針刀松解法對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎兔軟骨基質(zhì)金屬蛋白酶-3和Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)的影響

肖紅

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針刀松解法對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎兔軟骨基質(zhì)金屬蛋白酶-3和Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)的影響

肖紅

(石家莊市第一醫(yī)院,石家莊 050011)

目的 觀察針刀松解法對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎(KOA)兔軟骨基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-3)和Ⅱ型膠原(Col-Ⅱ)的影響,探討針刀治療KOA的機(jī)制。方法 將40只清潔級(jí)6月齡健康新西蘭兔隨機(jī)取10只為空白組,剩余30只統(tǒng)一造模,關(guān)節(jié)制動(dòng)方法制造KOA模型,造模成功后將30只兔隨機(jī)分為模型組、針刀組和電針組,每組10只。針刀組以膝關(guān)節(jié)內(nèi)外側(cè)副韌帶及髕韌帶為松解對(duì)象,以縱疏、橫剝法進(jìn)行針刀松解,每星期1次,共治療3次;電針組取陰陵泉、陽陵泉、內(nèi)膝眼、犢鼻穴,電針頻率2～100 Hz,強(qiáng)度為3 mA,每次電針20 min,每星期治療3次,共治療3星期。光鏡觀察軟骨形態(tài)改變,Western blot法檢測(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨Col-Ⅱ、MMP-3蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 HE染色模型組家兔膝關(guān)節(jié)滑膜存在不同程度增生、水腫,光鏡下見模型組關(guān)節(jié)軟骨呈明顯退行性變。電針組和針刀組軟骨組織損傷減輕,且有修復(fù)趨勢(shì)。針刀組兔膝關(guān)節(jié)軟骨破壞程度明顯減輕。針刀組Col-Ⅱ蛋白表達(dá)較模型組明顯升高(＜0.01);針刀組Col-Ⅱ蛋白表達(dá)與電針組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05);模型組Col-Ⅱ蛋白表達(dá)水平降低,與其他各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。模型組MMP-3蛋白表達(dá)較空白組明顯升高 (＜0.01);針刀組MMP-3蛋白表達(dá)較空白組降低,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05);針刀組MMP-3蛋白表達(dá)與模型組和電針組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01,＜0.05)。結(jié)論 針刀松解治療KOA兔,能夠使軟骨MMP-3水平下降,Col-Ⅱ表達(dá)水平升高,從而阻抑軟骨退變,起到治療作用。

針刺療法;小針刀;電針;骨關(guān)節(jié)炎,膝關(guān)節(jié);兔;基質(zhì)金屬蛋白酶-3;二型膠原

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是一種退行性骨關(guān)節(jié)病,為中老年常見病、多發(fā)病。膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis, KOA)由于膝關(guān)節(jié)負(fù)重量與活動(dòng)量較大,因此也是OA最常見的一種,一般保守治療較難治愈,且易復(fù)發(fā)。KOA以關(guān)節(jié)軟骨退行性改變甚至消失為主要病理特征[1]。目前OA的病因尚不明確,但具有相似的生物學(xué)、形態(tài)學(xué)和臨床特征。隨著老齡化社會(huì)的到來,OA患者數(shù)量將逐漸升高。骨關(guān)節(jié)炎危害較大,一直是骨科科學(xué)研究的重要課題。雖然在OA的早期治療和抑制其發(fā)展方向的投入較大,但在過去20年里,藥物治療方面并未取得長(zhǎng)足的進(jìn)步[2]。

針刀作為一種中醫(yī)學(xué)新的微創(chuàng)技術(shù),在KOA的治療方面取得了較好的療效,但基礎(chǔ)研究尚待深入。本研究試圖通過觀察實(shí)驗(yàn)過程中軟骨Col-Ⅱ、MMP-3蛋白表達(dá)情況來探討針刀治療KOA的可能機(jī)制,為臨床治療KOA提供理論依據(jù),現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康清潔級(jí)6月齡新西蘭兔40只,雌雄各半,體重為(2.25±0.25)kg。由北京市昌平區(qū)金牧陽實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司提供(動(dòng)物合格證號(hào)SCXK京2010- 0001),實(shí)驗(yàn)期間單籠飼養(yǎng)。取10只為空白組,剩余30只統(tǒng)一造模,在造模6星期后,隨機(jī)分為模型組、電針組和針刀組,每組10只。實(shí)驗(yàn)室室溫恒定,為23℃～25℃,濕度為60%,紫外線定期消毒。動(dòng)物自由攝食飲水,采用標(biāo)準(zhǔn)飼料。

