木耳菜染色體制片優(yōu)化及核型分析

孫 勃， 辜金花， 童袁桃， 張 芬， 湯浩茹

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，四川 成都 611130)

?

木耳菜染色體制片優(yōu)化及核型分析

孫 勃， 辜金花， 童袁桃， 張 芬， 湯浩茹

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，四川 成都 611130)

【目的】?jī)?yōu)化木耳菜Basellaalba染色體制片條件，并了解其核型特征，為今后研究不同類(lèi)型木耳菜的親緣關(guān)系和系統(tǒng)進(jìn)化提供理論基礎(chǔ)?！痉椒ā恳阅径似贩N‘大葉木耳菜’為材料，對(duì)影響染色體制片效果的取材部位、預(yù)處理時(shí)間和解離時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)行核型分析。【結(jié)果】木耳菜主根根尖的分裂相細(xì)胞和中期分裂相細(xì)胞比例最多； 0.002 mol·L-1的8-羥基喹啉預(yù)處理6 h，木耳菜染色體收縮性最好，形態(tài)最佳，分散性好；在60 ℃下1 mol·L-1的HCl解離8 min，木耳菜染色體著色良好且細(xì)胞質(zhì)透明，對(duì)比度高。木耳菜的核型公式為2n=2x=44=38m (2SAT)+6sm，染色體相對(duì)長(zhǎng)度組成為20 M2+22 M1+2 S，染色體長(zhǎng)度比為1.93，染色體相對(duì)長(zhǎng)度變化范圍為3.13%～6.06%，著絲粒指數(shù)變化范圍為35.19%～47.86%，臂比值變化范圍為1.09～1.84，第10、16、17對(duì)染色體為近中部著絲粒染色體，其余均為中部著絲粒染色體，第13對(duì)染色體具有隨體，木耳菜核型不對(duì)稱(chēng)系數(shù)為57.89%，核型按分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)屬1A型。【結(jié)論】明確了木耳菜染色體制片的最佳條件參數(shù)，并從細(xì)胞遺傳學(xué)角度揭示了木耳菜的核型特征。

木耳菜； 染色體制片； 核型； 分裂相細(xì)胞； 中期分裂相細(xì)胞

木耳菜Basellaalba，又稱(chēng)落葵、軟漿葉、豆腐菜等，為落葵科Basellaceae落葵屬Basella，以嫩葉、嫩莖供食用的1年生纏繞性草本植物[1]。因葉子近似圓形，肉質(zhì)肥厚滑嫩，好像木耳的感覺(jué)，所以俗稱(chēng)木耳菜。木耳菜富含胡蘿卜素、維生素C、皂素、膠質(zhì)及鐵、鈣等營(yíng)養(yǎng)元素，長(zhǎng)期食用具有降血壓、滋補(bǔ)肺臟、養(yǎng)血生津等功效[2]。染色體核型分析是細(xì)胞遺傳學(xué)的一項(xiàng)基本技術(shù)，對(duì)預(yù)測(cè)、鑒定種間雜交和多倍體育種的結(jié)果、了解性別遺傳機(jī)理以及基因組數(shù)、物種起源、進(jìn)化和種族關(guān)系的鑒定具有重要參考價(jià)值[3-9]?，F(xiàn)有研究多集中在木耳菜栽培技術(shù)等方面[1,10]，關(guān)于木耳菜的核型研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)以木耳菜典型品種‘大葉木耳菜’為材料，對(duì)其染色體制片關(guān)鍵步驟進(jìn)行條件優(yōu)化，并進(jìn)行核型分析，從細(xì)胞遺傳學(xué)角度揭示木耳菜的核型特征，以期為其系統(tǒng)進(jìn)化研究與遺傳育種提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試木耳菜品種為‘大葉木耳菜’，由重慶奇研種子經(jīng)營(yíng)部提供。

