水稻淡綠葉突變體HM133的遺傳分析與基因定位

施勇烽 賀彥 郭丹 呂向光,2 黃奇娜 吳建利,*

(1中國(guó)水稻研究所 水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家水稻改良中心， 杭州 310006； 2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物科學(xué)研究所， 北京 100081；# 共同第一作者； *通訊聯(lián)系人， E-mail： beshangd@163.com)

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水稻淡綠葉突變體HM133的遺傳分析與基因定位

施勇烽1,#賀彥1,#郭丹1呂向光1,2黃奇娜1吳建利1,*

(1中國(guó)水稻研究所 水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家水稻改良中心， 杭州 310006；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物科學(xué)研究所， 北京 100081；#共同第一作者；*通訊聯(lián)系人， E-mail： beshangd@163.com)

SHI Yongfeng， HE Yan， GUO Dan, et al. Genetic analysis and gene mapping of a pale green leaf mutantHM133 in rice. Chin J Rice Sci, 2016, 30(6): 603-610.

EMS誘導(dǎo)秈稻品種IR64獲得淡綠葉突變體HM133。與野生型IR64相比，HM133播種后的第6周和第15周的光合色素含量以及抽穗期的凈光合速率顯著降低，氣孔導(dǎo)度則明顯上升；此外，突變體株高、每穗實(shí)粒數(shù)和結(jié)實(shí)率等農(nóng)藝性狀也較野生型顯著下降。葉綠體超微結(jié)構(gòu)分析表明，分蘗期HM133類囊體基粒片層形狀不規(guī)則，堆疊凌亂、排列疏松。遺傳分析表明HM133淡綠葉性狀受單隱性核基因控制。通過分子標(biāo)記將該基因定位于第3染色體長(zhǎng)臂RM143和RM3684之間。該區(qū)間內(nèi)包含編碼鎂螯合酶D亞基的基因OsCHLD。序列分析表明HM133中該基因第10外顯子上有一個(gè)從G突變?yōu)锳的單堿基變異，導(dǎo)致編碼的氨基酸由精氨酸變成谷氨酸，推測(cè)OsCHLD基因即為控制HM133淡綠葉表型的候選基因。

水稻； 淡綠葉； 基因定位； 鎂螯合酶； 光合作用

葉片是植物進(jìn)行光合作用的主要場(chǎng)所。葉綠體是進(jìn)行光合作用的重要細(xì)胞器，葉綠體發(fā)育異常、光合色素含量改變以及光合作用復(fù)合體的穩(wěn)定性等都會(huì)影響影響植物的光合作用效率。常見的葉色變異大多與光合色素合成與降解，葉綠體的結(jié)構(gòu)、組成和生理狀態(tài)異常有關(guān)，通常會(huì)導(dǎo)致葉片出現(xiàn)白化、黃化、淡綠、黃綠和條紋等突變表型。在水稻[1,2]、玉米[3,4]、大麥[5]、擬南芥[6]和油菜[7]等植物中均有葉色突變體的報(bào)道。

目前水稻中已經(jīng)鑒定了大量的葉色突變體(http://www.shigen.nig.ac.jp/rice/oryzabase/)，分別涉及葉綠素代謝、光敏色素代謝以及葉綠體發(fā)育異常。其中，影響葉綠素生物合成途徑相關(guān)基因的突變是研究報(bào)道最為深入的一類。對(duì)擬南芥的研究發(fā)現(xiàn)葉綠素生物合成途徑共包括15步反應(yīng)，涉及15種酶，并分離了 27個(gè)編碼這些酶的基因[8]。水稻中目前也已克隆多個(gè)葉綠素合成途徑中相關(guān)酶的基因，如OsCHLH、OsCHLD、OsCHLI、DVR、CAO1、CAO2、YGL1和PORB[2,9-14]。另外，四吡咯代謝分支途徑即光敏色素合成途徑中相關(guān)基因的突變也能造成葉色突變，例如水稻亞鐵血紅素加氧酶基因的變異能反饋?zhàn)饔糜谌~綠素合成途徑，從而使葉綠素的合成發(fā)生異常[15,16]。除了約100個(gè)葉綠體基因組自身編碼的蛋白外，葉綠體中含有大約3000個(gè)由核基因編碼的蛋白，相關(guān)蛋白的突變會(huì)影響葉綠體的正常發(fā)育，導(dǎo)致葉色變異、植株發(fā)育遲緩等癥狀，如編碼類囊體結(jié)合蛋白基因ZN突變可導(dǎo)致水稻產(chǎn)生斑馬葉表型[17]，編碼PPR蛋白的基因YSA的突變致使水稻產(chǎn)生白化表型[18]，編碼葉綠體SRP43蛋白[19]和SRP54蛋白[20]基因的變異均導(dǎo)致水稻葉色變成淡綠色。