1.2 試劑與儀器

固定樹脂繃帶(15 cm×180 cm,珠海麗珠醫(yī)用生物材料有限公司);針刀(0.40 mm×40 mm,北京卓越華友醫(yī)療器械有限公司);環(huán)球牌毫針(0.20 mm×13 mm,蘇州針灸用品有限公司);HANS穴位神經(jīng)刺激儀(LH 202H型,北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司)。

乙醇(北京民生藥業(yè)有限公司);蘇木素伊紅染色試劑(北京化學(xué)試劑公司);二甲苯(北京北化化學(xué)品有限責(zé)任公司);石蠟(北京化學(xué)試劑公司);ZD-9556水平搖床(江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠);光學(xué)顯微鏡(日本Nikon株式會(huì)社);切片機(jī)(FS/FAS5030石蠟切片機(jī),德國(guó)LETIZ公司),穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.3 造模及模型評(píng)價(jià)

除空白組外,剩余3組動(dòng)物均采用改良后Vidman法[3](即左后肢伸直位固定制動(dòng)法)制備KOA模型。具體方法為,將動(dòng)物牽拉,使其處于完全伸直位,樹脂繃帶經(jīng)65℃～85℃熱水浸泡軟化后,從腹股溝到腳踝予以固定(膝關(guān)節(jié)伸直180°),留出足趾觀察血供,共制動(dòng)6星期。制動(dòng)滿6星期時(shí),從各組動(dòng)物中隨機(jī)抽取2只拍攝X線片,結(jié)合影像學(xué)、形態(tài)學(xué)及行為學(xué)測(cè)評(píng)結(jié)果,示造模成功后,將所有動(dòng)物樹脂固定拆除。在整個(gè)造模過程中,若出現(xiàn)足底潰爛、足底咬傷、骨折、皮膚感染、腹瀉等情況,均予以剔除。

1.4 治療方法

針刀組造模1星期后,以兔膝關(guān)節(jié)的內(nèi)、外側(cè)副韌帶及髕韌帶為進(jìn)針刀點(diǎn)。先用龍膽紫定位,備皮消毒后,再刺入針刀,內(nèi)、外側(cè)副韌帶操作時(shí),于韌帶中點(diǎn)前緣進(jìn)針刀,刀口線與韌帶走向平行,刀體垂直皮膚刺入后,向韌帶起、止點(diǎn)方向松解；髕韌帶操作時(shí),刀口線與髕韌帶走向平行,刀體垂直髕韌帶皮膚剌入后,由上而下松解。以上進(jìn)針刀部位,分別施以縱疏橫剝離等手法進(jìn)行操作,出針刀后加壓片刻。1星期治療1次,共治療3星期。

電針組取陽陵泉、陰陵泉、內(nèi)膝眼、犢鼻。以韓氏電針儀行電針刺激治療。強(qiáng)度為3 mA,頻率為2～100 Hz,采用疏密波形,每次20 min。隔日治療1次,每星期治療3次,共治療3星期。

空白組正常飼養(yǎng),不做任何干預(yù)。

模型組造模后正常飼養(yǎng),不做任何干預(yù)。

1.5 取材及指標(biāo)檢測(cè)

所有動(dòng)物在治療結(jié)束1星期后,采用空氣栓塞法處死并進(jìn)行取材。超凈工作臺(tái)上,用手術(shù)刀快速切取股骨外側(cè)髁2 cm×2 cm大小的新鮮軟骨,一部分標(biāo)本立即投入10%福爾馬林溶液中固定1星期,先用5%硝酸溶液脫鈣,約15 d后取矢狀面,常規(guī)步驟處理后石蠟包埋,切片,片厚約5mm,HE染色后光鏡下觀察。另一部分標(biāo)本置于塑料試管內(nèi),封蓋,﹣80℃冷凍,用于Western blot檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。先進(jìn)行正態(tài)性與方差齊性檢驗(yàn),滿足條件的組間比較采用單因素方差分析(-)。以＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 關(guān)節(jié)軟骨光鏡觀察結(jié)果

