乙型肝炎病毒及黃曲霉毒素雙暴露下肝細(xì)胞癌中p53基因突變及蛋白表達(dá)的意義

白濤 齊魯楠 陳潔 葉甲舟 吳飛翔 彭濤 黎樂群

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的發(fā)生是一個(gè)多因素、多基因、多步驟的過(guò)程。其中癌基因的激活和抑癌基因的失活扮演著十分重要的角色。p53是迄今發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤相關(guān)性較高的抑癌基因，也是研究較為廣泛的基因之一［1］。p53與乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）以及黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）與HCC的發(fā)生緊密相關(guān)，可能與HBV和AFB1的協(xié)同作用致使p53exon7-249位點(diǎn)發(fā)生突變，以及細(xì)胞DNA與HBV整合，引起p53基因突變或蛋白的異常表達(dá)有關(guān)［2～4］。本研究采用PCR技術(shù)及免疫組化法檢測(cè)p53基因突變及蛋白在HBV及AFB1雙暴露下HCC組織中的表達(dá)情況，探討p53基因在不同HBV、AFB1暴露情況下的突變及其蛋白的表達(dá)水平，并分析其與HCC的關(guān)系及意義。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

82例HCC均為2008年10月至2010年5月在廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院行手術(shù)切除HCC組織的患者。HCC組織標(biāo)本均經(jīng)術(shù)后病理檢查證實(shí)，所有患者術(shù)前均未接受經(jīng)導(dǎo)管肝動(dòng)脈灌注化療。乙型肝炎病毒暴露定義［5］為患者血清學(xué)或肝組織HBV標(biāo)志物（HBsAg）陽(yáng)性；黃曲霉毒素暴露定義［5］為患者肝組織黃曲霉毒素B1-DNA加合物免疫組化染色陽(yáng)性。82例患者中男72例，女10例，年齡37～65歲，中位年齡53歲；腫瘤直徑≤5 cm 44例，＞5 cm 38例。82例HCC患者根據(jù)HBV與AFB1暴露情況分為HBV（+）/AFB1（+）（實(shí)驗(yàn)組A組）44例；HBV（+）/AFB1（-）（對(duì)照組B組）15例；HBV（-）/AFB1（+）（對(duì)照組C組）15例；HBV（-）/AFB1（-）（對(duì)照組D組）8例。另取肝血管瘤、肝外傷、肝移植供體的肝組織20例為正常對(duì)照組。所有標(biāo)本采集均履行患者知情同意并由本人或委托人簽字同意，研究方案通過(guò)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核同意。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

6A10單克隆抗體由美國(guó)哥倫比亞大學(xué)Regina M教授贈(zèng)予，組織基因組DNA提取試劑盒、2×Taq PCR MasterMix購(gòu)自北京天根公司，奧林巴斯雙目生物顯微鏡為日本Olympus公司，p53單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，S-P試劑盒購(gòu)自上海長(zhǎng)島生物科技公司，DAB顯色劑購(gòu)自福州邁新生物科技公司，其余試劑由廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.3 p53基因突變的檢測(cè)方法

按照北京天根公司血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書抽提樣本組織DNA，并由上海生工生物工程公司合成。p53的11對(duì)外顯子引物［7］及PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度見表1。

表1 p53外顯子引物及PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度

PCR 反應(yīng)條件為 p53 exon1、p53 exon11：95℃預(yù)變性 10 min；96℃ 30 s，65℃ 45 s（-0.3℃/cyc），72℃1 min，40 個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10 min；p53 exon2&3：95℃預(yù)變性 10 min；96℃ 30 s，64℃ 45 s（-0.3℃/cyc），72℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10 min；p53 exon4：95℃預(yù)變性 10 min；96℃ 30 s，63℃ 45 s（-0.3℃/cyc），72℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10 min；p53 exon5&6：94℃預(yù)變性 2 min；94℃ 30 s，63℃ 45 s（-0.2℃/cyc），72℃ 1 min，20 個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s，60℃45 s，72℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10 min；p53 exon7：92℃預(yù)變性 3 min；92℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃1 min，30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸 5 min；p53 exon8&9、p53 exon10：94℃預(yù)變性 2 min；94℃ 30 s，60℃ 45 s（-0.2℃/cyc），72℃ 1 min，20 個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s，57℃45 s，72℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10 min。

