基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的OsbHLH116基因編輯及其脫靶效應(yīng)分析

杜彥修 季新 陳會(huì)杰 彭廷 張靜 李俊周 孫紅正 趙全志

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心/河南省水稻生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 鄭州 450002； *通訊聯(lián)系人， E-mail: qzzhaoh@126.com)

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基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的OsbHLH116基因編輯及其脫靶效應(yīng)分析

杜彥修 季新 陳會(huì)杰 彭廷 張靜 李俊周 孫紅正 趙全志*

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心/河南省水稻生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 鄭州 450002；*通訊聯(lián)系人， E-mail: qzzhaoh@126.com)

DU Yanxiu, JI Xin, CHEN Huijie, et al. CRISPR/Cas9 system-based editing ofOsbHLH116 gene and its off-target effect analysis. Chin J Rice Sci, 2016, 30(6): 577-586.

以水稻OsbHLH116 基因?yàn)榫庉媽?duì)象，根據(jù)基因編碼區(qū)序列(CDS)在第一外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)長(zhǎng)度為19 bp的sgRNA，化學(xué)合成sgRNA的寡核苷酸序列，然后與CRISPR/Cas9系統(tǒng)表達(dá)載體pBUN411連接，再用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得水稻轉(zhuǎn)基因株系，最后利用酶切和測(cè)序相結(jié)合的方法對(duì)OsbHLH116 突變體進(jìn)行了篩選鑒定和脫靶效應(yīng)分析。結(jié)果表明，所構(gòu)建的pBUN411-gRNA載體成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)基因OsbHLH116 的定向編輯。酶切分析表明在選取的10株T0代轉(zhuǎn)基因苗中得到了6個(gè)OsbHLH116 突變單株。對(duì)6個(gè)突變單株進(jìn)行了TA克隆測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)了純合突變、雙等位突變和雜合突變3種類型。酶切分析表明2個(gè)潛在脫靶位點(diǎn)均未發(fā)生脫靶效應(yīng)。

水稻； 基因編輯； CRISPR/Cas9； 脫靶效應(yīng)；OsbHLH116

精確而簡(jiǎn)單的基因組編輯方法是研究基因功能的重要手段之一。最新發(fā)現(xiàn)的CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein) 系統(tǒng)因其簡(jiǎn)單和高效被廣泛應(yīng)用于包括植物在內(nèi)的多種生物的基因組編輯中。其原理是Cas9蛋白與sgRNA形成復(fù)合體，切割與sgRNA上的間隔序列(spacers)互補(bǔ)的基因組 DNA，造成雙鏈DNA損傷，隨后通過體內(nèi)的NHEJ (non-homologous end joining) 修復(fù)機(jī)制引入基因突變[1]。2013年，Cong等[2]利用靶點(diǎn)特異性的RNA (sgRNA) 將Cas9核酸酶帶到基因組上的具體靶點(diǎn)，首次實(shí)現(xiàn)了在人類和小鼠細(xì)胞中內(nèi)源基因的定點(diǎn)敲除。目前，CRISPR/Cas系統(tǒng)已經(jīng)成功在8種植物中實(shí)現(xiàn)了基因組的定點(diǎn)編輯，且在水稻中獲得了穩(wěn)定的突變體植株[3, 4]，其強(qiáng)大的基因組編輯功能得到充分體現(xiàn)。

堿性-螺旋-環(huán)-螺旋(basic-helix-loop-helix, bHLH)轉(zhuǎn)錄因子家族在動(dòng)植物中廣泛存在，其結(jié)構(gòu)域約由60個(gè)氨基酸組成，包括堿性(Basic)區(qū)域和螺旋環(huán)螺旋(HLH)區(qū)域，堿性區(qū)域位于bHLH結(jié)構(gòu)域N端，主要與DNA結(jié)合有關(guān)；HLH區(qū)域分布在bHLH的C端，主要由疏水氨基酸殘基構(gòu)成，利于HLH之間相互作用形成二聚體[5, 6]。bHLH轉(zhuǎn)錄因子堿性區(qū)域的某些氨基酸能夠與基因啟動(dòng)子區(qū)域的E-box (5′-CANNTG-3′)結(jié)合，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)[7, 8]。研究表明，水稻中至少有173個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子[9]，參與眾多代謝過程的調(diào)控，在水稻生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)建成、生物合成、信號(hào)傳導(dǎo)和抗逆性方面起著重要作用[10-12]。

作者在前期研究中發(fā)現(xiàn)，紅光處理后水稻胚乳中OsbHLH116 表達(dá)量極顯著降低。本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)水稻OsbHLH116 基因進(jìn)行編輯，通過轉(zhuǎn)化水稻，獲得了OsbHLH116 突變體，并對(duì)其突變位點(diǎn)進(jìn)行鑒定和脫靶效應(yīng)分析，以期為深入研究其功能提供實(shí)驗(yàn)材料，同時(shí)也為其他研究者利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建突變體提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