由圖1可見,空白組膝關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)正常,軟骨表面光滑,厚度正常,軟骨細(xì)胞排列整齊有序,分層清楚,軟骨基質(zhì)均勻,潮線較清晰完整。模型組關(guān)節(jié)軟骨層表面不光滑,完整性破壞,厚薄不一,有的可見軟骨層裂隙,部分軟骨基質(zhì)溶解水腫,軟骨細(xì)胞部分壞死,細(xì)胞排列紊亂,軟骨下骨裸露,潮線多扭曲不完整,部分區(qū)域可見重復(fù)潮線。針刀組結(jié)構(gòu)基本正常,血管數(shù)量增加,但細(xì)胞排列仍見局部紊亂,軟骨表層輕度破壞,偶見重復(fù)潮線,無血管翳形成。電針組軟骨表層細(xì)胞壞死、剝脫,深層軟骨細(xì)胞壞死消失,潮線結(jié)構(gòu)清晰,其下尚可見正常的軟骨細(xì)胞,無血管翳形成?？瞻捉M軟骨表面光滑,結(jié)構(gòu)清晰完整;模型組軟骨表面不光滑,結(jié)構(gòu)不完整,細(xì)胞排列紊亂,潮線扭曲或見雙重潮線;針刀組軟骨表層較光滑,結(jié)構(gòu)輕度破壞,細(xì)胞排列局部紊亂;電針組軟骨表層不完整,細(xì)胞排列輕度紊亂,無血管翳生成。

圖1 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨HE染色光鏡觀察情況

2.2 針刀松解法對(duì)軟骨Col-Ⅱ蛋白含量表達(dá)的影響

由表1、圖2及圖3可見,模型組Col-Ⅱ蛋白表達(dá)較空白組明顯降低,兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (＜0.01);針刀組較空白組降低,兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01);針刀組較模型組明顯升高,兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01);電針組較空白組明顯升高,兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05);電針組Col-Ⅱ蛋白表達(dá)與模型組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05);針刀組Col-Ⅱ蛋白表達(dá)與電針組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。

表1 各組軟骨Col-Ⅱ蛋白表達(dá)水平比較 (±s)

表1 各組軟骨Col-Ⅱ蛋白表達(dá)水平比較 (±s)

組別nCol-Ⅱ蛋白表達(dá)量 空白組60.78±0.11 模型組60.31±0.071) 針刀組60.57±0.071)2) 電針組60.46±0.091)2)3)

注:與空白組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01;與針刀組比較3)＜0.05

圖2 各組軟骨Col-Ⅱ蛋白表達(dá)水平比較直方圖

圖3 各組軟骨Col-Ⅱ蛋白Western blot表達(dá)

2.3 針刀松解法對(duì)軟骨MMP-3蛋白的含量表達(dá)的影響

由表2、圖4及圖5可見,模型組MMP-3蛋白表達(dá)較空白組明顯升高,兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (＜0.01);針刀組較空白組降低,但兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05);針刀組較模型組明顯降低,兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01);電針組較空白組明顯升高,兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01);電針組MMP-3蛋白表達(dá)與模型組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05);針刀組MMP-3蛋白表達(dá)與電針組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。

表2 各組軟骨MMP-3蛋白表達(dá)水平比較 (±s)

表2 各組軟骨MMP-3蛋白表達(dá)水平比較 (±s)

組別n蛋白表達(dá)量 空白組60.54±0.11 模型組61.17±0.211) 針刀組60.64±0.061)2) 電針組60.89±0.141)2)3)

注:與空白組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01;與針刀組比較3)＜0.05

圖4 各組軟骨MMP-3蛋白表達(dá)水平比較直方圖

圖5 各組軟骨MMP-3蛋白Western blot

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎是一種常見于中老年人的慢性、進(jìn)展性關(guān)節(jié)疾病,其最典型的病理特征是關(guān)節(jié)軟骨破壞[4]。關(guān)節(jié)軟骨是由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成的。膠原是關(guān)節(jié)軟骨的主要成分和張力的決定性因素,關(guān)節(jié)軟骨含Ⅱ、Ⅵ、Ⅸ、Ⅹ和Ⅺ型膠原等成分,其中Ⅱ型膠原是軟骨的主要結(jié)構(gòu)成分[5]。OA的特征是關(guān)節(jié)軟骨的廣泛降解,在分子水平上表現(xiàn)為Ⅱ型膠原的斷裂,蛋白多糖的丟失[6]。