測(cè)序儀選用美國(guó)ABI3730XL，PCR產(chǎn)物的純化和測(cè)序由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司協(xié)助完成。

1.4 免疫組化SP法檢測(cè)p53蛋白的表達(dá)

組織標(biāo)本常規(guī)HE染色，按照S-P試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。陽(yáng)性反應(yīng)判斷為：（1）按切片中顯色癌細(xì)胞數(shù)的比例計(jì)分：無(wú)癌細(xì)胞顯色計(jì)0分；顯色癌細(xì)胞＜25%癌細(xì)胞總數(shù)計(jì)1分；25%癌細(xì)胞總數(shù)≤顯色癌細(xì)胞＜50%癌細(xì)胞總數(shù)計(jì)2分；顯色癌細(xì)胞≥50%癌細(xì)胞總數(shù)計(jì)3分。（2）按切片中癌細(xì)胞顯色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)顯色計(jì)0分；淺黃色計(jì)1分；棕黃色計(jì)2分；棕褐色計(jì)3分。以上（1）+（2）＞3分為陽(yáng)性，≤3分為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。各實(shí)驗(yàn)組p53exon7-249突變和p53蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率比較用χ2檢驗(yàn)或 Fisher′s確切概率法。p53exon7-249突變和p53蛋白表達(dá)陽(yáng)性率的相關(guān)關(guān)系采用雙變量Spearman相關(guān)性分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織基因組DNA的提取及PCR產(chǎn)物擴(kuò)增

按照組織基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行抽提，提取的DNA經(jīng)電泳后見明亮條帶，提示為提取樣品的組織DNA。見圖1。該產(chǎn)物電泳后分別在p53外顯子PCR擴(kuò)增片段出現(xiàn)特異性條帶，說(shuō)明產(chǎn)物擴(kuò)增成功。見圖2。

圖1 提取的組織基因組DNA

圖2 PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增

2.2 p53基因突變情況

測(cè)序結(jié)果表明：在82例HCC患者HCC組織中p53基因第7外顯子249編碼區(qū)發(fā)生點(diǎn)突變（為G→T突變）的頻率最高。見圖3。

圖3 p53基因第7外顯子249編碼區(qū)AGG→AGT突變

2.3 p53蛋白的表達(dá)

p53蛋白在HCC組織中的表達(dá)陽(yáng)性者著色位于細(xì)胞核內(nèi)，著色細(xì)胞大多呈片狀或彌漫性分布（圖4A），而表達(dá)陰性者著色較淺，未見深染的棕色細(xì)胞核（圖4B）。

圖4 p53蛋白在HCC組織中的表達(dá)（SP×400）

2.4 p53exon7-249突變與HBV/AFB1雙暴露HCC的關(guān)系

p53exon7-249在82例HCC患者中陽(yáng)性突變率為40.2%（33/82），其中實(shí)驗(yàn)組A組、對(duì)照組B組、對(duì)照組C組和對(duì)照組D組的陽(yáng)性突變率分別為50.0%（22/44）、13.3%（2/15）、46.7%（7/15）和 25.0%（2/8），正常對(duì)照組陽(yáng)性突變率為0。實(shí)驗(yàn)組A組與對(duì)照組B組比較，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余各組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.5 p53蛋白表達(dá)與HBV/AFB1雙暴露HCC的關(guān)系

p53蛋白在82例HCC患者中陽(yáng)性表達(dá)率為74.4%（61/82），其中實(shí)驗(yàn)組A組、對(duì)照組B組、對(duì)照組C組和對(duì)照組D組的陽(yáng)性表達(dá)率分別為90.9%（40/44）、46.7%（7/15）、73.3%（11/15）和 37.5%（3/8），正常對(duì)照組陽(yáng)性表達(dá)率為0。實(shí)驗(yàn)組A組分別與對(duì)照組B組、對(duì)照組D組比較，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余各組之間比較其差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表 3。