轉(zhuǎn)基因受體材料為日本晴(Oryzasativassp.japonicacv. Nipponbare)，CRISPR/Cas9載體pBUN411由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)陳其軍教授課題組惠贈(zèng)[13]。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α、T4 DNA 連接酶、PCR產(chǎn)物回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒購于北京天根生化科技有限公司。TaqMix和TA克隆試劑盒購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。硫酸卡那霉素和氨芐青霉素鈉購于上海生工生物技術(shù)有限公司。BsaⅠ和EarⅠ限制性內(nèi)切酶購于NEB (New England Biolabs)有限公司。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成(表1)。

1.2 gRNA靶點(diǎn)設(shè)計(jì)及寡核苷酸鏈合成

根據(jù)水稻生物學(xué)網(wǎng)站(http://rice.plantbiology.msu.edu/)提供的OsbHLH116 (LOC_Os12g40730)基因序列設(shè)計(jì)gRNA靶點(diǎn)序列。設(shè)計(jì)原則如下：1)選擇PAM (protospacer-adjacent motif) 序列 (NGG) 5′ 端的一段堿基序列作為原間隔序列，即敲除的靶位點(diǎn)；2)靶標(biāo)DNA必須在外顯子中，且盡量靠近所編碼蛋白質(zhì)的N′端；3) PAM 5′ 端盡量存在酶切位點(diǎn)，以方便后期突變體的檢測(cè)；4)在水稻全基因組中比對(duì)候選序列，盡量避免同源序列出現(xiàn)，防止脫靶效應(yīng)產(chǎn)生。

表1 本研究所用引物序列

Table 1. Primer sequence used in the study.

引物名稱Primername序列Sequence用途UsagesgRNA-F5'-GGCGCCTCCATCGGAGGAAGAGA-3'靶序列合成ConstructionoftargetsitesgRNA-R5'-AAACTCTCTTCCTCCGATGGAGG-3'pBUN411-VF5'-CCATGAAGCCTTTCAGGACATGTA-3'載體構(gòu)建驗(yàn)證VerificationofvectorconstructionpBUN411-VR5'-ACGCTGCAAACATGAGACGGAGAA-3'Basta-F5'-AAGCACGGTCAACTTCCGTA-3'除草劑基因驗(yàn)證VerificationofBtBasta-R5'-GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC-3'OsbHLH116-F5'-GTTGATGTGGCAAGGAGGAG-3'靶點(diǎn)兩側(cè)序列擴(kuò)增AmplificationoftargetregionOsbHLH116-R5'-TACGCACCAGACAGTTCACC-3'LOC_Os01g01380-F5'-ACAAGCAATGCAAATGTTGG-3'脫靶位點(diǎn)擴(kuò)增Off-targetamplificationLOC_Os01g01380-R5'-CTCTTCGCCCACACCATC-3'Chr4:+30193341-F5'-AATAGATCACGCCGTCAACC-3'脫靶位點(diǎn)擴(kuò)增Off-targetamplificationChr4:+30193341-R5'-CGAGACGAATCTTTTGAGCA-3'

靶點(diǎn)序列正義鏈和反義鏈的互補(bǔ)單鏈DNA設(shè)計(jì)，是在靶序列的5′ 端添加ggcg，靶序列互補(bǔ)鏈的5′ 端添加aaac，使其與質(zhì)粒經(jīng)BsaI 酶切后形成黏性互補(bǔ)末端。2條引物65℃下退火5 min形成互補(bǔ)雙鏈DNA，直接用于后續(xù)的載體構(gòu)建。

1.3 pBUN411-gRNA載體構(gòu)建

對(duì)pBUN411質(zhì)粒進(jìn)行BsaI酶切，酶切體系包括pBUN411質(zhì)粒2 μg，10×NEB緩沖液 5 μL，BsaI 10 U，加ddH2O至50 μL。酶切后加入如下連接體系：T4連接酶1 μL，10×緩沖液 1 μL，靶序列雙鏈DNA 2 μL，線性化質(zhì)粒pBUN411 6 μL。用熱擊法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，培養(yǎng)過夜后挑取單克隆，根據(jù)載體序列分別設(shè)計(jì)載體正反向引物pBUN411-VF和pBUN411-VR，對(duì)含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌進(jìn)行菌落 PCR 驗(yàn)證，選取驗(yàn)證片段大小正確的抽提質(zhì)粒并測(cè)序。