1.2 染色體制片

試驗(yàn)于2015年夏季在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院遺傳育種實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，將木耳菜種子播于穴盤(pán)中，基質(zhì)成分為草炭∶蛭石∶珍珠巖(體積比)=3∶1∶1，放入光照培養(yǎng)箱中25 ℃恒溫培養(yǎng)10 d后，采集木耳菜的子葉、下胚軸和主根根尖，培養(yǎng)15 d后采集芽尖和須根根尖。取材時(shí)間均為上午9:00，之后進(jìn)行預(yù)處理，以確定最優(yōu)取材部位；4 ℃條件下以0.002 mol·L-18-羥基喹啉溶液分別預(yù)處理1、 3、 6、 9、 12 h，以確定最優(yōu)預(yù)處理時(shí)間。將預(yù)處理好的材料置于卡諾固定液[V(冰醋酸)∶V(乙醇)=1∶3], 4 ℃固定24 h，用乙醇溶液梯度(φ為95%、85%和75%)洗脫，保存在φ為75%的乙醇溶液中。解離采用酸解法，將保存好的材料用1 mol·L-1HCl在 60 ℃下分別解離1、 4、 8、 12和16 min，以確定最優(yōu)解離時(shí)間。用蒸餾水清洗3次，切取分生區(qū)組織于載玻片上，卡寶品紅染液染色5～10 min，常規(guī)壓片后鏡檢，將裝片中染色體形態(tài)及分散良好的中期分裂相細(xì)胞在Olympus CX21顯微鏡100倍油鏡下觀察并拍照，并用Image Pro 6.0軟件進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)與測(cè)量等分析, 采用LSD法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較。

1.3 核型分析

選取30個(gè)染色體數(shù)目清晰的中期分裂相細(xì)胞進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，核型分析參照李懋學(xué)等[11]提出的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，確定著絲粒位置，根據(jù)染色體的大小和形態(tài)特征對(duì)染色體核型進(jìn)行配對(duì)分析，染色體的相對(duì)長(zhǎng)度、臂比值及類(lèi)型按照Levan等[12]的命名法則計(jì)算，染色體相對(duì)長(zhǎng)度系數(shù)和著絲粒指數(shù)參照李懋學(xué)等[11]的標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算，核型不對(duì)稱(chēng)系數(shù)采用Arano[13]的方法計(jì)算，核型類(lèi)型按照Stebbins[14]的標(biāo)準(zhǔn)劃分。

2 結(jié)果與分析

2.1 染色體制片的優(yōu)化

2.1.1 取材部位對(duì)分裂相細(xì)胞數(shù)的影響 對(duì)不同取材部位木耳菜分裂相細(xì)胞數(shù)和中期分裂相細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)與統(tǒng)計(jì)。結(jié)果(圖1)表明，不同取材部位分裂相和中期分裂相細(xì)胞比例均存在顯著差異。其中，分裂相細(xì)胞比例最高的是主根根尖，其次是須根根尖、子葉和下胚軸，最低為芽尖。中期分裂相細(xì)胞比例最高的也是主根根尖，達(dá)到4.09%，顯著高于其他部位，最低為下胚軸，僅為0.79%。因此，主根根尖是觀察木耳菜染色體的最佳取材部位，后續(xù)的核型分析采用主根根尖作為取材部位。

2.1.2 預(yù)處理時(shí)間對(duì)制片效果的影響 預(yù)處理時(shí)間對(duì)木耳菜染色體制片效果存在明顯影響。預(yù)處理1 h，染色體固縮程度明顯不足，且拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，染色體聚為一團(tuán)，分散性差(圖2A)；預(yù)處理3 h，染色體分散程度有所改善，但形態(tài)不佳且不清晰，著絲粒不明顯(圖2B)；預(yù)處理6 h，染色體收縮性最好，形態(tài)最佳，均呈現(xiàn)“X”型，著絲粒清晰可見(jiàn)，分散性好(圖2C)；預(yù)處理9 h，染色體分散性好，但部分染色體收縮過(guò)度，染色體長(zhǎng)度差異明顯減少，不適合用于核型分析(圖2D)；預(yù)處理12 h，染色體分散，但大多染色體都收縮過(guò)度呈圓點(diǎn)狀，著絲粒不明顯，只適合染色體計(jì)數(shù)(圖2E)。因此，預(yù)處理6 h的染色體最適合用于木耳菜染色體的核型分析。