本研究利用秈稻IR64經(jīng)EMS誘導(dǎo)后篩選獲得一份葉色突變體HM133，對(duì)其開展表型性狀、生理特性等方面的研究，同時(shí)對(duì)突變基因開展了遺傳分析和基因定位，結(jié)合測(cè)序分析結(jié)果推測(cè)水稻鎂螯合酶D亞基基因(OsCHLD)是控制HM133淡綠葉性狀的候選基因。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究采用的淡綠葉突變體HM133是由秈稻品種IR64經(jīng)過EMS誘變得到。經(jīng)過連續(xù)多代自交，該葉色突變性狀無(wú)論種植于海南陵水或浙江富陽(yáng)，在溫室條件或大田環(huán)境下均能穩(wěn)定遺傳。2015年將該突變體種植于中國(guó)水稻研究所富陽(yáng)實(shí)驗(yàn)基地，在成熟期隨機(jī)選取野生型和突變體各3株考查株高、穗長(zhǎng)、有效穗數(shù)、結(jié)實(shí)率和千粒重等農(nóng)藝性狀，取平均值進(jìn)行分析。

1.2 群體構(gòu)建及遺傳分析

以突變體HM133為母本，分別與正常葉色品種IR24和熱研1號(hào)配制雜交組合，觀察F1的表型并收獲F1單株種子，觀察并統(tǒng)計(jì)HM133/IR24的F2群體中正常葉和淡綠葉水稻的株數(shù)，用于遺傳分析。HM133/熱研1號(hào)的F2群體中淡綠葉表型單株用于DNA提取和基因定位。

1.3 光合色素含量和光合參數(shù)測(cè)定

播種后第6周和第15周分別取野生型和突變體HM133倒2葉樣品，稱取約0.3 g，剪成0.3～0.5 cm長(zhǎng)度的片段，在常溫黑暗條件下用95%乙醇浸提48 h，然后用PerkinElmer分光光度計(jì)分別測(cè)定在470 nm、649 nm和665 nm三個(gè)波長(zhǎng)處的光吸收值。播種后第6周和第15周各取3株設(shè)定生物學(xué)重復(fù)，參照Arnon和Wellburn等[21,22]的方法計(jì)算葉綠素和類胡蘿卜素的含量。

于水稻抽穗期利用便攜式光合測(cè)定儀LI-6400(LI-COR,USA)在晴好天氣上午9：00-11：00，田間測(cè)定野生型和突變體HM133劍葉光合作用指標(biāo)，光合參數(shù)設(shè)定參照Huang等[23]的方法。每株重復(fù)3次測(cè)定，取平均值。

1.4 葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察

選取野生型和突變體HM133分蘗期倒2葉葉片切成1 mm片段，在2.5% 戊二醛溶液中抽真空固定。參照Lv等[19]的方法進(jìn)行樣品制備，于浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院用Tecnai G2F20 S-TWIN型透射電子顯微鏡(FEI，USA)觀察葉綠體超微結(jié)構(gòu)。

1.5 基因定位

采用簡(jiǎn)易法提取親本和單株DNA[24]，分別取HM133/熱研1號(hào)F2群體正常葉和淡綠色葉單株各10株，以等量葉片構(gòu)建野生型DNA池和突變體DNA池。利用水稻12條染色體上172對(duì)SSR標(biāo)記，對(duì)親本HM133和熱研1號(hào)間進(jìn)行多態(tài)性標(biāo)記篩選，再將篩選到的標(biāo)記用于野生型池和突變體池間的多態(tài)性分析，找到兩池間有多態(tài)的標(biāo)記，用于F2群體中淡綠葉單株的基因型分析，初步確定突變基因的位置。從Gramene數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.gramene.org/)下載SSR標(biāo)記引物序列，由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行合成。參照Shi等[25]的方法進(jìn)行PCR和產(chǎn)物檢測(cè)。