1.4 轉(zhuǎn)基因水稻陽性鑒定和突變位點(diǎn)分析

表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后侵染水稻愈傷組織，使用Nishimura等[14]報(bào)道方法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基因再生苗總DNA采用SDS法提取，利用抗除草劑(Basta)基因引物進(jìn)行轉(zhuǎn)基因陽性鑒定。以水稻陽性轉(zhuǎn)基因苗DNA為模板，OsbHLH116-F和 OsbHLH116-R為引物， PCR擴(kuò)增sgRNA靶向位點(diǎn)兩側(cè)序列，然后使用EarI進(jìn)行酶切，酶切體系包括PCR產(chǎn)物5 μg，10×NEB緩沖液5 μL，EarI 20 U，加ddH2O至50 μL。37℃下酶切過夜，使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)突變單株。將酶切檢測(cè)為突變單株的PCR產(chǎn)物直接測(cè)序初步驗(yàn)證，隨后對(duì)測(cè)序出現(xiàn)套峰單株P(guān)CR產(chǎn)物連接pUC-T載體，進(jìn)行TA克隆，隨機(jī)選取5～9個(gè)單克隆進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與基因組DNA進(jìn)行序列比對(duì)，檢測(cè)是否成功靶向水稻的OsbHLH116 基因。根據(jù)測(cè)序得到的各突變單株的DNA序列，使用BioEdit軟件[15](http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html)將編碼區(qū)核苷酸序列轉(zhuǎn)換成氨基酸序列并進(jìn)行比對(duì)；使用GeneDoc軟件[16](http://www.psc.edu/index.php/user-resources/software/genedoc)對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行編輯和描影，分析各突變單株氨基酸序列是否發(fā)生改變。

1.5 脫靶效應(yīng)分析

用gRNA靶點(diǎn)序列在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 中進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)序列比對(duì)結(jié)果，挑選3′端含有PAM序列(NGG)且PAM序列前堿基與靶點(diǎn)序列同源性較高的2個(gè)位點(diǎn)作為潛在出現(xiàn)脫靶效應(yīng)的位點(diǎn)，通過PCR擴(kuò)增這2個(gè)位點(diǎn)，然后使用EarI進(jìn)行酶切，酶切后使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsbHLH116靶位點(diǎn)的選擇和pBUN411-gRNA表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)CRISPR/Cas9靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)原則，在OsbHLH116 基因第一外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)19 bp的gRNA靶點(diǎn)序列CCTCCATCGGAGGAAGAGA，其中包含限制性內(nèi)切酶EarI識(shí)別位點(diǎn)5′…▲(N)4GAAGAG…3′，在靶序列3′端為PAM序列TGG (圖1-B)。退火形成的雙鏈互補(bǔ)靶序列與載體pBUN411連接形成重組載體pBUN411-gRNA (圖1-A)。pBUN411空載體擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1538 bp，經(jīng)BsaI酶切后連接，靶序列插入擴(kuò)增片段大小應(yīng)為360 bp，菌落PCR鑒定1、3和4號(hào)菌落片段大小與預(yù)期結(jié)果一致(圖2)，證明pBUN411-gRNA表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.2 OsbHLH116突變體的酶切鑒定

將pBUN411-gRNA表達(dá)載體利用農(nóng)桿菌導(dǎo)入粳稻品種日本晴，以抗除草劑(Basta)基因?yàn)楹Y選標(biāo)記鑒定篩選轉(zhuǎn)基因陽性植株，選擇其中10株陽性植株，在sgRNA靶向位點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增片段大小為613 bp。然后使用EarI進(jìn)行酶切，如果靶位點(diǎn)序列未發(fā)生突變，EarI酶可以將PCR產(chǎn)物全部切開，得到一條430 bp和一條183 bp的條帶(圖3中泳道1、2、7和8)，表明轉(zhuǎn)基因植株1、2、7和8沒有發(fā)生突變；如果PCR產(chǎn)物不能被EarI切開，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)為613 bp的單一條帶(圖3中泳道4、6、9和10)，表明兩條同源染色體靶標(biāo)區(qū)的EarI酶切位點(diǎn)識(shí)別序列均被破壞，EarI酶無法切割PCR產(chǎn)物，則轉(zhuǎn)基因單株為純合突變或雙等位突變；如果PCR產(chǎn)物被EarI酶切后得到3條條帶，一條為613 bp且不能被EarI酶切的突變DNA擴(kuò)增條帶，另外兩條為未突變DNA擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物EarI酶切后產(chǎn)生430 bp和183 bp的條帶(圖3中泳道3和5)，表明轉(zhuǎn)基因植株3和5為OsbHLH116雜合突變。

A-表達(dá)載體pBUN411-gRNA的LB和RB之間線性結(jié)構(gòu)。 豎線-酶切位點(diǎn)BsaⅠ； RB-T-DNA右邊界； OsU3 promoter-水稻U3啟動(dòng)子；gRNA-Sc-向?qū)NA支架； OsU3 terminator-水稻U3終止子； Ubi1 promoter-玉米泛素基因1(Ubi1)啟動(dòng)子；Cas9-Cas9基因； Nos terminator-農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶基因(Nos)終止子； 35S Promoter-花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子；Bar-抗除草劑基因； LB-T-DNA左邊界。B-gRNA靶序列互補(bǔ)雙鏈DNA。方框內(nèi)為gRNA靶點(diǎn)序列； 灰字體為EarⅠ酶切位點(diǎn)； 斜體為PAM序列(不在所構(gòu)建載體上)；小寫字體為BsaⅠ酶切后黏性互補(bǔ)末端。

