食線蟲性真菌彎孢節(jié)叢孢菌的分離及捕食線蟲過程的觀察

王逢會(huì)， 王波波， 蔡葵蒸

(1 延安大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，陜西 延安 716000； 2 西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

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食線蟲性真菌彎孢節(jié)叢孢菌的分離及捕食線蟲過程的觀察

王逢會(huì)1， 王波波2， 蔡葵蒸2

(1 延安大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，陜西 延安 716000； 2 西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

【目的】從牛羊相關(guān)聯(lián)的基質(zhì)中分離食線蟲性真菌彎孢節(jié)叢孢菌Arthrobotrysmusiformis并進(jìn)一步觀察該分離株對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Haemonchuscontortus3期幼蟲和秀麗隱桿線蟲Caenorhabditiselegans的捕食過程?！痉椒ā坑谜T餌平板技術(shù)分離彎孢節(jié)叢孢，然后借助掃描電鏡觀察彎孢節(jié)叢孢對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲3期幼蟲和秀麗隱桿線蟲作用的動(dòng)態(tài)過程。將該菌分離株NPS045接種在表面鋪有纖維素膜的20 g·L-1水瓊脂平皿中培養(yǎng)4 d后并加入試驗(yàn)線蟲，于2種線蟲捕捉后不同時(shí)間段取樣觀察?！窘Y(jié)果】電鏡觀察結(jié)果顯示，加入試驗(yàn)線蟲后5 h該菌產(chǎn)生捕食結(jié)構(gòu)并開始捕捉2種線蟲；彎孢節(jié)叢孢對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲3期幼蟲于捕捉后22 h刺入角質(zhì)層，56 h蟲體有侵入性菌絲長出，68 h消化完全；秀麗隱桿線蟲于捕捉后14 h刺入并明顯皺縮，19 h蟲體嚴(yán)重皺縮，24 h消化完全?！窘Y(jié)論】從1 502份與牛羊相關(guān)的樣品中分離出17株彎孢節(jié)叢孢菌，其在總樣品中的檢出率為1.13%。

彎孢節(jié)叢孢菌； 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲； 秀麗隱桿線蟲； 生物防治

家畜的寄生線蟲病是全世界普遍發(fā)生且嚴(yán)重影響著家畜生產(chǎn)性能的疫病之一。長期以來，線蟲病的防治主要依賴于化學(xué)驅(qū)蟲藥，如阿維菌素(Abamectin)、苯并咪唑(Benzimidazole)、左旋咪唑(Levamisole)等，但隨著化學(xué)藥物的長期使用，它們的副作用如寄生蟲抗藥性增強(qiáng)、畜體內(nèi)藥物殘留等問題都不可小覷。目前人們在尋找其他的替代防治方法來減少化學(xué)驅(qū)蟲劑的使用，如劃區(qū)輪牧、清除牧場糞便以及開發(fā)疫苗等[1-2]，而利用食線蟲真菌對(duì)家畜寄生線蟲的自由生活階段的幼蟲進(jìn)行生物防治是人們所期望的最有應(yīng)用前景的方法之一。捕食線蟲真菌可以通過菌絲特化形成具有特殊結(jié)構(gòu)的捕食器官，如黏性球、黏性分枝、非收縮性環(huán)、收縮性環(huán)、黏性網(wǎng)及冠囊體捕捉線蟲，不同捕食器官有它自身所特有的捕食機(jī)制，其中能形成三維黏性網(wǎng)的菌占了捕食線蟲真菌的絕大部分[3]。鞭式達(dá)丁屯菌Duddingtoniaflagrans是典型的能夠產(chǎn)生三維黏性網(wǎng)的菌之一，該菌由于能夠產(chǎn)生大量的厚垣孢子，厚壁的厚垣孢子對(duì)酸堿和消化酶有強(qiáng)耐受性，在通過動(dòng)物的胃腸道時(shí)能夠存活，并且隨糞便中的蟲卵一起排出體外；當(dāng)溫度適宜時(shí)蟲卵發(fā)育孵化成幼蟲，厚垣孢子也隨之萌發(fā)成菌絲產(chǎn)生三維黏性網(wǎng)來捕捉線蟲。