1.6 候選基因OsChlD的測(cè)序和驗(yàn)證

利用水稻基因組信息注釋系統(tǒng)(http://rice.plantbiology.msu.edu)，查詢目標(biāo)區(qū)間內(nèi)的基因。根據(jù)OsChlD基因的cDNA序列設(shè)計(jì)引物(正向引物5′-TCTCTCCCTCCCCTCCCATG-3′，反向引物5′-GCTCTCCAGGATCACGAACTCT-3′)，并對(duì)HM133、IR64和IR24進(jìn)行PCR，由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

根據(jù)測(cè)序結(jié)果的比對(duì)，找到突變位點(diǎn)，在突變位點(diǎn)附近根據(jù)OsChlD基因組序列設(shè)計(jì)引物(正向引物5′-TGCTTGGCACCTTTATCACA-3′,反向引物5′-GCCATTCTTTTGGCTCTCAT-3′)，對(duì)HM133、 IR24及其F2單株進(jìn)行DNA擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶TaqⅠ進(jìn)行酶切驗(yàn)證。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物

Table 1. Primers used in real-time PCR.

基因Gene正向引物(5'-3')Forwardprimer(5'-3')反向引物(5'-3')Reverseprimer(5'-3')OsChlDGGAAAGAGAGGGCATTAGCAATACGATCAAGTAAGTGTTOsChlIAGTAACCTTGGTGCTGTGAATCCATCAACATTCAACTCTGOsChlHCTATACATTCGCCACACTTATCACACAACTCCCAAGHEMA1CGCTATTTCTGATGCTATGGGTTCTTGGGTGATGATTGTTTGGPORATGTACTGGAGCTGGAACAACAAGAGCACAGCAAAATCCTAGACGCAO1GATCCATACCCGATCGACATCGAGAGACATCCGGTAGAGCCab1RAGATGGGTTTAGTGCGACGAGTTTGGGATCGAGGGAGTATTTCab2RTGTTCTCCATGTTCGGCTTCTGCTACGGTCCCCACTTCACTpsaAGCGAGCAAATAAAACACCTTTCGTACCAGCTTAACGTGGGGAGpsbACCCTCATTAGCAGATTCGTTTTATGATTGTATTCCAGGCAGAGCrbcLCTTGGCAGCATTCCGAGTAAACAACGGGCTCGATGTGATArbcSTCCGCTGAGTTTTGGCTATTTGGACTTGAGCCCTGGAAGGYGL1CAGTCTCCAATGGCCACCTTGCTTTCATCAGTGGCTGGSPPCGGAGAGGAAACATAATGACATAGGCATTTGTCTTTGTCTCPPR1CTAAGACCGAATGACAAATGCGCACTGCCAACAAGAATACCDVRCGAGCCCAGGTTCATCAAGGTGCCCTCCCGATCTTGCCGAACTCCUbiquitinGCTCCGTGGCGGTATCATCGGCAGTTGACAGCCCTAG

1.7 RNA提取和RT-PCR

采用Trizol法提取IR64與淡綠葉突變體HM133分蘗期倒2葉的總RNA，利用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover試劑盒(TOYOBO, 日本)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用SYBR?PremixExTaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)試劑盒(TaKaRa,日本)和Thermal Cycle Dice?Real Time System(TaKaRa, 日本)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，分析葉綠素合成與代謝途徑中相關(guān)基因的表達(dá)情況。以水稻Ubiquitin為內(nèi)參基因，相關(guān)基因的特異性引物見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 HM133的表型及主要農(nóng)藝性狀

突變體HM133葉色在苗期、分蘗期均表現(xiàn)為淡綠色(圖1)，該表型伴隨整個(gè)生育期。突變體HM133的主要農(nóng)藝性狀如有效穗數(shù)、穗長(zhǎng)和千粒重與野生型相比未發(fā)生明顯變化，但結(jié)實(shí)率、株高和每穗實(shí)粒數(shù)均顯著低于野生型(表2)。

A—野生型IR64和突變體HM133幼苗表型；B—野生型IR64和突變體HM133分蘗期的表型。

A, Phenotype of the wide type IR64 and the mutantHM133 at the seedling stage; B, Phenotype of the wide type IR64 and the mutantHM133 at the tillering stage.