A, Physical map between RB and LB of pBUN411-gRNA expression vectors. Vertical lines stand forBsaⅠ restriction sites; RB, Right border of T-DNA; OsU3 promoter, Rice U3 promoters; gRNA-Sc, Guide RNA scaffold; OsU3 terminator, Rice U3 terminators; Ubi1 promoter, Maize ubiquitin gene promoter;Cas9,Cas9 gene; Nos Terminator,Agrobacteriumtumefaciensnopaline synthase gene (Nos) terminator; 35S Promoter,Cauliflowermosaicvirus(CaMV) 35S promoter;Bar, Herbicide resistanceBargene; LB, Left border of T-DNA. B, The target sites of gRNA complementary with double-stranded DNA. The target sequences are in the box; Gray letters stand forEarⅠ restriction sites; Letters with italics stand for PAM (not in the expression vectors); The lowercase stand for sticky ends ofBsaⅠ.

圖1 pBUN411-gRNA表達(dá)載體LB和RB之間線性結(jié)構(gòu)及gRNA靶序列合成

Fig. 1. Linear structure of pBUN411-gRNA expression vectors between LB and RB and the construction of target site.

1～4-表達(dá)載體的4個(gè)菌落PCR； 5-pBUN411空載體(對(duì)照)； M-DM2000 標(biāo)記。

1-4, Four independent colonies to detect expression vectors; 5, pBUN411 empty vectors (negative contrast); M, DM2000 marker.

圖2 pBUN411-gRNA表達(dá)載體菌落PCR

Fig. 2. Verification of pBUN411-gRNA expression vectors via colony PCR.

2.3 OsbHLH116突變位點(diǎn)測(cè)序分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證OsbHLH116 突變單株，對(duì)酶切鑒定出的突變單株進(jìn)行測(cè)序分析。圖4-B中10號(hào)單株的PCR產(chǎn)物測(cè)序峰圖，起始峰圖正常，在靶序列突變位點(diǎn)附近開始出現(xiàn)套峰，表明該突變體為雙等位突變體，而未突變的7號(hào)單株(圖4-A)和4號(hào)純合突變單株(圖4-C)PCR產(chǎn)物測(cè)序峰圖正常。對(duì)雜合突變(3號(hào)和5號(hào))和測(cè)序出現(xiàn)套峰的雙等位突變(6號(hào)和10號(hào))，進(jìn)一步采用TA克隆的方法，進(jìn)行了測(cè)序再驗(yàn)證(圖5)。

綜合分析測(cè)序結(jié)果，酶切鑒定的6個(gè)植株OsbHLH116 確實(shí)發(fā)生了突變(圖5)。4號(hào)、6號(hào)、9號(hào)和10號(hào)植株為兩條同源染色體靶標(biāo)區(qū)均發(fā)生了突變，測(cè)序結(jié)果表明4號(hào)和9號(hào)為純合突變，4號(hào)植株從PAM序列前第7個(gè)堿基開始向PAM方向缺失了6個(gè)堿基“GAAGAG”，9號(hào)植株從PAM序列前第7個(gè)堿基開始向PAM方向缺失了4個(gè)堿基“GAAG”。6號(hào)和10號(hào)植株雖然兩條同源染色體靶標(biāo)區(qū)均發(fā)生了突變，但突變不一致， 6號(hào)單株一條同源染色體靶標(biāo)區(qū)的PAM前第5個(gè)堿基“A”缺失，另一條同源染色體靶標(biāo)區(qū)PAM前2個(gè)堿基“GA”缺失；10號(hào)單株一條同源染色體靶標(biāo)區(qū)在PAM前第3和第4堿基間插入1個(gè)堿基“G”，另一條同源染色體的PAM前2個(gè)堿基“GA”缺失。3號(hào)和5號(hào)為雜合突變，3號(hào)單株一條同源染色體靶標(biāo)區(qū)的PAM前第7個(gè)堿基開始向PAM方向缺失了“GAAG”，5號(hào)單株一條同源染色體靶標(biāo)區(qū)的PAM前第7個(gè)堿基開始向PAM方向缺失了4個(gè)堿基“GAAG”。 利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)OsbHLH116 基因進(jìn)行編輯，發(fā)生了堿基缺失和插入2種類型，并且堿基缺失發(fā)生的概率較大；從突變位點(diǎn)看，突變主要發(fā)生在PAM前8個(gè)堿基內(nèi)；從同源染色體突變情況看，發(fā)生了同源染色體突變一致的純合突變(4號(hào)和9號(hào))、同源染色體均突變但突變不一致的雙等位突變(6號(hào)和10號(hào))和只有一條同源染色體突變的雜合突變(3號(hào)和5號(hào))3種情況。

1-10—10株轉(zhuǎn)基因植株； WT-野生型； M-DM1000 標(biāo)記；-RE-未進(jìn)行酶切；+RE-使用EarI酶切； 箭頭示酶切后PCR片段。

1-10, 10 transgenic lines; WT, Wild type; M, DM1000 marker; -RE, PCR product without restriction enzyme digestion; +RE,EarⅠ digested PCR product; Arrowheads, PCR fragments afterEarI digested.