國外已將鞭式達(dá)丁屯菌作為家畜線蟲生物防治制劑的候選菌種，分別在綿羊、山羊、牛、馬等家畜上進(jìn)行試驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)室階段對(duì)減少彎孢節(jié)叢孢對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Haemonchuscontortus3期幼蟲有良好的效果[4- 6]。然而，除鞭式達(dá)丁屯菌外，從當(dāng)?shù)胤蛛x捕食線蟲性真菌對(duì)進(jìn)一步篩選有生物防治潛力的菌種是十分必要的，因?yàn)橹挥挟?dāng)?shù)氐恼婢拍芨眠m應(yīng)當(dāng)?shù)氐臍夂蚝铜h(huán)境且無生態(tài)學(xué)風(fēng)險(xiǎn)。關(guān)于彎孢節(jié)叢孢菌Arthrobotrysmusiformis,國內(nèi)從茶園、橘子園的土壤[7]以及從牛、羊、馬、驢、豬糞便中曾得到分離[8]。本研究從與牛羊生活相關(guān)的基質(zhì)中分離該菌，重點(diǎn)通過掃描電子顯微鏡觀察該菌與動(dòng)物胃腸道的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲3期幼蟲、自由生活線蟲秀麗隱桿線蟲Caenorhabditiselegans的相互作用及捕食的動(dòng)態(tài)過程。為進(jìn)一步研究捕食線蟲性真菌的殺蟲機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于2012年10月—2014年8月，從全國20個(gè)省(直轄市、自治區(qū))的48個(gè)縣、87個(gè)采樣點(diǎn)采集了1 502份樣品，包括糞便1 141份(其中羊糞793份、牛糞348份)、牛羊放牧草地土壤118份、糞堆147份、廄舍土壤96份。其中糞便樣品采集于直腸中或排出后0.5 h內(nèi)未被土壤粘污的糞便，土壤樣品從地表下5～10 cm處采取，糞堆樣品從堆積糞便表面下5～10 cm處分點(diǎn)采??；樣品每份15～20 g，裝在經(jīng)消毒后潔凈的塑料袋中密封置于4 ℃冰箱中保存直至接種。

1.2 真菌分離、純化和電鏡中所用的誘餌線蟲

用先前實(shí)驗(yàn)室分離保存的綿羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲3期幼蟲接種3月齡已驅(qū)蟲的羔羊，人工感染3周后，經(jīng)糞便檢查排出大量蟲卵以確定感染，將糞便搓碎并置于搪瓷盒中，并加入適量滅菌鋸末和蒸餾水于26 ℃培養(yǎng)7 d，用蒸餾水將爬到搪瓷盒蓋上的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲3期幼蟲洗下，加無菌蒸餾水1 000 r·min-1離心洗滌3次，每次5 min。培養(yǎng)秀麗隱桿線蟲時(shí)將其接種于有OP50大腸埃希菌的NGM培養(yǎng)基上，置于20 ℃培養(yǎng)7 d，用存放于4 ℃冰箱的M 9緩沖液沖洗蟲體，離心洗滌方法同捻轉(zhuǎn)血矛線蟲3期幼蟲。電鏡中使用的幼蟲如果離心過程中不夠潔凈，在倒置顯微鏡下用一特制的吸管挑出幼蟲后再用無菌蒸餾水離心1次備用。

1.3 真菌分離

土壤樣品壓碎以“Y”字形撒在水瓊脂培養(yǎng)基(WA)上[9]，糞便樣品采用三點(diǎn)接樣法接種于WA上[10]，樣品接種量每個(gè)平皿2～5 g，每份樣品3個(gè)平行。接種后當(dāng)天至第2天，每個(gè)培養(yǎng)皿加入約2 000條捻轉(zhuǎn)血矛線蟲3期幼蟲作為誘餌。為了防止培養(yǎng)基失水，培養(yǎng)皿用封口膠密封，然后置于25 ℃培養(yǎng)6周。在加入捻轉(zhuǎn)血矛線蟲3期幼蟲1周內(nèi)，在倒置顯微鏡(Olympus, IX2-SLP, Japan)下用4倍和10倍的物鏡每天檢查或隔天檢查1次，以后每隔1周檢查1次。在此過程中一旦發(fā)現(xiàn)線蟲被捕捉，就用接種針或解剖針將捕食的線蟲、捕食結(jié)構(gòu)或分生孢子轉(zhuǎn)移到0.4 g·L-1的玉米粉瓊脂(CMA)培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)2～3 d，然后加入約4 000條秀麗隱桿線蟲直至獲得純培養(yǎng)物。培養(yǎng)過程中，對(duì)該菌菌落特征，分生孢子形態(tài)及大小、產(chǎn)孢方式、分生孢子梗大小、捕食結(jié)構(gòu)等進(jìn)行觀察，并按照李飛天等[11]、Zhang等[12]所列檢索表和描述進(jìn)行鑒定。