圖1 木耳菜不同取材部位的分裂相細(xì)胞和中期分裂相細(xì)胞比例

2.1.3 解離時(shí)間對(duì)制片效果的影響 解離時(shí)間對(duì)木耳菜染色體制片效果也存在明顯影響。在60 ℃下1 mol·L-1HCl解離1～4 min，解離不充分，細(xì)胞壁軟化不夠，組織外部直接接觸染液的細(xì)胞染色體和細(xì)胞質(zhì)均著色很深，對(duì)比度低，內(nèi)部細(xì)胞由于接觸不到染液無(wú)法著色，導(dǎo)致染色體不易觀察和分析(圖2F、2G)；解離8 min，細(xì)胞間較分散，染色體著色良好且細(xì)胞質(zhì)趨于透明，對(duì)比度高，解離效果最佳(圖2H)；解離12 ～16 min，解離程度逐漸過(guò)度，雖然細(xì)胞質(zhì)不易被染色，但細(xì)胞中的染色體也不易著色，從而導(dǎo)致染色體顏色太淺，不利于后續(xù)的觀察和分析(圖2I、2J)。因此，選擇8 min作為后續(xù)試驗(yàn)的解離時(shí)間。

圖2 木耳菜染色體的顯微觀察

2.2 核型分析

選擇30個(gè)染色體分散良好的細(xì)胞觀察計(jì)數(shù)，結(jié)果表明所有細(xì)胞的染色體均為44條，占計(jì)數(shù)細(xì)胞的100%，確定木耳菜的染色體數(shù)目為2n=2x=44。圖2K顯示木耳菜各染色體清晰可見(jiàn)，均呈“X”型，著絲粒明顯， 2條染色體具有隨體。核型分析的結(jié)果見(jiàn)表1，染色體相對(duì)長(zhǎng)度變化范圍為3.13%～6.06%，染色體相對(duì)長(zhǎng)度組成為20 M2+22 M1+2 S，著絲粒指數(shù)變化范圍為35.19%～47.86%，臂比值變化范圍為1.09～1.84，第10、16、17對(duì)染色體為近中部著絲粒染色體(sm)，其余19對(duì)為中部著絲粒染色體(m)，第13對(duì)染色體具有隨體。核型公式為2n=2x=44=38 m(2SAT)+6 sm，染色體長(zhǎng)度比為1.93，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)臂比值大于2的染色體，根據(jù)Stebbins的核型分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，木耳菜的核型屬1A型，核型不對(duì)稱(chēng)系數(shù)為57.89%。核型模式圖見(jiàn)圖2L。

表1 木耳菜染色體核型參數(shù)

圖3 染色體核型模式圖

3 討論

良好的染色體制片是從事核型分析的基礎(chǔ)，染色體制片質(zhì)量受到諸多因素的影響，其中較為關(guān)鍵的影響因素包括取材、預(yù)處理和解離等條件[15]。不同取材部位分裂相和中期分裂相細(xì)胞比例均可能有所差異。顧蔚等[16]分析了華中五味子芽、莖尖、小葉、大葉側(cè)邊和大葉頂端等部位的中期分裂相細(xì)胞數(shù)，結(jié)果表明莖尖中期細(xì)胞比例最高，達(dá)30.0%，其次是小葉(24.5%)、大葉側(cè)邊(18.0%)和大葉頂端(15.8%)，芽的比例最低，僅為5.0%。王小利[17]的研究表明葡萄幼芽和根尖在有絲分裂中期的細(xì)胞數(shù)最多，最適合用于染色體制片，其次是卷須、莖尖和幼葉組織。本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同取材部位中期分裂相細(xì)胞數(shù)比例差異顯著，這與前人研究結(jié)果類(lèi)似[16-17]，其中主根根尖最適合作為木耳菜染色體制片的材料。

預(yù)處理主要通過(guò)處理試劑和處理時(shí)間2個(gè)方面影響制片效果[15]。研究表明常見(jiàn)的預(yù)處理試劑中，8-羥基喹啉能使染色體及縊痕和次縊痕清晰，顯示效果良好[18]；對(duì)二氯苯處理染色體分散較好[18]；秋水仙素能高效地積累中期分裂相[19]。園藝作物中，白菜、甘藍(lán)、青花菜、芥藍(lán)等蔬菜[20-22]以及懸鉤子、樹(shù)莓等果樹(shù)[3]作物均采用0.002 mol·L-18-羥基喹啉進(jìn)行預(yù)處理，因此本試驗(yàn)中也選取0.002 mol·L-18-羥基喹啉為預(yù)處理溶液。不同物種最佳預(yù)處理時(shí)間也有明顯差異。如結(jié)球甘藍(lán)、芥藍(lán)等甘藍(lán)類(lèi)蔬菜最優(yōu)預(yù)處理時(shí)間為2.0～2.5 h[20-22]，懸鉤子為24 h[3]，而本試驗(yàn)結(jié)果表明木耳菜預(yù)處理6 h效果最佳。