圖1 野生型IR64和突變體HM133的不同時(shí)期植株表型

Fig. 1. Phenotype of the wide-type IR64 and the mutant HM133 at different growth stages.

2.2 HM133的光合色素含量和光合參數(shù)

在播種后第6周和第15周分別測(cè)定了突變體和野生型葉綠素和類胡蘿卜素含量。第6周和第15周時(shí)突變體的總?cè)~綠素含量與野生型相比分別下降了46.0%和47.7%，胡蘿卜素含量下降了38.8%和47.6%，兩個(gè)時(shí)期HM133的總?cè)~綠素含量、葉綠素a和葉綠素b含量與野生型相比均存在極顯著差異(表3)。

表2 野生型IR64和突變體HM133的主要農(nóng)藝性狀

Table 2. Agronomic traits of the wild-type IR64 and mutant HM133.

材料Material株高Plantheight/cm有效穗數(shù)No.ofproductivepanicles穗長(zhǎng)Paniclelength/cm每穗實(shí)粒數(shù)Numberoffilledgrainsperpanicle結(jié)實(shí)率Seed-settingrate/%千粒重1000-grainweight/gIR64113.0±1.714.0±1.025.0±1.481.2±7.174.6±1.627.52±0.38HM133108.7±0.6*12.7±2.124.9±0.362.9±7.3*68.8±2.1*28.35±0.35

*HM133與IR64在0.05水平上差異顯著。

*Significant difference between IR64 andHM133 at 0.05 level.

表3 不同生長(zhǎng)時(shí)期HM133與IR64葉片光合色素含量的比較

Table 3. Comparison of photosynthetic pigment contents between HM133 and IR64 at different growth stages. mg/g

*HM133與IR64在0.05水平上差異顯著;**HM133與IR64在0.01水平上差異顯著。

*Significant difference between IR64 andHM133 at 0.05 level;**Significant difference between IR64 andHM133 at 0.01 level.

表4 抽穗期野生型IR64和突變體HM133的劍葉光合特性

Table 4. Photosynthetic parameters of flag leaf of IR64 and HM133 at the heading stage.

材料Material凈光合速率Pn/(μmol·m-2s-1)氣孔導(dǎo)度GS/(mol·m-2s-1)胞間CO2濃度Ci/(μmol·mol-1)蒸騰速率Tr/(mmol·m-2s-1)IR6414.45±1.780.57±0.13309.13±7.304.12±0.64HM13312.74±1.38*0.73±0.09*313.75±6.414.26±0.25

*HM133與IR64在0.05水平上差異顯著。

*Difference between IR64 andHM133 was significant at 0.05 level.

為分析突變體光合色素含量的降低對(duì)光合作用的影響，抽穗期對(duì)IR64和HM133的光合參數(shù)進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)突變體的凈光合速率降低了11.8%，氣孔導(dǎo)度上升了26.3%，而胞間CO2濃度和蒸騰速率沒有顯著差異(表4)。

2.3 葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察

分蘗期分別對(duì)野生型和淡綠葉突變體HM133葉片進(jìn)行葉綠體結(jié)構(gòu)的電鏡觀察。結(jié)果顯示野生型IR64的葉綠體基質(zhì)濃密、基粒片層堆疊較厚、排列緊密(圖2-A、B)，而HM133的基粒數(shù)量明顯減少，基粒片層形狀不規(guī)則，片層堆疊較少、排列疏松(圖2-C、D)。結(jié)果表明HM133葉綠體的發(fā)育受到了嚴(yán)重影響。

2.4 HM133的遺傳分析

2.5 pglHM133基因定位及其候選基因預(yù)測(cè)

