水蛭素對肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞抑制作用機(jī)制探討

李先建 何劍波 陳闖 黃山 連芳 趙蔭農(nóng) 鄔國斌

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC，簡稱肝癌）是最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率位居惡性腫瘤第五位［1，2］。目前盡管有許多治療肝癌的方法，但肝癌患者的預(yù)后仍較差［3］。因此，探索新的治療方法尤為必要。水蛭素是從水蛭中分離出的多肽類蛋白，具有抗血栓作用，臨床上常用于治療心腦血管疾?。?-5］。近年研究顯示水蛭素具有抗腫瘤作用，可抑制多種癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移［6-8］。然而水蛭素對肝癌HepG2細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其對肝癌HepG2細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子（vascularendothelialgrowth factor，VEGF）表達(dá)量的影響報(bào)道較少，本研究主要觀察水蛭素對肝癌HepG2細(xì)胞生物學(xué)影響，并探討其初步機(jī)制，以期為水蛭素治療肝癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

肝癌HepG2細(xì)胞株購于中科院上海細(xì)胞研究所。血清和RPMI-1640培養(yǎng)基購自HyClone公司。水蛭素由南寧市凈血皇生物工程有限公司贊助。凋亡試劑盒、基質(zhì)膠購自BD公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒購自Toyobo公司。Western blot設(shè)備購自Bio Rad公司。VEGF抗體購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 肝癌HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)、傳代。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖活性 取對數(shù)生長期的肝癌HepG2細(xì)胞，0.05%胰蛋白酶消化、1000 r/min離心5 min，PBS洗滌3次，加于含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔約5 000個細(xì)胞，培養(yǎng)24 h。以不同濃度水蛭素（1 U/mL、2 U/mL、4 U/mL、8 U/mL）培養(yǎng)液作用于肝癌 HepG2 細(xì)胞，另設(shè)空白對照組。各組分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，加入MTT溶液20 μL，培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，再加入150μLDMSO，室溫振蕩混勻10 min，選490 nm波長，在酶標(biāo)儀上測定OD值。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)3個復(fù)孔，重復(fù)3次。計(jì)算抑制率，抑制率（%）=［1-（實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值）］×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率 取對數(shù)生長期的肝癌HepG2細(xì)胞懸液接種于6孔板，每孔2×105個細(xì)胞。培養(yǎng)24 h后加入含不同濃度水蛭素（1 U/mL、2 U/mL、4 U/mL、8 U/mL）的培養(yǎng)液，作用 48 h 后，0.05%胰蛋白酶消化、1000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，PBS洗滌3次，制成單細(xì)胞懸液。按PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I說明書操作，上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)3個復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.2.4 Transwell法檢測細(xì)胞遷移、侵襲 取上述單細(xì)胞懸液，在下室加入600 μL含10%胎牛血清培養(yǎng)基，上室加入150 μL 細(xì)胞懸液，約1×105個細(xì)胞，培養(yǎng)12 h。用鑷子取出小室，吸出上室液體，用甲醇室溫固定30 min，姬姆薩染色20 min。侵襲實(shí)驗(yàn)在上室加入60 μL基質(zhì)膠（用RPMI-1640按1∶6稀釋），其余步驟同細(xì)胞遷移。顯微鏡下每個小室隨機(jī)選取5個視野（×100）計(jì)數(shù)。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)3復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.2.5 熒光定量PCR檢測VEGF mRNA的表達(dá) 取上述單細(xì)胞懸液，加入1 mL TRIzol試劑，按TRIzol試劑說明書提取總RNA，檢測RNA的含量和純度。按ReverTra Ace qPCR RT kit說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物按照THUNDERBIRD qPCR Mix說明書進(jìn)行熒光定量PCR。β-actin作為內(nèi)參，引物由TAKALA合成。VEGF上游引物為AACCATGAACTTTCTGCTGTCTTG，下游引物為TTCACCACTTCGTGATGATTCTG。β-actin上游引物為GAGGCCCAGAGCAAGAGAGG，下游引物為TACATGGCTGGGGTGTTGAA。反應(yīng)條件：95°C 預(yù)變性 2 min，95°C 變性 15 s，60°C 退火并延伸30 s，共40個循環(huán)。數(shù)據(jù)采用ABI 7300 SDS Software分析。相對 mRNA 表達(dá)=2-△△Ct，△△Ct值=［水蛭素組靶基因Ct值-水蛭素組β-actin Ct值］-［對照組靶基因Ct值-對照組β-actin Ct值］。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)3個復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.2.6 Western blot法檢測VEGF蛋白的表達(dá) 取上述單細(xì)胞懸液，加入RIPA裂解液提取總蛋白，通過BCA法測定并調(diào)整樣本蛋白含量。取50 μg蛋白上樣，10%SDS-PAGE凝膠分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜。含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h，4°C孵育一抗12 h。室溫孵育二抗1 h，TBST洗滌3次，用ECL顯色。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)3個復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多樣本比較采用單因素方差分析，組間比較用t′或t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 水蛭素對肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響

MTT檢測結(jié)果顯示，不同濃度水蛭素組及其不同作用時間的細(xì)胞增殖率與空白對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且同一時間不同濃度各組間細(xì)胞增殖率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），同一濃度不同時間各組間的細(xì)胞增殖率差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說明水蛭素能抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖，抑制率隨水蛭素濃度增加及作用時間延長而增加，呈劑量-時間依賴效應(yīng)。

表1 不同濃度水蛭素不同作用時間對肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響［（±s）%］

表1 不同濃度水蛭素不同作用時間對肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響［（±s）%］

空白對照組：0 U/ml；-：無數(shù)據(jù)。

水蛭素濃度（U/mL） 24 h 48 h 72 h空白對照組 - - -1 6.52±0.29 26.66±1.23 53.31±2.89 2 9.82±0.60 36.22±1.55 75.06±2.74 4 18.96±1.07 46.31±1.74 84.86±1.7 8 34.35±1.28 77.61±2.49 88.21±1.10