解離的主要目的是軟化和分解部分細(xì)胞壁，同時(shí)清除部分細(xì)胞質(zhì)，使細(xì)胞質(zhì)背景透明化，便于染色體觀察[15]。常用解離方法包括酸解法和酶解法。酸解法步驟簡(jiǎn)便、容易掌握[15]，因此本試驗(yàn)采用鹽酸酸解法。楊寧等[19]研究表明，百里香最佳酸解時(shí)間為15 min；酸解5 min，時(shí)間過(guò)短，染色體成團(tuán)狀，且模糊不易分辨；酸解25 min，染色體過(guò)于分散且模糊無(wú)法辨認(rèn)。這與我們的研究結(jié)果基本一致，本研究中木耳菜最佳解離時(shí)間為8 min。

本試驗(yàn)現(xiàn)有結(jié)果尚存在不足，如第13號(hào)染色體的隨體位置還需要進(jìn)一步確認(rèn)，這主要受到現(xiàn)有儀器設(shè)備精度、技術(shù)方法和染色體操作水平等因素限制。隨著試驗(yàn)儀器與方法快速發(fā)展，將在今后的研究中驗(yàn)證其核型結(jié)果。

[1] 王亞靜，徐小洲，秦一統(tǒng)，等. 不同施肥處理對(duì)木耳菜產(chǎn)量及產(chǎn)值的影響[J]. 長(zhǎng)江蔬菜， 2015(14): 65- 66.

[2] 李建芳，豆成林，王榮榮. 不同干燥方式對(duì)木耳菜品質(zhì)特性的影響研究[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā)， 2012, 33(9): 61- 63.

[3] 王小蓉，湯浩茹，段娟，等. 中國(guó)懸鉤子屬空心莓組與木莓組28種和變種的核型比較研究[J]. 植物分類(lèi)學(xué)報(bào)， 2008, 46(4): 505-510.

[4] CHEN Q, WANG Y, NAN H,et al. Meiotic configuration and rDNA distribution patterns in sixRubustaxa[J]. Indian J Genet Pl Br, 2015, 75(2): 242-249.

[5] 高天鵬，王轉(zhuǎn)莉，郭懷清，等. 青藏高原東緣3種風(fēng)毛菊屬植物的核型研究[J]. 草業(yè)學(xué)報(bào)， 2009, 18(2): 169-174.

[6] 鄭加興，張?jiān)滦?，覃寶祥，? 普通野生稻苗期耐冷性QTLs的互作和聚合效應(yīng)分析[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2014, 35(1): 29-36.

[7] 汪國(guó)平，牛玉，汪文毅，等. 番茄SSR標(biāo)記在茄子及其他茄科作物上的通用性分析[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2014, 35(4): 56- 60.

[8] 崔喜艷，胡廣宇，孫小杰，等. 1個(gè)新的玉米半透明皺縮胚乳突變體的遺傳及基因定位[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2014, 35(5): 31-35.

[9] 慈佳賓，楊巍，任雪嬌，等. 玉米單倍體誘導(dǎo)及化學(xué)加倍方法的研究[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2015, 36(3): 49-53.

[10]嚴(yán)志萱，杜利鑫. 木耳菜設(shè)施栽培技術(shù)[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技， 2015 (17): 94-96.

[11]李懋學(xué)，陳瑞陽(yáng). 關(guān)于植物核型分析的標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題[J]. 武漢植物學(xué)研究， 1985, 3(4): 297-302.

[12]LEVAN A, FRADGA K, SANDBERG A A. Nomenclature for centromeric position on chromosomes[J]. Hereditas, 1964, 52(2): 201-220.

[13]ARANO H. The karyotypes and the speciations in subfamily Carduoideae (Compositae) of Japan[J]. Jap J Bot, 1965, 19(3): 31- 67.

