稈、根以及莢果等都有可能被黑脛病原菌侵染，其中以葉片和莖基部的感染癥狀最為常見[6]。油菜莖基潰瘍病菌可在十字花科植物上廣泛傳播，在葉片和莖稈上形成典型的莖點病斑，繼而在主莖及分枝上形成黑色的條狀莖腐病斑，造成幼苗或成株死亡，導致菜子產量和品質的下降[4，7]。現(xiàn)已成為世界性的重要病害。為此，本試驗對這2種病菌在不同培養(yǎng)平板上的培養(yǎng)特征進行了研究，以便找到快速培養(yǎng)這2種病菌的方法[2，5]。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

本試驗所用油菜黑脛病菌XGL-1、SS-13（根）、10ZJ-1（莖）、SYL-2B（葉）菌株為華中農業(yè)大學李國慶教授所提供。油菜莖基潰瘍病菌的陽性對照分離物為湖北出入境檢驗檢疫局收藏的標準菌株ATCC 60737。

1.2 菌株的分離純化

將菌株ATCC 60737、XGL-1、SS-13（根）、10ZJ-1（莖）、SYL-2B（葉）直徑5 mm的菌絲碟片接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基平板中央，于25 ℃培養(yǎng)，10～15 d后挑取其產生的分生孢子器，在20 ℃下進行純化培養(yǎng)，觀察菌絲的生長狀況。

1.3 油菜黑脛病菌最適生長溫度的篩選

在活化14 d的SS-13（根）、10ZJ-1（莖）、SYL-2B（葉）的PDA培養(yǎng)基平板邊緣取直徑5 mm的菌絲碟片，分別接種于PDA培養(yǎng)基平板中進行不同溫度的恒溫黑暗培養(yǎng)。試驗設置5個溫度梯度，4、10、15、25、30 ℃，每個溫度每種菌株5皿，每3～5 d觀察記錄菌絲的生長狀況，取平均值。

1.4 兩種病菌生長速度比較

在活化14 d的ATCC 60737、XGL-1的PDA培養(yǎng)基平板邊緣取直徑5 mm的菌絲碟片，分別接種于PDA和V8培養(yǎng)基平板中進行不同溫度的恒溫黑暗培養(yǎng)。試驗設置4個溫度梯度15、20、25、28 ℃，每個溫度每種菌株5皿，每3～5 d觀察記錄菌絲的生長狀況，取平均值。

2 結果與分析

2.1 油菜黑脛病菌最適生長溫度篩選

不同油菜植株部位分離的油菜黑脛病菌菌株SS-13（根）、10ZJ-1（莖）、SYL-2B（葉）在5個溫度（4、10、15、25、30 ℃）、黑暗、PDA平板上的菌絲生長速度見圖1。由圖1可知，最適生長溫度為25 ℃，菌落擴展速度約為5.0 mm/d。同種培養(yǎng)條件下，分離自根部的菌株（SS-13）菌絲生長最快，但各菌株的菌落擴展速度無明顯差異。結果表明，油菜黑脛病菌不同部位分離的菌株在油菜生長期均可侵染，該病菌在離體條件下生長較快，培養(yǎng)初期產生絨毛狀白色菌絲，呈直線式生長，產生很少短的分枝，菌落規(guī)則，分生孢子器主要形成于菌落中央，菌絲的氣生部分形成黃色或褐色液體小滴，在PDA培養(yǎng)基上釋放深棕色色素。

2.2 油菜莖基潰瘍病菌ATCC 60737在不同培養(yǎng)基上的生長速度

油菜莖基潰瘍病菌在4個不同溫度下黑暗培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，該病菌在PDA和V8平板上生長良好，生長速度較穩(wěn)定，在平板上釋放黑色色素，形成白色平坦菌落，氣生菌絲短小，有較多的分支菌絲，形成分生孢子器相對較少。當溫度為25 ℃時，該病菌的菌落在PDA平板上擴展速度約為1.8 mm/d，在V8平板上約為1.4 mm/d；當溫度為28 ℃時，該菌落在PDA平板上擴展速度增加至2.0 mm/d，在V8平板上擴展速度增加至1.8 mm/d。因此，油菜莖基潰瘍病菌的最適生長溫度為28 ℃，最適培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基（圖2）。

2.3 油菜黑脛病菌XGL-1在不同培養(yǎng)基上的生長速度

油菜黑脛病菌在PDA和V8平板上均能生長，但在相同時間和相同培養(yǎng)溫度下菌落在PDA平板上擴展速度大于在V8平板上的擴展速度。18 d后PDA平板上的菌落直徑最大，21 d后V8平板上的菌落直徑達到最大。XGL-1在PDA平板上菌落的擴展速度約為5～7 mm/d，在V8平板上菌落的擴展速度約為3.5～4.5 mm/d。XGL-1在V8平板上的生長速率小，氣生菌絲更發(fā)達，菌絲擴展不均勻，菌落形狀不規(guī)則，菌絲的氣生部分形成淡棕色油狀液滴，菌絲在平板中部集中生長，生長后期V8培養(yǎng)基顏色呈黑褐色（圖3）。

