山海丹牌野菊花注射液特征圖譜分析

劉嘉澍，張國躍，羅定強(qiáng)，宋莉，惠選柱

(1.陜西省食品藥品檢驗(yàn)所，陜西 西安 710065；2.陜西醫(yī)藥控股集團(tuán)山海丹醫(yī)藥有限責(zé)任公司，陜西 西安 710065)

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山海丹牌野菊花注射液特征圖譜分析

劉嘉澍1，張國躍1，羅定強(qiáng)1，宋莉1，惠選柱2

(1.陜西省食品藥品檢驗(yàn)所，陜西 西安 710065；2.陜西醫(yī)藥控股集團(tuán)山海丹醫(yī)藥有限責(zé)任公司，陜西 西安 710065)

目的 建立山海丹牌野菊花注射液中有效成分的含量測(cè)定及特征圖譜研究方法，對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行控制。方法 采用高效液相色譜法(HPLC)梯度洗脫，流動(dòng)相:乙腈-0.5%磷酸溶液，梯度洗脫，流速:1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長326 nm，以木犀草苷為參照峰計(jì)算其共有峰的相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果 標(biāo)記8個(gè)吸收值較大的共有峰，9批供試品中S峰與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品峰相對(duì)應(yīng)，其余特征峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.6%。結(jié)論 該特征圖譜方法可行，可用于該廠家野菊花注射液的質(zhì)量控制。

野菊花注射液；高效液相色譜法；特征圖譜

野菊花注射液，其組方為單味藥野菊花。具有清熱解毒的功效，用于治療外感熱病、目赤腫痛、咽喉疼痛；上呼吸道感染、急性扁桃體炎屬熱毒上攻等。因該品種所對(duì)病癥較為常見且中藥注射液存在高風(fēng)險(xiǎn)性，故在質(zhì)量控制方面應(yīng)更加嚴(yán)格。野菊花注射液原標(biāo)準(zhǔn)為國家藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)(試行)WS-11041(ZD-1041)-2002于2002年提出，其中僅用高效液相方法對(duì)綠原酸進(jìn)行含量測(cè)定，專屬性較差。李曉波等[1]用氣相氣譜法對(duì)該制劑中的揮發(fā)性成分進(jìn)行研究，建立指紋圖譜且已有文獻(xiàn)報(bào)告。但尚未見相應(yīng)的高效液相色譜法(HPLC)的研究。鑒于液相方法同樣具有較強(qiáng)的專屬性且簡(jiǎn)單易操作，故本研究采用HPLC法對(duì)9批野菊花注射液的特征圖譜進(jìn)行研究，監(jiān)測(cè)了野菊花中綠原酸、蒙花苷、木犀草苷、咖啡酸等成分，以木犀草苷為參照物，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間，以初步達(dá)到藥品質(zhì)量控制的目的。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 電子分析天平，型號(hào)：Sartorius公司 BP211D，BS224S，AE240；高效液相色譜儀：型號(hào)：島津LC-20AD高效液相色譜儀(PDA檢測(cè)器)Empower色譜工作軟件。

1.2 試劑 乙腈為色譜純，其他為分析純，水為去離子水。

1.3 樣品 綠原酸(批號(hào)：110753-201314)、蒙花苷(批號(hào)：111528-200606)、木犀草素(批號(hào)：111520-200504)、木犀草苷(批號(hào)：111720-200905)、咖啡酸(批號(hào)：110885-200102)對(duì)照品均由中國食品藥品檢定研究院提供；野菊花注射液樣品由陜西醫(yī)藥控股集團(tuán)山海丹醫(yī)藥有限責(zé)任公司(批號(hào)：15020028，15020027，15020026，14090012，14090011，14090010，15030034，15030035，15030033)提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(Agilent C18，250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：A相為乙腈，B相為0.5%冰醋酸溶液，梯度洗脫，流動(dòng)相變化比例見表1，檢測(cè)波長：326 nm，流速：1.0 mL×min-1，柱溫：35 ℃，進(jìn)樣體積：10 μL。理論板數(shù)：理論板數(shù)以綠原酸峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000[2-3]。

表1 流動(dòng)相比例

2.2 供試品溶液的制備 直接取樣品適量，用微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。

2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取綠原酸13.58 mg，蒙花苷16.04 mg，木犀草苷9.82 mg，咖啡酸對(duì)照品8.24 mg，分別置于100 mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，再精密量取25 mL置50 mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，制成濃度分別為67.91.0、16.04、9.82、8.24 mg·L-1的混合對(duì)照品溶液。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液(批號(hào)：14090010)，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色圖譜。結(jié)果表明，各色譜圖中8個(gè)共有峰保留時(shí)間RSD均<0.25%、峰面積RSD均<2.56%，故該方法精密度良好，符合特征圖譜的要求，見表2，3。

表2 精密度保留時(shí)間結(jié)果/min

表3 精密度峰面積結(jié)果/μV·s-1

表4 穩(wěn)定性保留時(shí)間結(jié)果/min

表5 穩(wěn)定性峰面積結(jié)果/μV·s-1

2.4.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 對(duì)同一批供試品(批號(hào)：14090010)取樣6份，照前述供試品制備方法制成供試品溶液，同法測(cè)定，測(cè)得RSD值為1.12%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液，于室溫下放置，分別在0、3、6、9、12、18、24 h進(jìn)樣分析，記錄各色圖譜。結(jié)果表明，各色譜圖中8個(gè)共有峰保留時(shí)間均RSD<0.33%、均峰面積RSD<2.74%，故該方法在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，符合特征圖譜的要求，見表4，5。