2.2 水蛭素對肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，2 U/mL、4 U/mL、8 U/mL濃度組作用48 h后細(xì)胞凋亡率分別為（28.37±1.16）%、（40.27±0.97）%、（76.17±1.5）%，與空白對照組的（1.98±0.35）%比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），不同濃度組間細(xì)胞凋亡率差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.02，P＜0.001）。說明水蛭素能誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡率隨藥物濃度增加而增加。見圖1。

圖1 不同濃度水蛭素作用48 h后對肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響

2.3 水蛭素對肝癌HepG2細(xì)胞遷移、侵襲的影響

Transwell結(jié)果顯示，2 U/mL、4 U/mL、8 U/mL 濃度組作用48 h后細(xì)胞遷移個數(shù)分別為（204±9）個、（163±6）個和（94±4）個，與空白對照組的（323±6）個比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），不同濃度組間細(xì)胞遷移個數(shù)比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=293，P＜0.001）。2 U/mL、4 U/mL、8 U/mL濃度組作用48 h后的細(xì)胞侵襲個數(shù)分別為（86±5）個、（54±7）個和（20±5）個，與空白對照組的（164±6）個比較，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），不同濃度組間的細(xì)胞侵襲個數(shù)比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=143，P＜0.001）。說明水蛭素能抑制肝癌HepG2細(xì)胞遷移、侵襲，其抑制作用隨濃度的增加而增加。見圖2、圖3。

2.4 水蛭素對肝癌HepG2細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)量的影響

熒光定量PCR結(jié)果顯示，不同濃度（2U/mL、4U/mL、8 U/mL）水蛭素作用于肝癌HepG2細(xì)胞48 h后VEGF mRNA表達(dá)量與空白對照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且不同濃度組間 VEGF mRNA表達(dá)量差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=215，P＜0.001），說明水蛭素能抑制VEGF mRNA的表達(dá)，VEGF mRNA表達(dá)量隨藥物濃度增加而下調(diào)。見圖4。

圖2 不同濃度水蛭素作用48 h后對肝癌HepG2細(xì)胞遷移的影響

圖4 不同濃度水蛭素作用48 h后對肝癌HepG2細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)量的影響

2.5 水蛭素對肝癌HepG2細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)量的影響

Western blot結(jié)果顯示，不同濃度（2 U/mL、4U/mL、8 U/mL）水蛭素作用于肝癌HepG2細(xì)胞48 h后，VEGF蛋白表達(dá)量下降，且呈劑量依賴性下調(diào)。見圖5。

圖5 不同濃度水蛭素作用48 h后對肝癌HepG2細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)量的影響

3 討論

肝癌是我國常見的惡性腫瘤，因其病程隱匿，大部分患者就診時已屬中晚期，療效較差。水蛭素是從水蛭中分離出來的多肽類蛋白。張娟等［6］報(bào)道水蛭有抗腫瘤作用，可抑制、破壞癌瘤生長，此外還有抗高凝作用，有利于抗癌藥及免疫活性細(xì)胞侵入癌組織而殺傷癌細(xì)胞。近年的研究顯示，水蛭素能抑制TRAMP小鼠前列腺癌的生長，可使腫瘤體積縮?。?］。張博等［8］研究顯示，水蛭素能抑制S180瘤細(xì)胞小鼠移植瘤生長，取移植瘤組織檢測發(fā)現(xiàn)VEGF表達(dá)量下調(diào)。姚娓等［9］的研究結(jié)果也證明水蛭素能抑制肝癌H22荷瘤小鼠腫瘤的生長。VEGF是一種多功能細(xì)胞因子，可誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)和絲裂原活化的蛋白激酶（MAPK）途徑，完成促增殖作用；同時也可誘發(fā)PI-3KAKT/PKB途徑，發(fā)揮抗凋亡作用。許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在腫瘤細(xì)胞中，VEGF信號傳導(dǎo)通路對其生存、遷移和侵襲至關(guān)重要［10，11］。國外研究表明，VECF 在HCC 中高表達(dá)，腫瘤組織中VEGF高表達(dá)的HCC更易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移［12，13］。研究顯示VEGF沉默能抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且降低肝癌血管生成是通過VEGF/PI3K/AKT通路滅活［14］。然而水蛭素對肝癌HepG2細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其對肝癌HepG2細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子的影響很少報(bào)道。因此本文以肝癌HepG2細(xì)胞株為體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，探討水蛭素對肝癌HepG2細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及機(jī)制，為水蛭素用于治療肝癌提供一些依據(jù)。結(jié)果本研究發(fā)現(xiàn)，水蛭素能明顯抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲并誘導(dǎo)其凋亡，且呈劑量依賴效應(yīng)。同時發(fā)現(xiàn)隨水蛭素濃度增加，肝癌HepG2細(xì)胞VEGF的表達(dá)下調(diào)，認(rèn)為下調(diào)VEGF表達(dá)可能是水蛭素抗肝癌的主要作用機(jī)制之一。

本研究通過體外證實(shí)水蛭素對肝癌HepG2細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用，VEGF可能是其作用的靶點(diǎn)之一，為水蛭素用于肝癌治療提供一定的參考。然而肝癌的發(fā)生及發(fā)展過程十分復(fù)雜，涉及多個基因，目前肝癌的治療主要采用綜合治療，水蛭素用于臨床治療心腦血管疾病安全、有效，而用于肝癌的療效、用藥的方案及聯(lián)合其他治療手段的作用還需進(jìn)一步研究。

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