2.4 兩種病菌在最適溫度的PDA培養(yǎng)基上的擴展速度比較

油菜黑脛病最適生長溫度為25 ℃和28 ℃，油菜莖基潰瘍病菌最適生長溫度為28 ℃，培養(yǎng)基均為PDA培養(yǎng)基。在培養(yǎng)溫度為25 ℃或28 ℃時，相同培養(yǎng)時間下油菜黑脛病菌菌落的生長速度遠大于油菜莖基潰瘍病菌，培養(yǎng)18 d后，油菜黑脛病菌的菌落直徑達到最大，近90 mm，而油菜莖基潰瘍病菌菌落直徑不足其一半（圖4）。

3 小結與討論

油菜莖基潰瘍病菌對油菜表現(xiàn)為強致病性，在離體條件下生長相對緩慢，培養(yǎng)物表面呈暗灰色；油菜黑脛病菌對油菜表現(xiàn)為弱致病性，在離體條件下生長較快，產生絨毛狀白色菌絲，呈直線式生長，很少產生短的分枝，菌落規(guī)則，分生孢子器主要形成于菌落中央，可產生大量子座和孢子，菌絲的氣生部分形成黃色或褐色液體小滴，在PDA培養(yǎng)基上釋放深棕色色素。在顯微鏡下可觀察到XGL-1的孢子呈長梭形，兩端各有一個油滴狀的透明物。油菜莖基潰瘍病菌菌落邊緣不整齊、有結節(jié)狀顆粒點，氣生菌絲白色、多而致密，分枝較多，有分隔，分生孢子器球形至扁球形，褐色至深黑褐色，散生、埋生或半埋生于菌絲中，分生孢子無色透明，橢圓形至紡錘形，兩端常見各1個油球，培養(yǎng)物表面有黑色色素生成。

油菜黑脛病菌和油菜莖基潰瘍病菌在PDA或V8培養(yǎng)基上均可生長良好，但生長速度相差明顯。油菜黑脛病菌的最適生長溫度為25和28 ℃，在PDA培養(yǎng)基上菌落生長速度為5～7 mm/d；油菜莖基潰瘍病菌的最適生長溫度為28 ℃，在PDA培養(yǎng)基上菌落生長速度為2.0 mm/d。

油菜莖基潰瘍病菌和黑脛病菌的試驗表明，在湖北省內油菜黑脛病菌可能廣泛存在，應引起有關部門的重視，加強油菜黑脛病的防治力度，避免油菜黑脛病的大發(fā)生[3]。油菜莖基潰瘍病菌ATCC 60737的培養(yǎng)溫度與油菜黑脛病菌XGL-1基本一致。因此，作為檢疫性的病原菌，如果傳入中國，其定殖、病害發(fā)生與流行就具有理論上的可能性。

參考文獻：

[1] WILLIAMS R H，F(xiàn)ITT B D L. Differentiating A and B groups of Leptosphaeria maculans，causal agent of stem canker （blackleg） of oilseed rape[J].Plant Pathology，1999，48（2）：161-175.

[2] 王振華，趙 暉，宋 祺，等.加拿大進境油菜籽加工過程中油菜莖基潰瘍病菌的檢測與鑒定[J].植物檢疫，2010，24（6）：25-26.

[3] 王振華，楊 武，趙 暉，等.加拿大進境油菜籽莖基潰瘍病菌的檢測與鑒定[J].華中農業(yè)大學學報，2011，30（1）：66-69.

[4] SIVASITHAMPARAM K，BARBETTI M J，LI H. Recurring challenges from a necrotrophic fungal plant pathogen：A case study with Leptosphaeria maculans（causal agent of blackleg disease in brassicas） in Western Australia[J].Ann Bot，2005，96（3）：363-377.

[5] MORENO-RICO O，F(xiàn)RIAS-TREVI？譙O A G，LUNA-RUIZ J J，et al. Characterization and pathogenicity of isolates of Leptosphaeria maculans from Aguascalientes and Zacatecas，Mexico[J].Can J Plant Pathol，2001，23（3）：270-278.

[6] FITT B D L，BRUN H，BARBETTI M J，et al. World-wide importance of phoma stem canker（Leptosphaeria maculans and L. biglobosa） on oilseed rape（Brassica napus）[J].European Journal of Plant Pathology，2006，114（1）：3-15.

[7] SPRAGUE S J，WATT M，KIRKEGAARD J A，et al. Pathways of infection of Brassica napus roots by Leptosphaeria maculans[J].New Phytologist，2007，176（1）：211-222.