圖3 10株T0代轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR產(chǎn)物EarⅠ酶切分析結(jié)果

Fig. 3. Mutation analysis of 10 T0transgenic lines by EarⅠ digestion of PCR product.

2.4 OsbHLH116突變位點(diǎn)氨基酸序列分析

根據(jù)測(cè)序獲得的各突變單株OsbHLH116 CDS序列，使用BioEdit軟件翻譯成氨基酸并與野生型進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果如圖6所示。4號(hào)突變單株由于缺失“GAAGAG”6個(gè)堿基，發(fā)生了整碼突變，在62和63位置缺失了兩個(gè)谷氨酸，其余氨基酸均無改變，bHLH結(jié)構(gòu)域氨基酸序列亦無改變，因此4號(hào)植株OsbHLH116 發(fā)生的突變是否會(huì)對(duì)表型產(chǎn)生影響有待進(jìn)一步的表型觀察；6號(hào)、9號(hào)和10號(hào)突變單株缺失或插入的堿基造成了移碼突變，使翻譯均被提前終止。參考Li等[17]對(duì)OsbHLH116 基因bHLH結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)6號(hào)、9號(hào)和10號(hào)3個(gè)單株OsbHLH116 的 bHLH結(jié)構(gòu)域已受到破壞；由于3號(hào)和5號(hào)植株為雜合突變，其中一條同源染色體能夠正常翻譯蛋白，需在后繼世代突變單株中分析蛋白序列，因此本研究沒有對(duì)3號(hào)和5號(hào)植株進(jìn)行蛋白序列分析。本研究獲得的OsbHLH116 突變體雖然蛋白序列發(fā)生了改變，但是否功能喪失，仍需進(jìn)一步觀察表型進(jìn)行驗(yàn)證。

2.5 脫靶效應(yīng)位點(diǎn)分析

由于PAM序列5′ 端堿基序列決定了gRNA的特異性，因此將gRNA靶序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，獲得了與gRNA同源性較高的2個(gè)可能出現(xiàn)脫靶效應(yīng)的位點(diǎn)，分別位于基因LOC_Os01g01380內(nèi)含子區(qū)域和第4染色體基因間區(qū)+30 193 341(Chr4:30193363..30193341)。這兩個(gè)位點(diǎn)在緊鄰PAM序列的5′ 端均有11～12個(gè)堿基的同源序列(圖7)。通過PCR擴(kuò)增脫靶位點(diǎn)序列，使用EarI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切分析脫靶情況(圖8)。圖8-A示基因LOC_Os01g01380擴(kuò)增脫靶位點(diǎn)擴(kuò)增片段大小為597 bp，10株轉(zhuǎn)基因苗的PCR產(chǎn)物被全部酶切形成371 bp 和226 bp大小的片段，表明未發(fā)生脫靶；圖8-B表明位點(diǎn)第4染色體+30 193 341靶序列擴(kuò)增出557 bp的PCR產(chǎn)物均被酶切為大小為295 bp和 262 bp的小片段，表明該位置也未發(fā)生脫靶。

下劃線-PAM序列TGG； 箭頭-DNA預(yù)期被切割處； 方框—套峰。A-7號(hào)未突變單株P(guān)CR產(chǎn)物測(cè)序峰； B-10號(hào)雙等位突變單株P(guān)CR產(chǎn)物測(cè)序峰； C-4號(hào)純合突變單株P(guān)CR產(chǎn)物測(cè)序峰。

Underlines stand for PAM (TGG); The arrows stand for the intended cleavage site; The double peak phenomenon is in the box. A, Sanger sequencing results for PCR products of non-mutation number 7 ; B, Sanger sequencing results for PCR products of biallelic mutation number 10; C, Sanger sequencing results for PCR products of homozygous mutation number 4.

圖4 4號(hào)、7號(hào)和10號(hào)單株P(guān)CR產(chǎn)物測(cè)序峰圖

Fig.4. Sanger sequencing results for PCR products of number 4, 7 and 10.