1.4 掃描電鏡樣品的制備和觀察

參照Nordbring-Hertz[13]介紹的方法并加改進(jìn)。首先將透析膜(相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8 000～14 000)剪裁成直徑6 cm的小圓塊，置于250 mL燒杯中，加入100 mL蒸餾水，121 ℃高壓滅菌15 min；滅菌后取出透析膜置于9個(gè)WA培養(yǎng)基上，邊緣用少量 20 g·L-1的滅菌瓊脂密封。然后，用直徑5 mm的打孔器取事先培養(yǎng)在0.4 g·L-1CMA上的分離株(NPS045)菌塊接入透析膜中央， 26 ℃培養(yǎng)4 d，移去透析膜中央的接種塊，并在透析膜中央加入20 μL(約10 000條)秀麗隱桿線蟲或捻轉(zhuǎn)血矛線蟲3期幼蟲蟲體懸液。同時(shí)，設(shè)不加線蟲的對(duì)照組為3個(gè)平皿。加線蟲后，每隔1 h在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)觀察到蟲體被菌絲捕捉時(shí)記為0 h，并在培養(yǎng)皿底部做出標(biāo)記，以后在捕捉后6、14、19、24、32 h觀察秀麗隱桿線蟲的變化過程及6、12、22、32、48、56、68 h觀察捻轉(zhuǎn)血矛線蟲3期幼蟲的變化過程并做出標(biāo)記。每一監(jiān)測時(shí)間點(diǎn)下用手術(shù)刀和鑷子取1塊約1 cm2的透析膜，放入25 g·L-1的戊二醛中，4 ℃固定5 d，其后用0.1 mol·L-1PBS(pH 7.2)沖洗3次；用系列體積分?jǐn)?shù)梯度(30%、50%、60%、70%、85%、95%和100%)乙醇溶液依次脫水，每次10 min，最后用體積分?jǐn)?shù)為100%的乙醇溶液重復(fù)脫水1次。為防止殘留乙醇對(duì)冷凍效果的影響，先將樣品置于3 mL叔丁醇中2 min,取出后再放入1 mL叔丁醇中4 ℃作用10 min，立即放入真空干燥箱(DZF型，上海森信公司生產(chǎn))在真空度0.08 MPa下干燥40 min。樣品干燥后用雙面膠帶粘貼在樣品臺(tái)上，離子濺射儀(日立E-1010型)噴金后，用掃描電鏡(S-3400N型)觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 彎孢節(jié)叢孢菌的分離

從1 502份樣品中，共分離出17株彎孢節(jié)叢孢菌，在總樣本中的檢出率為1.13%(17/1 502)，其中新鮮糞便中3株，分離率0.26%(3/1 141)；糞堆中2株，分離率1.36%(2/147)；草場土壤中8株，分離率6.78%(8/118)；廄舍土壤中4株，分離率4.17%(4/96)。在地理分布上，以云南、貴州檢出最多，其次為四川、內(nèi)蒙古，其他采樣點(diǎn)未檢出。該菌形態(tài)學(xué)特點(diǎn)：菌絲無色，分枝，分隔，排布密集；分生孢子梗無色，直立，不分枝，頂端有小齒梗較離散似燭臺(tái)狀分枝(圖1A)，在短而小的齒梗上產(chǎn)生3～12個(gè)分生孢子，稀疏，呈頭狀排列；分生孢子無色，呈橢圓形，直或稍彎，頂端闊圓，向基部逐漸收縮，1個(gè)分隔(圖1A和1B)。所分離菌的上述特點(diǎn)與記載的彎孢節(jié)叢孢菌相一致[11-12]。