[14]STEBBINS G L. Chromosomal evolution in higher plants[M]. London: Edward Arnold Ltd., 1971: 87- 89.

[15]劉丹，夏雪，吳益梅，等. 植物染色體制片效果影響因素的解析[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2015, 56(10): 1654-1657.

[16]顧蔚，卜海東，張成艷，等. 華中五味子染色體制片優(yōu)化及核型分析[J]. 西北植物學(xué)報(bào)， 2008, 28(2): 262-266.

[17]王小利. 葡萄染色體制片技術(shù)優(yōu)化[J]. 實(shí)驗(yàn)室研究與探索， 2012, 31(10): 7-9.

[18]陳是宇，方程，孫彥，等. 燕麥屬牧草根尖組織染色體觀察方法的優(yōu)化研究[J]. 草原與草坪， 2008(2): 23-26.

[19]楊寧，談?dòng)老?，李巧峽，等. 百里香染色體制片優(yōu)化及核型分析[J]. 草業(yè)學(xué)報(bào)， 2012, 21(1): 184-189.

[20]袁文煥，王新娥，劉建敏，等. 幾種蕓薹屬蔬菜的核型分析與比較[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2008, 31(2): 27-30.

[21]張蜀寧，張紅梅，鄭金雙，等. 甘藍(lán)類(lèi)作物的核型分析與比較[J]. 中國(guó)蔬菜， 2011(2): 30-35.

[22]張紅梅，張蜀寧，孔艷娥，等. 青花菜染色體制片技術(shù)及核型分析[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2009, 32(4): 33-36.

【責(zé)任編輯 莊 延，周志紅】

Optimization of chromosome preparation and karyotype analysis of Basella alba

SUN Bo, GU Jinhua, TONG Yuantao, ZHANG Fen, TANG Haoru

(College of Horticulture, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China)

【Objective】 To optimize the chromosome preparation procedure and investigate the karyotype of malabar spinach (Basellaalba) and to provide a theoretical basis for studying genetic and phylogenetic relationships of different types of malabar spinach.【Method】The cultivar ‘large leaf malabar spinach’ was used as plant material. Factors that affected chromosome preparation including organ selection, pretreatment and dissociation durations were investigated. With the optimized protocol, the karyotypic characteristics were analyzed.【Result】The proportions of mitotic cells and metaphase cells of the main root tip samples were the highest compared to other sampled organs. Six-hour pretreatment using 0.002 mol·L-18-hydroxyquinoline resulted in the highest degree of chromosome contraction, the best shape and evenly spreading of chromosomes. Eight-minute dissociation at 60 ℃ using 1 mol·L-1HCl resulted in the highest contrast with clear chromosome staining and transparent cytoplasm. The karyotype formula of malabar spinach is 2n=2x=44=38 m(2SAT)+6 sm. The constitution of relative length is 20 M2+22 M1+2 S, and the ratio of chromosome length to width is 1.93. The relative length ranges from 3.13% to 6.06%, the centromeric index ranges from 35.19% to 47.86%, and the arm ratio ranges from 1.09 to 1.84. The 10th, 16thand 17thpairs of chromosomes belong to submetacentric chromosomes and the rest are metacentric chromosomes. Two satellites were observed at the 13thpair of chromosomes. The karyotype asymmetry index is 57.89%, and malabar spinach has the 1A karyotype according to Stebbins’ classification criteria.【Conclusion】This study established an optimal chromosome preparation procedure for malabar spinach，and revealed its karyotypic characteristics from the cytogenetic aspects.

Basellaalba; chromosome preparation; karyotype; mitotic cell; metaphase cell

2016- 02- 05 優(yōu)先出版時(shí)間：2016-10-24

孫 勃(1983—)，男，副教授，博士， E-mail：14099@sicau.edu.cn；通信作者：湯浩茹(1963—)，男，教授，博士，E-mail：htang@sicau.edu.cn

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)本科質(zhì)量工程項(xiàng)目(04052109)；四川農(nóng)業(yè)大學(xué)本科教學(xué)改革研究項(xiàng)目(X2015020)

S636.9

A

1001- 411X(2016)06- 0105- 05

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20161024.1041.018.html

孫 勃， 辜金花， 童袁桃， 等.木耳菜染色體制片優(yōu)化及核型分析[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016,37(6):105- 109.