3 結(jié)果

3.1 特征峰的確定 取野菊花注射液9批供試品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，對(duì)得到的色譜圖進(jìn)行特性圖譜的研究。共確認(rèn)了9個(gè)色譜峰。通過比對(duì)保留時(shí)間和紫外吸收?qǐng)D譜的方法，指認(rèn)了4個(gè)色譜峰，分別為1號(hào)峰為綠原酸，3號(hào)峰為咖啡酸，4號(hào)峰為木犀草苷，8號(hào)峰為蒙花苷。如圖1所示。選擇8個(gè)共有峰中保留時(shí)間適中，且為檢測(cè)指標(biāo)性成分的木犀草苷峰作為S峰，保留時(shí)間為40.08 min。

注：1.綠原酸；3.咖啡酸；4.木犀草苷；8.蒙花苷。

圖1 混合對(duì)照溶液及樣品圖譜

3.2 特征圖譜的建立[4]選擇8個(gè)共有峰中保留時(shí)間適中，且為檢測(cè)指標(biāo)性成分的木犀草苷峰作為S峰。供試品圖譜與木犀草苷對(duì)照色譜峰進(jìn)行比較，其中4號(hào)峰，即S峰應(yīng)與木犀草苷色譜峰保留時(shí)間(40.08 min)一致，并計(jì)算其他7個(gè)共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間，要求分離度不小于1.5。結(jié)果見表6及圖2。

圖2 不同批次樣品圖譜比較

4 結(jié)論

因此次樣品收集量較少且均為同一廠家，故僅對(duì)不同批次樣品進(jìn)行比較批間差異。利用指紋圖譜系統(tǒng)比較得9批供試品圖譜相似度均大于0.98，得出該制劑批間差異小，質(zhì)量較為穩(wěn)定。

5 討論

實(shí)驗(yàn)開始前，在國家藥監(jiān)局網(wǎng)站上查詢發(fā)現(xiàn)，野菊花注射液生產(chǎn)廠家有三家，除本實(shí)驗(yàn)中所選用廠家外，僅有江西一家廠家仍在生產(chǎn)，但樣品收集存在困難，故僅分析了一個(gè)廠家的樣品，分析其批間質(zhì)量差異，針對(duì)該廠家樣品進(jìn)行初步質(zhì)量方法的建立。

在野菊注射液中，綠原酸，蒙花苷，木犀草素，木犀草苷，咖啡酸為原料野菊花的主要活性成分[5-7]，根據(jù)5種成分的UV光譜的特征吸收，從野菊花注射液供試品DAD圖譜中提取不同波長下的色譜圖進(jìn)行比較，結(jié)果表明，326 nm下得到的色譜基線平穩(wěn)，并兼顧各個(gè)成分檢測(cè)靈敏度，且有較大的吸收值，因此選為測(cè)定波長為326 nm。

實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)供試品中綠原酸峰與另一色譜峰極性相似，猜測(cè)為綠原酸的同系物，分離度不高，故調(diào)整流動(dòng)相比例后發(fā)現(xiàn)，在乙腈∶0.1%磷酸比例為15∶85時(shí)分離度可達(dá)2.1，分離度較好。

[1] 李曉波，譚曉杰，賈英，等.野菊花注射液的GC指紋圖譜[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007,24(9)：556-559.

[2] 林麗美，李春，劉塔斯，等.野菊花藥材HPLC指紋圖譜[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2012,18(22):120-123.

[3] 陶君彥，張曉昱，黃志軍，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定木瓜中綠原酸、咖啡酸的含量[J].中國藥房，2007,18(12)：912-914.

[4] 耿家玲，王祥紅，田潤濤，等.燈盞花素注射液HPLC特征圖譜研究[J].藥物分析雜志，2011,31(8)：1511-1513.

[5] 郭巧生，房海靈，申海進(jìn).不同產(chǎn)地野菊花中綠原酸、咖啡酸和蒙花苷含量[J].中國中藥雜志，2010,35(9)：1160-1163.

[6] 劉婷娜，朱恩圓，侴桂新等.野菊花高效液相色譜指紋圖譜及質(zhì)量評(píng)價(jià)方法的建立[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2009，20(4)：823-825.

[7] 郭巧生，房海靈，申海進(jìn).不同產(chǎn)地野菊花中綠原酸、咖啡酸和蒙花苷含量[J].中國中藥雜志，2010,35(9)：1160-1163.

Specific chromatograms of shanhaidan yejuhua injection by HPLC

LIU Jiashu，ZHANG Guoyue，LUO Dingqiang，et al

(ShaanxiInstituteforFoodandDrugControl，Xi′an,Shaanxi710065,China)

Objective To establish a method for the determination of the content and the study on the feature map of the active ingredients in Shanhaidan Yejuhua Injection,and to study its quality control.Methods HPLC Gradient elution was used with the mobile phase of acetonitrile-0.5% phosphate.The flow rate was set at 1.0 mL·min-1and the detection wavelength was 326nm.The relative retention time was calculated with galuteolin as the reference peak.Results A total of 8 larger absorption values were marked,and the S peak of the 9 batches was correspondent to the standard control.The relative retention time of the other characteristic peaks was less than 0.6%.Conclusions The method is feasible,and can be used for the quality control of shanhaidan yejuhua injection in the factory.

Yejuhua injection;HPLC;Specific chromatograms

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.10.016

2016-05-17，

2016-08-05)