圖1 彎孢節(jié)叢孢分離株(NPS045)分生孢子及孢子梗的掃描電鏡照片

2.2 分離株對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲3期幼蟲和秀麗隱桿線蟲捕食作用的動(dòng)態(tài)觀察

彎孢節(jié)叢孢菌分離株NPS045在透析膜上呈放射性生長，培養(yǎng)4 d達(dá)平皿的2/3，此時(shí)加入秀麗隱桿線蟲和捻轉(zhuǎn)血矛線蟲3期幼蟲作用5 h后，營養(yǎng)菌絲上分化出較原菌絲粗的三維黏性網(wǎng)(圖2A)。起初，菌絲上的捕食結(jié)構(gòu)是單環(huán)，單環(huán)形成時(shí)菌絲上會(huì)出現(xiàn)一段側(cè)生分支，該分支彎曲向下與原菌絲融合，如此反復(fù)構(gòu)成復(fù)雜的三維黏性網(wǎng)(圖2B)，這時(shí)部分蟲體被捕捉。秀麗隱桿線蟲被捕捉后的第14 h菌絲刺入整個(gè)表皮層出現(xiàn)不規(guī)則的褶皺(圖2B)，19 h后已經(jīng)嚴(yán)重皺縮，表明蟲體內(nèi)部器官大多被菌絲消化(圖2C)，24 h已經(jīng)消化完全(圖2D)。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲3期幼蟲被捕捉后的第22 小時(shí)未有明顯皺縮，菌絲刺入蟲體，同時(shí)蟲體與捕食結(jié)構(gòu)接觸位點(diǎn)處呈現(xiàn)局部內(nèi)陷(圖3A)，56 h后蟲體與捕食結(jié)構(gòu)接觸部分的角質(zhì)層凹陷破裂有侵入性菌絲從體內(nèi)長出，表明此時(shí)蟲體內(nèi)部器官大部分被消化(圖3B)；68 h后整個(gè)蟲體留下表皮層，蟲體消化完全(圖3C)。此外，掃描電子顯微鏡下，大約在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲3期幼蟲捕捉后20 h在捕食部位可發(fā)現(xiàn)大量的桿狀細(xì)菌(助食線蟲真菌細(xì)菌，圖3D)。

圖2 彎孢節(jié)叢孢分離株(NPS045)與秀麗隱桿線蟲相互作用過程的掃描電鏡照片

圖3 彎孢節(jié)叢孢分離株(NPS045)與捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染性幼蟲(3期幼蟲)相互作用的掃描電鏡照片

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明，彎孢節(jié)叢孢菌在新鮮糞便中的檢出率為0.26%，糞堆中的檢出率為1.36%，廄舍土壤中的檢出率為4.17%，草場土壤中的檢出率為6.78%。其中新鮮糞便中檢出率最低，這與Saumell等[14]的報(bào)道基本一致，他們在糞便(采集于牛直腸)中對(duì)捕食線蟲性真菌總體檢出率為3.8%，糞便中檢出低的原因可能是捕食線蟲性真菌主要分布在自然界中，即使動(dòng)物吃進(jìn)，但通過動(dòng)物消化道后很大一部分被滅活。本研究中糞堆中的檢出率高于新鮮糞便中的檢出率，這與Hay等[15]報(bào)道相一致，糞便排出后幾天，植被上的真菌以及攜帶真菌的土壤線蟲就會(huì)進(jìn)入糞便，因此糞堆中的檢出率明顯升高。本試驗(yàn)中在廄舍、草場土壤中該菌檢出率相對(duì)較高，這也與在果園、樹下、花園等[16]土壤中捕食線蟲性真菌的檢出率相一致，因?yàn)檫@些棲息地的土壤潮濕、腐殖質(zhì)含量多利于捕食線蟲性真菌生長、繁殖，因而更易分離到。此外，據(jù)劉杏忠等[17]報(bào)道，捕食線蟲性真菌具有一定的地域性，本試驗(yàn)結(jié)果表明彎孢節(jié)叢孢菌在云南、貴州檢出最多，四川、內(nèi)蒙古次之，其他采樣點(diǎn)未檢出，這可能與該菌所適應(yīng)的環(huán)境如氣候、溫度、海拔有關(guān)。然而，由于我們采的樣品非常有限，此結(jié)果并不能證明其他地區(qū)不存在該菌。