3 討論

基因定點(diǎn)編輯是研究基因功能的重要手段之一，鋅指核酸酶(ZFNs)和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(TALENs)能夠使DNA的靶位點(diǎn)產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂進(jìn)而實(shí)現(xiàn)基因組定點(diǎn)編輯[18, 19]。但ZFN制備復(fù)雜，成本昂貴，而TALENs對(duì)每一個(gè)基因位點(diǎn)的編輯都需要重新設(shè)計(jì)、合成和組裝2個(gè)核酸酶，載體構(gòu)建復(fù)雜，技術(shù)難度大，這也制約了其應(yīng)用。2013年，一種全新的基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9出現(xiàn)，只需合成一個(gè)sgRNA就能實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的特異性修飾，操作簡(jiǎn)單，成本低，作用高效[20]。目前在水稻中，利用CRISPR/Cas9技術(shù)已對(duì)OsBADH2、OsPDS[4]、OsLAZY1[3]和OsMYB1[21]等多個(gè)基因?qū)崿F(xiàn)了定點(diǎn)編輯且得到了穩(wěn)定遺傳的突變植株。本研究基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)，從水稻OsbHLH116 基因靶位點(diǎn)的選擇，CRISPR/Cas9表達(dá)載體的構(gòu)建、突變位點(diǎn)和脫靶位點(diǎn)的分析，系統(tǒng)闡述了利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建OsbHLH116 基因突變體和驗(yàn)證方法，為研究OsbHLH116 基因功能奠定了材料基礎(chǔ)，同時(shí)也為其他研究者利用CRISPR/Cas9構(gòu)建突變體材料提供了技術(shù)參考。

藍(lán)色字體-gRNA靶序列； 黃色高亮-PAM序列； 紅色刪除線-缺失堿基； 紅色小寫字體-插入堿基； -表示缺失；+表示插入；(0/0)-PCR產(chǎn)物測(cè)序。

The gRNA target site is shown in blue; The yellow highlighting denote PAM; Red dashes deleted bases; Insertion nucleotides are shown in red lowercases; -, Deletion; +, Insertion； (0/0)-Sequencing by using PCR product.

圖5 野生型與6株突變體突變位點(diǎn)序列比對(duì)

Fig. 5. DNA sequence alignment of wild type with six mutant versions.

藍(lán)色直線和方框-堿性-螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域； 紅色高亮-氨基酸缺失； 黃色高亮-翻譯終止。

Blue lines and boxes denote basic-helix-loop-helix domain; The red highlighting denote amino acid deletion; The yellow highlighting denote translation termination.

圖6 野生型與株突變體氨基酸序列比對(duì)

Fig.6. Comparison of the amino acid sequences between wild type and OsbHLH116 mutants.

方框內(nèi)為PAM (NGG) 序列，紅色字體為與靶序列比對(duì)不匹配堿基。

The PAM motif (NGG) is marked by black box; Mismatching bases are shown in red color.

圖7 推定的脫靶位點(diǎn)序列與靶位點(diǎn)序列比對(duì)分析

Fig. 7. Sequences comparative analysis between the putative off-target sites and target sites.

1～10-10株轉(zhuǎn)基因植株； WT-野生型； M-DM1000 標(biāo)記； -RE-未進(jìn)行酶切； +RE-使用EarI酶切； 箭頭-酶切后PCR片段。A-基因LOC_Os01g01380脫靶位點(diǎn)酶切鑒定； B-Chr4:+30193341脫靶位點(diǎn)酶切鑒定。

1-10, 10 transgenic lines; WT, Wild type; M, DM1000 Marker; -RE, PCR product without restriction enzyme digestion; +RE,EarI digested PCR product; Arrowheads, PCR fragments afterEarI digestion. A, PCR/RE assay to detect off-target of LOC_Os01g01380; B, PCR/RE assay to detect off-target of Chr4: +30 193 341.

圖8 10株T0代轉(zhuǎn)基因植株脫靶位點(diǎn)酶切驗(yàn)證

Fig. 8. PCR/ restriction enzyme (PCR/RE) assay to detect off-target of 10 plants of T0transgenic lines.

本研究采用限制性核酸內(nèi)切酶和測(cè)序相結(jié)合的方法來篩選鑒定突變體。Jinek等[22]證明CRISPR系統(tǒng)主要使靶DNA的PAM序列上游3～8 bp處形成雙鏈斷裂，當(dāng)靶位點(diǎn)被切割后，相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列會(huì)被破壞，以此來檢測(cè)DNA靶標(biāo)是否被切割。由于酶切位點(diǎn)序列多為4～6 bp，應(yīng)用此方法可篩選大部分突變單株，但如果突變位點(diǎn)發(fā)生在酶切位點(diǎn)之外，就有可能發(fā)生漏判。限制性內(nèi)切酶酶切PCR產(chǎn)物時(shí)，如果PCR產(chǎn)物濃度過高，上樣量過大或者酶切時(shí)間較短而導(dǎo)致酶切不完全，可能會(huì)造成部分PCR產(chǎn)物未被切割而形成雜合子突變的假象造成誤判。因此也可采用Surveyor酶切法[23]或T7E1酶切法[24]來檢測(cè)CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯效果，這兩種酶均可識(shí)別雙鏈DNA中的錯(cuò)配堿基。但對(duì)于純合突變，二者可能無法有效識(shí)別，另外T7E1酶除了能識(shí)別錯(cuò)配堿基外，還能識(shí)別十字型結(jié)構(gòu)DNA、交叉DNA和異源雙鏈DNA等，可能導(dǎo)致假陽性的出現(xiàn)。因此，本研究中將酶切法與測(cè)序相結(jié)合，高效、準(zhǔn)確地對(duì)突變體進(jìn)行了篩選鑒定，避免了以上問題的出現(xiàn)。