HM133/熱研1號(hào)的F2群體中85株淡綠葉單株作為定位群體，并采用分池法構(gòu)建了淡綠葉和正常葉色DNA池各1個(gè)。選用分布于12條染色體上的172對(duì)SSR標(biāo)記，對(duì)HM133和熱研1號(hào)進(jìn)行多態(tài)性標(biāo)記的篩選，獲得的128對(duì)多態(tài)性標(biāo)記用于淡綠葉與正常綠葉DNA池的多態(tài)性分析，其中第3條染色體上RM520、RM85和RM143表現(xiàn)DNA池的多態(tài)。進(jìn)一步用這3個(gè)標(biāo)記分析F2群體的85株淡綠葉單株，分別檢測(cè)到20株、28株和4株重組個(gè)體，其中RM143與標(biāo)記基因緊密連鎖。為更準(zhǔn)確定位該基因，根據(jù)已經(jīng)公布的SSR引物在RM143附近找到RM16108、RM16103、RM16097和RM3684在親本間有多態(tài)的標(biāo)記，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)僅標(biāo)記RM3684檢測(cè)到10株重組個(gè)體，其他3個(gè)標(biāo)記均無(wú)交換發(fā)生，最終將該基因定位于第3染色體的長(zhǎng)臂RM3684和RM143之間，物理距離約為3.1 Mb(圖3-A)。

A和B-野生型IR64; C和D-突變體HM133。 S-淀粉粒； C-葉綠體； G-基粒； SL-基質(zhì)片層； OG-嗜餓顆粒。

A and B, IR64; C and D,HM133. S, Starch granule; C, Chloroplast; G, Granum; SL, Stroma lamella; OG, Osmiophilic granule.

圖2 野生型IR64和突變體HM133的葉綠體超微結(jié)構(gòu)

Fig. 2. Chloroplast ultrastructure of IR64 and HM133.

通過水稻基因組信息注釋系統(tǒng)(http://rice.plantbiology.msu.edu/)查詢pglHM133目標(biāo)區(qū)間內(nèi)有超過200個(gè)候選基因，區(qū)間中包含已被Zhang等[10]注釋為OsChlD基因(登錄號(hào)為L(zhǎng)OC_Os03g59640)。OsChlD編碼鎂螯合酶D亞基，參與葉綠素合成過程，對(duì)葉綠體發(fā)育具有重要作用。序列分析表明，IR64與IR24的OsChlD基因cDNA序列一致，而突變體HM133的第10外顯子上存在一個(gè)單堿基突變，由G突變?yōu)锳(圖3-B)，對(duì)應(yīng)的氨基酸由精氨酸變?yōu)楣劝彼?。該位點(diǎn)突變影響了限制性內(nèi)切酶TaqⅠ 的特異性識(shí)別，用IR24/HM133的親本、F1和F2群體進(jìn)行驗(yàn)證，通過DNA擴(kuò)增獲得包含突變位點(diǎn)約193 bp大小片段，用TaqⅠ酶切后發(fā)現(xiàn)F2中淡綠葉單株和HM133的擴(kuò)增片段不能被TaqⅠ酶切，而IR24能被TaqⅠ完全酶切，F(xiàn)1則被部分酶切，F(xiàn)2中正常葉單株有部分酶切和完全酶切兩種情況(圖3-C)。這一結(jié)果表明突變體HM133的淡綠葉表型可能是由OsChlD基因的單堿基替換導(dǎo)致。

2.6 葉綠素合成和葉綠體發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR比較HM133及其野生型IR64中OsChlD基因和其他葉綠素合成、葉綠體發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明，與野生型相比，突變體中編碼鎂螯合酶亞基的OsChlD、OsChlI和OsChlH的表達(dá)量明顯下降，葉綠素合成相關(guān)基因HEMA1(谷氨酰t-RNA還原酶)、YGL1(葉綠素合成酶)、DVR(聯(lián)乙烯還原酶)和CAO1(葉綠素酸酯氧化酶)的表達(dá)量也顯著下降；葉綠體發(fā)育相關(guān)的psbA(D1蛋白)、psaA(光合系統(tǒng)Ⅰ葉綠素脫輔基蛋白)、rbcL(RUBP羧化酶大亞基)、SPP(基質(zhì)加工肽酶)表達(dá)顯著下調(diào)，而Cab1R和Cab2R(捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白)表達(dá)量顯著上升；PORA(原葉綠素酸酯氧化還原酶)、rbcS(RUBP羧化酶小亞基)、PPR1(三角狀五肽重復(fù)蛋白)的表達(dá)并沒有顯著變化(圖4)。上述結(jié)果表明，OsChlD的變異導(dǎo)致與葉綠素合成以及葉綠體發(fā)育相關(guān)的眾多基因的表達(dá)發(fā)生明顯改變。