電鏡觀察結(jié)果表明，加入秀麗隱桿線蟲和捻轉(zhuǎn)血矛線蟲3期幼蟲作用5 h后，彎孢節(jié)叢孢菌產(chǎn)生捕食器并開始捕食，此結(jié)果與國外學(xué)者在其他真菌上的報(bào)道結(jié)果有所差異。Dacruz等[18]用掃描電鏡觀察了鞭式達(dá)丁屯菌與自然感染的綿羊毛圓科(主要是血矛屬)線蟲3期幼蟲和自由生活線蟲——復(fù)活線蟲Panagrellussp.的相互作用，30 min后產(chǎn)生捕食器，70 min開始捕食。Campos等[19]報(bào)道，用捻轉(zhuǎn)血矛線蟲3期幼蟲誘導(dǎo)9 h后鞭式達(dá)丁屯菌產(chǎn)生捕食結(jié)構(gòu)，11 h后開始捕食。Maciel等[20]用犬的鉤口線蟲試驗(yàn)，經(jīng)誘導(dǎo)6 h后鞭式達(dá)丁屯菌產(chǎn)生捕食結(jié)構(gòu)，8 h后開始捕食。由于不同試驗(yàn)所用真菌的種類不同，故在捕食時(shí)間上有差異。本試驗(yàn)與Campos等[19]的試驗(yàn)所用線蟲的種類相同，彎孢節(jié)叢孢菌在形成捕食器和捕食蟲體所需時(shí)間上比Campos等[19]觀察的時(shí)間分別少4、6 h，說明該菌能更快地捕食捻轉(zhuǎn)血矛線蟲3期幼蟲。

菌絲刺入蟲體的時(shí)間因線蟲的種類不同而異。本試驗(yàn)中，秀麗隱桿線蟲被彎孢節(jié)叢孢菌捕捉后，14 h即可刺入蟲體，而捻轉(zhuǎn)血矛線蟲3期幼蟲大約32 h后刺入蟲體。Campos等[19]指出，鞭式達(dá)丁屯菌菌絲穿透捻轉(zhuǎn)血矛線蟲3期幼蟲蟲體的時(shí)間為捕捉后的24～36 h。Falbo等[21]報(bào)道，少孢節(jié)叢孢菌Arthrobotrysoligospora穿透血矛線蟲屬3期幼蟲蟲體的時(shí)間為捕捉后的36 h之內(nèi)。上述捻轉(zhuǎn)血矛線蟲3期幼蟲被菌絲穿透的時(shí)間大致相同。寄生線蟲的3期幼蟲體壁具有雙層的角質(zhì)保護(hù)，主要由尾鞘和堅(jiān)韌的角質(zhì)組成，相比之下秀麗隱桿線蟲的體壁因只有一層表皮層而更易被刺透。這就解釋了為何秀麗隱桿線蟲在短時(shí)間內(nèi)更易被彎孢節(jié)叢孢菌穿透和消化，也驗(yàn)證了血矛線蟲3期幼蟲是依靠其雙層角質(zhì)層的保護(hù)而更難被該菌穿透消化。此外，在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)菌絲與蟲體相互作用部位的表面皺縮內(nèi)陷，并且捕食結(jié)構(gòu)會(huì)不斷增多，這就為穿透時(shí)機(jī)械性壓力理論提供了依據(jù)[20]。Murray等[22]認(rèn)為，菌絲在相互作用的部位穿透蟲體是一個(gè)復(fù)雜的過程，在這個(gè)過程中需要大量的侵入性結(jié)構(gòu)為穿透過程提供壓力，因?yàn)榇┩赶x體時(shí)不僅需要穿透角質(zhì)層還要克服蟲體內(nèi)部組織器官的壓力。