sgRNA的前導(dǎo)序列與基因組上的靶標(biāo)序列直接結(jié)合來確定Cas9切割的部位，因而PAM序列前14個(gè)堿基主要負(fù)責(zé)CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特異性[1]，因此在基因編輯過程中可能存在一定程度的脫靶效應(yīng)。研究表明，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物中脫靶效應(yīng)并不嚴(yán)重。張鋒課題組通過全基因組測(cè)序和對(duì)可能脫靶位點(diǎn)的測(cè)序分析在擬南芥中未檢測(cè)到任何的脫靶效應(yīng)[25]。Zhang等[26]在水稻中對(duì)3個(gè)靶基因的11個(gè)潛在脫靶效應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行了檢測(cè)，僅有1個(gè)靶基因的1個(gè)脫靶位點(diǎn)檢測(cè)到了不到1/10的突變。鑒于存在潛在的脫靶效應(yīng)，本研究選擇了與PAM序列5′端11～12個(gè)堿基同源性較高的2個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了酶切驗(yàn)證，在這兩個(gè)位點(diǎn)均未檢測(cè)到脫靶效應(yīng)的產(chǎn)生，表明本研究中CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的靶點(diǎn)序列特異性較高。雖未檢測(cè)出脫靶效應(yīng)，但后續(xù)仍需對(duì)構(gòu)建的獨(dú)立基因敲除個(gè)體進(jìn)行表型等綜合分析和評(píng)判，以避免其他可能出現(xiàn)的脫靶效應(yīng)產(chǎn)生干擾。如需要更全面準(zhǔn)確地尋找脫靶位點(diǎn)，可通過全基因組測(cè)序的方法進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于脫靶產(chǎn)生的突變位點(diǎn)可通過與親本多次回交的方法進(jìn)行去除，其分離產(chǎn)生的含有脫靶位點(diǎn)突變的基因敲除個(gè)體還可作為其他突變材料加以研究和利用。

OsbHLH116 基因?qū)儆赽HLH家族的轉(zhuǎn)錄因子，作者前期研究中發(fā)現(xiàn)，紅光處理后胚乳中OsbHLH116 表達(dá)量極顯著降低(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。Li等[27]通過聚類分析推測(cè)OsbHLH116 功能和光敏色素互作因子OsPIL12 (OsbHLH103) 功能相近。Gu等[28]將強(qiáng)種殼休眠的雜草稻SS18-2中的主效休眠QTLqSD12定位在標(biāo)記間距小于75 kb的區(qū)段內(nèi)，預(yù)測(cè)OsbHLH116 等9個(gè)基因?yàn)楹蜻x基因。本研究基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)水稻OsbHLH116 基因進(jìn)行了定向編輯并得到了相應(yīng)突變體，這為深入研究OsbHLH116 在水稻生長(zhǎng)發(fā)育中的功能提供材料。

[1] Wiedenheft B, Sternberg S H, Doudna J A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea.Nature, 2012, 482(7385): 331-338.

[2] Cong L, Ran F A, Cox D, et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.Science, 2013, 339(6121): 819-823.

[3] Miao J, Guo D, Zhang J, et al. Targeted mutagenesis in rice using CRISPR-Cas system.CellRes, 2013, 23(10): 1233.

[4] Shan Q, Wang Y, Li J, et al. Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system.NatBiotechnol, 2013, 31(8): 686-688.

[5] Atchley W R, Terhalle W, Dress A. Positional dependence, cliques, and predictive motifs in the bHLH protein domain.JMolEvol, 1999, 48(5): 501-516.

[6] Nesi N, Debeaujon I, Jond C, et al. TheTT8 gene encodes a basic helix-loop-helix domain protein required for expression ofDFRandBANgenes inArabidopsissiliques.PlantCell, 2000, 12(10): 1863-1878.

[8] Massari M E, Murre C. Helix-loop-helix proteins: Regulators of transcription in eucaryotic organisms.MolCellBiol, 2000, 20(2): 429-440.

[9] Pires N, Dolan L. Origin and diversification of basic-helix-loop-helix proteins in plants.MolBiolEvol, 2010, 27(4):862-874.

[10]Komatsu K, Maekawa M, Ujiie S, et al. LAX and SPA: Major regulators of shoot branching in rice.PNAS, 2003, 100(20): 11765-11770.

[11]Sakamoto W, Ohmori T, Kageyama K, et al. The Purple leaf (Pl) locus of rice: The Plw allele has a complex organization and includes two genes encoding basic helix-loop-helix proteins involved in anthocyanin biosynthesis.PlantCellPhysiol, 2001, 42(9): 982-991.