A-pglHM133初步定位; B-候選基因OsChlD序列分析. 灰色部分表示HM133的1541位堿基G突變?yōu)锳; C-IR24/HM133 F2群體的TaqⅠ酶切驗(yàn)證. M-分子量標(biāo)記; 1-IR24; 2-HM133; 3-F1; 4～9-F2中淡綠葉單株; 10～25-F2群體中正常葉單株。

A,Primary mapping ofyglHM133on chromosome 3; B, Sequence analysis of the candidate geneOsChlD. The gray letters indicate single base substitution from G to A at position 1541； C, Mutation base ofOsChlDconfirmed withTaqI restriction enzyme digestion. M, Molecular marker; 1, IR24; 2,HM133; 3, F1; 4-9, Pale green plant of F2; 10-25, Normal plant of F2.

圖3 pglHM133定位及候選基因預(yù)測(cè)

Fig. 3. Location of pglHM133and candidate gene prediction.

圖4 RT-PCR分析野生型IR64與HM133 中葉綠素合成、葉綠體發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)

Fig. 4. Expression of genes associated with chlorophyll biosynthesis and chloroplast development in IR64 and HM133 by real-time PCR.

3 討論

植物中葉綠素的累積使葉片呈現(xiàn)綠色，葉綠素的生物合成需要包括鎂螯合酶在內(nèi)的15種酶的參與。鎂螯合酶是由D、I和H三亞基組成的復(fù)合體，四吡咯化合物原卟啉Ⅸ在鎂螯合酶催化下與鎂離子螯合形成鎂原卟啉Ⅸ[26]。植物葉色突變體中已鑒定了一些鎂螯合酶的突變體，大麥的突變體xantha-g44和xantha-g45是由于編碼鎂螯合酶D亞基突變?cè)斐扇~綠素合成受阻，分別產(chǎn)生黃葉和黃綠葉表型[5]，擬南芥T-DNA插入突變體AtchlD-KO存在白化致死表型，水稻中突變體Chlorina-1和ygl7在D亞基基因的不同位點(diǎn)發(fā)生突變，ygl7在整個(gè)生育期均表現(xiàn)為黃綠葉，Chlorina-1僅幼苗期的前2～3周出現(xiàn)黃綠葉表型[10,13]。玉米鎂螯合酶I亞基突變體Oy1為半顯性突變體，表現(xiàn)為黃化致死[4]，水稻和擬南芥的I亞基突變體則均表現(xiàn)為黃綠葉[6,10]。擬南芥和水稻鎂螯合酶H亞基的突變體分別產(chǎn)生淺綠和黃綠葉表型[2,6]。