本研究中觀察到菌絲刺入蟲體后會(huì)繼續(xù)生長和消化蟲體內(nèi)部器官并破壞角質(zhì)層，同時(shí)在黏著部位還發(fā)現(xiàn)大量的桿狀細(xì)菌。Duponnois等[23]研究鞭式達(dá)丁屯菌與線蟲相互作用時(shí)也發(fā)現(xiàn)了同一現(xiàn)象，他推測由于桿狀細(xì)菌的存在使得具有捕食能力的真菌菌絲數(shù)量增加，并且這些桿狀細(xì)菌產(chǎn)生的物質(zhì)可以作為真菌與線蟲間信號(hào)傳遞的紐帶，增強(qiáng)真菌與線蟲之間的特異性聯(lián)系，因而把這種桿狀細(xì)菌叫做助食線蟲真菌細(xì)菌(Nematophagous fungus helper bacteria, NHB)。然而這些桿狀細(xì)菌的發(fā)生、種類及確切的功能有待進(jìn)一步研究。

[1] BARGER I A. The role of epidemiological knowledge and grazing management for helminth control in small ruminants[J]. Int J Parasitol, 1999, 29(1): 41- 47.

[2] CRAIG T M. Anthelmintic resistance and alternative control methods[J]. Vet Clin N Am-Food A, 2006, 22(3): 567-581.

[3] SWE A, JEEWON R, POINTING S B, et al. Diversity and abundance of nematode-trapping fungi from decaying litter in terrestrial, freshwater and mangrove habitats[J]. Biodivers Conserv, 2009, 18(6): 1695-1714.

[4] SILVA B F, CARRIJO-MAUAD J R, BRAGA F R, et al. Efficacy ofDuddingtoniaflagransandArthrobotrysrobustain controlling sheep parasitic gastroenteritis[J]. Parasitol Res, 2010, 106(6): 1343-1350.

[5] SAGüéS M F, FUSé L A, FERNNDEZ A S, et al. Efficacy of an energy block containingDuddingtoniaflagransin the control of gastrointestinal nematodes of sheep[J]. Parasitol Res, 2011, 109(3): 707-713.

[6] BRAGA F R, ARAJO J V. Nematophagous fungi for biological control of gastrointestinal nematodes in domestic animals[J]. Appl Microbiol Biot, 2014, 98(1): 71- 82.

[7] 畢延菊. 捕食線蟲真菌的分布[J]. 思茅師范高等專科學(xué)校學(xué)報(bào)， 2000，16(3)：47- 49.

[8] 蘇鴻雁，李延清. 幾種家畜新鮮糞便中捕食線蟲真菌分布情況的研究[J]. 延安大學(xué)學(xué)報(bào)， 2006，25(2)：69-71.

[9] DUDDINGTON C L. Notes on the technique of handling predacious fungi[J]. Trans Brit Mycol Soc, 1955, 38(2): 97-103.

[10]SANTOS M, FERRAZ S, MUCHOVEJ J. Detection and ecology of nematophagous fungi from Brazilian soils[J]. Nematol Bras, 1991, 15(2): 121-134.

[11]李飛天，張克勤,劉杏忠. 食線蟲菌物分類學(xué)[M]. 北京：中國科學(xué)技術(shù)出版社， 2000：79- 80.

[12]ZHANG K Q, HYDE K D. Nematode-trapping Fungi[M]. Netherlands: Springer Science & Business, 2014: 92-94.

[13]NORDBRING-HERTZ B. Dialysis membrane technique for studying microbial interaction[J]. Appl Environ Microbiol, 1983, 45(1): 399- 407.

[14]SAUMELL C A, PADILHA T, SANTOS C, et al. Nematophagous fungi in fresh faeces of cattle in the Mata region of Minas Gerais state, Brazil[J]. Vet Parasitol, 1999, 82(3): 217-220.

[15]HAY F S, NIEZEN J H, MILLER C, et al. Infestation of sheep dung by nematodephagous fungi and implications for the control of free - living stages of gastro - intestinal nematodes[J]. Vet Parasitol, 1997, 70(4): 247-254.

[16]楊曉野，楊連茹，劉珍蓮，等. 捕食線蟲性真菌的分離培養(yǎng)及分布規(guī)律[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2003，23(4)：344-347.