盡管KOA發(fā)病機(jī)制不明,病因復(fù)雜。近年來研究[7-8]發(fā)現(xiàn),OA關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)合成與降解失衡是軟骨變性的重要因素,軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的丟失是導(dǎo)致OA與其他炎性關(guān)節(jié)炎的共同特征。在OA中,合成和分解活動(dòng)平衡的改變,導(dǎo)致軟骨基質(zhì)成分丟失,關(guān)節(jié)軟骨組成結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生特異性改變[9]。目前認(rèn)為,基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)在OA的發(fā)病中起到主要的作用[10],多種基質(zhì)金屬蛋白酶對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)有降解作用,使關(guān)節(jié)軟骨腫脹,最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性破壞,基質(zhì)Ⅱ型膠原纖維裂解,導(dǎo)致OA形成[11]。MMPs能降解幾乎所有的軟骨細(xì)胞外基質(zhì),是降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要酶系,在OA發(fā)病過程中起重要作用[12]。MMP-3是MMPs家族中的一員,除了能降解大量的細(xì)胞外基底膜成分外,還能激活明膠酶、膠原酶和多種絲氨酸蛋白酶抑制蛋白,并能激活多種MMPs前體(pro-MMPs),在關(guān)節(jié)軟骨和骨的破壞過程中發(fā)揮著重要作用[13]。MMP-3除對(duì)蛋白多糖有高度的裂解活性外,還激活MMP-1加速膠原的病理性降解[14]。故本研究試圖通過觀察實(shí)驗(yàn)過程中軟骨Col-Ⅱ、MMP-3蛋白表達(dá)情況來探討針刀治療KOA的可能機(jī)制。

吳志宏等[15]實(shí)驗(yàn)研究光鏡下觀察OA Ⅲ～Ⅳ期的特點(diǎn)是關(guān)節(jié)軟骨退變已發(fā)展至關(guān)節(jié)軟骨全層,潮線和鈣化層存在、完整或缺損消失,關(guān)節(jié)軟骨已變薄,軟骨細(xì)胞明顯減少,且大量變性、壞死,這與本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒MHE染色光鏡觀察結(jié)果一致。因此,OA的發(fā)生發(fā)展首先是基質(zhì)中膠原纖維網(wǎng)的破壞和蛋白多糖的丟失,進(jìn)而導(dǎo)致軟骨細(xì)胞的變性和壞死,從軟骨的淺層發(fā)展到深層,最終出現(xiàn)軟骨全層的消失及軟骨下骨增生?；|(zhì)的降解與合成之間的平衡被打破,機(jī)體失去了代償能力,軟骨破壞不可逆。國(guó)外有學(xué)者[16-17]研究發(fā)現(xiàn)基質(zhì)降解后的片段可以進(jìn)一步加速骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)程。Yasuda T等[18]實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)Ⅱ型膠原蛋白的分解片段可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞中MMPs和細(xì)胞因子的表達(dá)增高,進(jìn)而進(jìn)一步促進(jìn)Ⅱ型膠原蛋白降解,類似于一個(gè)反饋環(huán)路。有研究[19]顯示Ⅱ型膠原分解后的片段能與多種整合素受體結(jié)合來調(diào)節(jié)Ⅱ型膠原降解。Ⅱ型膠原分解后的片段可促進(jìn)細(xì)胞因子的增加,并推測(cè)Ⅱ型膠原分解后的片段作用于某些受體,進(jìn)而激活了特殊的蛋白激酶,上調(diào)如1L-1、NO和TNF的表達(dá),導(dǎo)致了軟骨降解的增加。另外,免疫反應(yīng)在OA的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。關(guān)節(jié)軟骨代謝后的產(chǎn)物可以引起免疫反應(yīng),誘導(dǎo)炎癥的產(chǎn)生[20]。

馬春輝等[21]通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在OA的發(fā)病早期,膠原的降解增加,軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)代償性增加,膠原降解與合成之間輕度不平衡尚可代償;OA發(fā)病后期,軟骨組織失去了代償能力,軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)下降,軟骨破壞進(jìn)入不可逆階段。