本研究中的淡綠葉突變體HM133是EMS誘變秈稻IR64獲得，其葉綠素含量明顯低于野生型IR64，灌漿期凈光合速率明顯下降，類囊體發(fā)育異常，遺傳分析表明HM133淡綠葉性狀受單隱性核基因控制。通過分子標(biāo)記將pglHM133基因定位于第3染色體長(zhǎng)臂RM143和RM3684之間，區(qū)間內(nèi)包含編碼鎂螯合酶D亞基基因OsChlD，序列分析發(fā)現(xiàn)HM133中OsChlD基因第10外顯子上存在G突變?yōu)锳的單堿基變異，與已報(bào)道了另4個(gè)OsChlD等位基因Chl1[10]、ygl98[27]、ygl3[28]和ygl7[13]突變位點(diǎn)均不同，是一個(gè)新的OsChlD等位基因。這5個(gè)OsChlD突變體的表型不完全相同，可能由于不同的突變蛋白引起，也可能是受到遺傳背景的影響。ygl7在日本晴背景下產(chǎn)生黃化葉，而在810S背景下則表現(xiàn)為黃綠葉[13]，表明OsChlD控制葉色表型的機(jī)理非常復(fù)雜，受到遺傳背景的影響。Deng等[13]研究表明，ygl7在810S遺傳背景下，OsChlD、OsChlI和OsChlH的表達(dá)顯著上升，在日本晴背景下的ygl7-NIL則與野生型的表達(dá)基本相同。本研究發(fā)現(xiàn)突變體中OsChlD、OsChlI和OsChlH的表達(dá)量較野生型顯著下降，該結(jié)果與Deng等[13]的結(jié)果不同，可能與遺傳背景的差異有關(guān)，也可能是突變位點(diǎn)的不同引起的。突變體HM133中核基因編碼的HEMA1、YGL1、DVR、CAO1和葉綠體編碼基因PsaA、PsbA、rbcL的表達(dá)量呈顯著下降，而核基因編碼的Cab1R和Cab2R的表達(dá)呈顯著上升，表明OsChlD基因突變同樣影響了其他葉綠素合成酶基因和葉綠體發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)。Deng等[13]研究發(fā)現(xiàn)OsChlD突變蛋白ygl7，能行使部分OsChlD功能，能促進(jìn)光合作用和光能的高效利用，結(jié)實(shí)率等性狀與野生型無(wú)明顯差異。而本研究中突變體的凈光合速率顯著降低，株高、結(jié)實(shí)率和每穗實(shí)粒數(shù)也顯著低于野生型，可能是由于OsChlD突變位點(diǎn)不同造成相應(yīng)突變蛋白功能差異。另外，豌豆中ChlD亞基基因沉默植株中發(fā)現(xiàn)活性氧物質(zhì)的積累[29]，水稻中D亞基突變體是否存在同樣的現(xiàn)象仍有待進(jìn)一步研究。

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Genetic Analysis and Gene Mapping of a Pale Green Leaf MutantHM133 in Rice

SHI Yong-feng1,#， HE Yan1,#， GUO Dan1， LV Xiang-guang1,2， HUANG Qi-na1， WU Jian-li1,*

(1State Key Laboratory of Rice Biology, China National Rice Research Institute, Hangzhou 310006, China;2Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;#These authors contributed equally to this work;*Corresponding author, E-mail: beshangd@163.com)

The pale green leaf mutantHM133 was identified from an EMS-induced IR64 mutant bank. The contents of photosynthetic pigments including chlorophyll and carotenoid ofHM133 were reduced significantly at 6 weeks and 15 weeks after sowing when compared with IR64.The net photosynthetic rate ofHM133 was considerably lower than that of the wild-type IR64 at heading stage while the stomatal conductance was apparently increased. The agronomic traits including plant height, number of filled grain per panicle and seed-setting rate decreased significantly in the mutant compared with the wild-type. In addition, the mutant exhibited a less number of grana, irregular arrangement of thylakoid layer in the chloroplast at the tillering stage. Genetic and mapping analysis showed that the pale green phenotype was controlled by a single recessive gene located in the long arm of chromosome 3 between SSR markers RM143 and RM3684. The interval contains an ORFOsChlDencoding magnesium-chelatase D subunit. Sequence analysis revealed that the mutant allele carried a nucleotide substitution from G to A in the tenth exon ofOsChlD, which led to the substitution of glutamic acid for arginine acid. Therefore, it is deduced thatOsChlDis the candidate gene controlling the pale green leaf phenotype ofHM133.

Oryzasativa; pale green leaf; gene mapping; magnesium-chelatase; photosynthesis

2015-12-29； 修改稿收到日期: 2016-03-12。

國(guó)家863計(jì)劃資助項(xiàng)目(2014AA10A603)； 浙江省超級(jí)稻研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(2013E10021)。

Q343.5; S511.032

A

1001-7216(2016)06-0603-08

施勇烽, 賀彥, 郭丹, 等. 水稻淡綠葉突變體HM133的遺傳分析與基因定位. 中國(guó)水稻科學(xué)， 2016， 30(6)： 603-610.