[17]劉忠杏，裘維蕃，繆作清，等. 捕食線蟲真菌在我國的分布[J]. 真菌學(xué)報(bào)， 1993，12(3)：253-256.

[18]DACRUZ D G, ARAUJO F B, MOLENTO M B, et al. Kinetics of capture and infection of infective larvae of trichostrongylides and free-living nematodesPanagrellussp. byDuddingtoniaflagrans[J]. Parasitol Res, 2001, 109(4): 1085-1091.

[19]CAMPOS A K, ARAUJO J V, GUIMARAES M P. Interaction between the nematophagous fungusDuddingtoniuflagransand infective larvae ofHaemonchuscontortus(Nematoda:Trichostrongyloidea)[J]. J Helminthol, 2008, 82(4): 337-341.

[20]MACIEL A S, ARAJO J V, CAMPOS A K. Scanning electron microscopy ofAncylostomaspp. dog infective larvae captured and destroyed by the nematophagous fungusDuddingtoniaflagrans[J]. Micron, 2009, 40(4): 463- 470.

[21]FALBO M K, SOCCOL V T, SANDINI I E, et al. Isolation and characterization of the nematophagous fungusArthrobotrysconoides[J]. Parasitol Res, 2013, 112(1): 177-185.

[22]MURRAY D S, WHARTON D A. Capture and penetration processes of the free-living juveniles ofTrichostrongyluscolubriformis(Nematoda) by the nematophagous fungus,Arthrobotrysoligospora[J]. Parasitology, 1990, 101(1): 93-100.

[23]DUPONNOIS R, BA A M, Mateille T. Effects of some rhizosphere bacteria for the biocontrol of nematodes of the genusMeloidogynewithArthrobotrysoligospora[J]. Fundan Appl Nematol, 1998, 21(2): 157-163.

【責(zé)任編輯 柴 焰】

Isolation of nematophagous fungus Arthrobotrys musiformis and observation of nematode predating process

WANG Fenghui1, WANG Bobo2, CAI Kuizheng2

(1 Medical College of Yan’an University, Yan’an 716000, China; 2 College of Life Science and Engineering, Northwest University for Nationalities, Lanzhou 730030, China)

【Objective】 To isolate nematophagous fungusArthrobotrysmusiformisfrom substances associated with cattle and sheep, and observe the process of the fungus predating third-stage larvae ofHaemonchuscontortusand free-living nematodeCaenorhabditiselegans. 【Method】A.musiformiswas isolated using baited plate technique, and the dynamic processes ofA.musiformispredatingH.contortusandC.eleganswere observed under scanning electron microscopy (SEM).A.musiformisisolate NPS045 was inoculated onto 20 g·L-1water agar plate covered with cellulose membrane on agar surface, incubated for four days, and then the nematodes were added to the plates. The samples containing nematodes and fungi were collected and observed at different time points after the two nematode species were captured. 【Result】SEM analysis showed that 5 hours after the two nematode species were added,A.musiformisproduced predating structures and started to capture the nematodes. The third-stage larvae ofH.contortuswere penetrated byA.musiformis22 hours after being caught, invasive hyphae grew out of the larval body after 56 hours, and the larvae were completely digested by 68 hours.C.eleganswere penetrated byA.musiformisand clearly shrunk 14 h after being caught, seriously collapsed after 19 hours, and were completely digested by the 24th hour. 【Conclusion】SeventeenA.musiformisstrains were isolated from 1 502 samples associated with cattle and sheep, and the prevalence ofA.musiformisin total samples was 1.13%.

Arthrobotrysmusiformis;Haemonchuscontortus;Caenorhabditiselegans; biological control

2016- 03- 31 優(yōu)先出版時(shí)間：2016-10-24

王逢會(huì)(1982—)，女，講師，碩士， E-mail: 95412543@qq.com；通信作者：蔡葵蒸(1959—)，男，教授，博士， E-mail: ckz000@126.com

教育部長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃(IRY13091)

S855.9

A

1001- 411X(2016)06- 0065- 05

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王逢會(huì)， 王波波， 蔡葵蒸.食線蟲性真菌彎孢節(jié)叢孢菌的分離及捕食線蟲過程的觀察[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016,37(6):65- 69.