本實(shí)驗(yàn)造模后,模型組膝關(guān)節(jié)軟骨Col-Ⅱ蛋白表達(dá)較空白組明顯降低,說明在造模6星期時(shí)軟骨膠原纖維合成減少,基質(zhì)中膠原纖維網(wǎng)的破壞,基質(zhì)已發(fā)生降解,也進(jìn)一步從分子生物學(xué)角度驗(yàn)證了造模成功;針刀組Col-Ⅱ蛋白表達(dá)較模型組明顯升高,說明針刀能夠上調(diào)基質(zhì)Col-Ⅱ蛋白表達(dá),對(duì)軟骨有修復(fù)保護(hù)作用。針刀干預(yù)后MMP-3蛋白表達(dá)量與模型組相比降低,進(jìn)而說明針刀可能通過調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)來阻抑軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解,抑制炎癥,抑制軟骨細(xì)胞凋亡,延緩軟骨損傷與關(guān)節(jié)退變,針刀對(duì)KOA的軟骨有保護(hù)和促進(jìn)修復(fù)作用[22-25]。針刀在KOA的治療上具有手術(shù)切開和針灸的雙重作用,可以切開黏連攣縮、瘢痕,通經(jīng)活絡(luò),調(diào)節(jié)代謝,改善局部血運(yùn),因此作用優(yōu)于電針。MMPs的降低,意味著軟骨中蛋白多糖、膠原的降解減少,關(guān)節(jié)軟骨變性減輕,產(chǎn)生治療效果[26]。隨著人口老齡化的進(jìn)程,OA的發(fā)病率越來越高,尋找OA有效的治療措施非常重要,針刀治療KOA效果確切,金屬蛋白酶在OA軟骨的退化過程中起了重要的作用,理解其作用機(jī)理尋找以金屬蛋白酶為靶點(diǎn)的治療方案,進(jìn)而為OA的治療開辟新的途徑。

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Effect of Acupotomy Lysis on the Expressions of Cartilage Matrix Metalloproteinase-3 and Type Ⅱ Collagen in Rabbits with Knee Osteoarthritis

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,050011,

Objective To investigate the effect of acupotomy lysis on the expressions of cartilage matrix metalloproteinase-3 (MMP-3) and type Ⅱcollagen (Col-Ⅱ) in rabbits with knee osteoarthritis (KOA). Methods Of 40 6-month-old healthy New Zealand rabbits of clean grade, 10 were randomly selected as a blank group and the other 30 were used for model making. A KOA model was made by joint immobilization. After successful model making, the 30 rabbits were randomized into model, acupotomy and electroacupuncture groups, 10 rabbits each. The acupotomy group received acupotomy lysis of knee lateral collateral ligaments and patellar ligament by longitudinal loosening and transverse stripping, once a week for a total of three times. The electroacupuncture group was given electroacupuncture at points Yinlingquan, Yanglingquan, media Xiyan and Dubi, at a frequency of 2-100 Hz and an intensity of 3 mA, 20 min thrice a week for a total of three weeks. Morphological changes in the cartilage were observed by optical microscopy. The expressions of Col-Ⅱ and MMP-3 in knee cartilage were determined by Western blotting. Results HE staining showed different degrees of hyperplasia and edema of knee joint synovium in the model group of rabbits. Optical microscopy showed an obvious degenerative change in the articular cartilage in the model group. Injury to the cartilage tissue was reduced and had a tendency to be repaired in the electroacupuncture and acupotomy groups. Knee cartilage destruction was significantly reduced in the acupotomy group of rabbits. Col-Ⅱ expression was higher in the acupotomy group than in the model group (＜0.01). There was a statistically significant difference in Col-Ⅱ expression between the acupotomy and electro- acupuncture groups (＜0.05). Col-Ⅱ expression was low in the model group and there was a statistically significant difference compared with the other groups (＜0.05). MMP-3 expression was significantly higher in the model group than in the blank group (＜0.01). MMP-3 expression was lower in the acupotomy group than in the blank group (＜0.01) but there was no statistically significant difference (＞0.05). There was a statistically significant difference in MMP-3 expression between the acupotomy group and the model or electroacupuncture group (＜0.01,＜0.05). Conclusions Acupotomy lysis can reduce cartilage MMP-3 level and increase Col-Ⅱ expression to prevent cartilage degeneration and produce a therapeutic effect in the treatment of KOA rabbits.

Acupuncture therapy; Small needle knife; Electroacupuncture; Osteoarthritis, knee joint; Rabbits; Matrix metalloproteinase-3; Type Ⅱ collagen

1005-0957(2016)11-1353-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2016.11.1353

2016-05-11

肖紅(1980 - ),女