[12]Seo J S, Joo J, Kim M J, et al. OsbHLH148, a basic helix-loop-helix protein, interacts with OsJAZ proteins in a jasmonate signaling pathway leading to drought tolerance in rice.PlantJ, 2011, 65(6): 907-921.

[13]Xing H, Dong L, Wang Z, et al. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants.BMCPlantBiol, 2014, 14(1): 327.

[14]Nishimura A, Aichi I, Matsuoka M. A protocol forAgrobacterium-mediated transformation in rice.NatProtoc, 2006, 1(6): 2796-2802.

[15]Hall T A. BioEdit: A user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT.NuclAcidsSymposSer, 1999, 41: 95-98.

[16]Nicholas K B, Nicholas H, Deerfield D W. GeneDoc: Analysis and visualization of genetic variation.EmbnewNews, 1997, 4: 1-4.

[17]Li X, Duan X, Jiang H, et al. Genome-wide analysis of basic/helix-loop-helix transcription factor family in rice andArabidopsis.PlantPhysiol, 2006, 141(4): 1167-1184.

[18]Carroll D, Morton J J, Beumer K J, et al. Design, construction and in vitro testing of zinc finger nucleases.NatProtoc, 2006, 1(3): 1329-1341.

[19]Li T, Liu B, Spalding M H, et al. High-efficiency TALEN-based gene editing produces disease-resistant rice.NatBiotechnol, 2012, 30(5): 390-392.

[20]Mussolino C, Cathomen T. RNA guides genome engineering.NatBiotechnol, 2013, 31(3): 208-209.

[21]Mao Y, Zhang H, Xu N, et al. Application of the CRISPR-Cas system for efficient genome engineering in plants.MolPlant, 2013, 6(6): 2008.

[22]Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.Science, 2012, 337(6096): 816-821.

[23]Ran F A, Hsu P D, Lin C, et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.Cell, 2013, 154(6): 1380-1389.

[24]Zhou H, Liu B, Weeks D P, et al. Large chromosomal deletions and heritable small genetic changes induced by CRISPR/Cas9 in rice.NuclAcidsRes, 2014, 42(17): 10903-10914.

[25]Feng Z, Mao Y, Xu N, et al. Multigeneration analysis reveals the inheritance, specificity, and patterns of CRISPR/Cas-induced gene modifications inArabidopsis.ProcNatlAcadSci, 2014, 111(12): 4632-4637.

[26]Zhang H, Zhang J, Wei P, et al. The CRISPR/Cas9 system produces specific and homozygous targeted gene editing in rice in one generation.PlantBiotechnolJ, 2014, 12(6): 797-807.

[27]Li X, Duan X, Jiang H, et al. Genome-wide analysis of basic/helix-loop-helix transcription factor family in rice andArabidopsis.PlantPhysiol, 2006, 141(4): 1167-1184.

[28]Gu X, Liu T, Feng J, et al. The qSD12 underlying gene promotes abscisic acid accumulation in early developing seeds to induce primary dormancy in rice.PlantMolBiol, 2010, 73(1-2): 97-104.

CRISPR/Cas9 System-based Editing ofOsbHLH116 Gene and Its Off-target Effect Analysis

DU Yan-xiu, JI Xin, CHEN Hui-jie, PENG Ting, ZHANG Jing, LI Jun-zhou, SUN Hong-zheng, ZHAO Quan-zhi*

(AgronomyCollege，HenanAgriculturalUniversity/CollaborativeInnovationCenterofHenanGrainCrops/HenanKeyLaboratoryofRiceBiology,Zhengzhou450002,China;*Correspondingauthor,E-mail:qzzhaoh@126.com)

WithOsbHLH116 as the editable object, the 19-bp sgRNA was designed in the exon 1 site according to the coding sequence (CDS) and the oligonucleotides of sgRNA were chemically synthesized and inserted into linearized plasmid pBUN411. The transgenic lines were obtained byAgrobacterium-mediated transformation method. Identification of mutants and off-target effects analysis ofOsbHLH116 were conducted by combing restriction enzyme digestion with sequencing. The results showed that the recombinant vector of pBUN411-gRNA succeeded in oriented editing ofOsbHLH116. The restriction enzyme analysis results indicated that we got 6 mutants from 10 randomly selected transgenic lines. Sequence analysis of the six mutants indicated that homozygous mutation, biallelic mutation and heterozygous mutation occured. After searching the rice genome using the target sequence with PAM, two highly identical sites were found. However, we did not observe any mutation at these sites by restriction enzyme.

rice; gene editing; CRISPR/Cas9; off-target effects;OsbHLH116

2016-02-19； 修改稿收到日期: 2016-06-03。

河南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目(S2012-04-02)。

Q755； S511.01

A

1001-7216(2016)06-0577-10

杜彥修，季新，陳會(huì)杰，等. 基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的OsbHLH116基因編輯及其脫靶效應(yīng)分析. 中國(guó)水稻科學(xué)， 2016， 30(6)： 577-586.