2.6 p53exon7-249突變與p53蛋白陽(yáng)性表達(dá)的相關(guān)性

82例HCC組織中p53exon7-249突變與p53蛋白表達(dá)均陽(yáng)性29例（35.6%），p53exon7-249突變陰性、p53蛋白表達(dá)陽(yáng)性32例（39.0%），經(jīng)Spearman相關(guān)性分析，p53exon7-249突變與p53蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.254，P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組A組、對(duì)照組B組、對(duì)照組C組、對(duì)照組D組各組之間p53exon7-249突變與p53蛋白表達(dá)的相關(guān)性均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表2 p53exon7-249突變與HBV/AFB1雙暴露HCC的關(guān)系［n（%）］

表3 p53蛋白表達(dá)與HBV/AFB1雙暴露HCC的關(guān)系［n（%）］

表4 p53exon7-249突變與p53蛋白表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

在我國(guó)，HCC的發(fā)病率及死亡率均位居前列，p53基因作為一種抑癌基因，可導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)分化阻滯、促進(jìn)DNA修復(fù)以及細(xì)胞凋亡。HBV是一種嗜肝性DNA病毒，能引起染色體畸變和基因重排，在AFB1等致癌因素的作用下，可導(dǎo)致癌基因的轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，最終使肝細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。

HCC組織中p53基因249位點(diǎn)突變被稱為“熱點(diǎn)”突變。在HCC高發(fā)地區(qū)，p53基因249位點(diǎn)的突變不僅可見于HCC患者的癌組織，且在當(dāng)?shù)馗呶Ｈ巳旱姆前┙M織中也可出現(xiàn)，不少體外實(shí)驗(yàn)［5～8］結(jié)果均顯示AFB1暴露與p53exon7-249位點(diǎn)突變有關(guān)。在p53exon7-249位點(diǎn)突變的HCC高發(fā)區(qū)，如南非、西非和我國(guó)啟東及桂西南地區(qū)等，不僅為AFB1高暴露區(qū)，而且是HBV的高感染區(qū)，HCC p53exon7-249熱點(diǎn)突變應(yīng)為AFB1和HBV 共同作用的分子印跡［9～11］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)82例HCC組織中p53基因的11對(duì)外顯子進(jìn)行單向全長(zhǎng)測(cè)序，發(fā)現(xiàn)p53exon7-249的突變率最高，這與文獻(xiàn)報(bào)道HBV及AFB1均為HCC高發(fā)區(qū)的熱點(diǎn)突變譜一致［12，13］。此外，其余位點(diǎn)亦有部分突變，分別在第5外顯子、第6外顯子及第8外顯子，包括編碼DNA結(jié)合域的堿基突變，但其特異性不大，可能與樣本較小或?qū)嶒?yàn)誤差有關(guān)，因此需在今后的實(shí)驗(yàn)中擴(kuò)大樣本及完善實(shí)驗(yàn)技術(shù)以進(jìn)一步證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)p53exon7-249的突變率以HBV/AFB1雙暴露的實(shí)驗(yàn)組A組為最高，而對(duì)照組C組以AFB1暴露作為單獨(dú)作用而致p53exon7-249突變的突變率較實(shí)驗(yàn)組A組低，再次表明環(huán)境致癌劑AFB1在導(dǎo)致p53exon7-249突變中起重要作用。由此可見，在HBV及AFB1雙暴露的“病毒-化學(xué)協(xié)同”下，p53基因更易從野生型向突變型轉(zhuǎn)變，其中以第7外顯子249位點(diǎn)G-T突變最為常見，其突變率亦最高。

正常組織細(xì)胞中p53蛋白半衰期較短且不穩(wěn)定，當(dāng)細(xì)胞受到缺氧、營(yíng)養(yǎng)缺乏、輻射或藥物等刺激時(shí)，p53可被激活而大量增加［14，15］。本實(shí)驗(yàn)82例HCC癌組織中，p53蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率為74.4%，其中實(shí)驗(yàn)組A組的陽(yáng)性表達(dá)率最高，通過(guò)對(duì)比分析各對(duì)照組p53蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率，表明HBV和AFB1雙暴露對(duì)p53蛋白的表達(dá)起一定的協(xié)同作用，在有HBV感染的肝組織中HBV基因編碼產(chǎn)物能與p53蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，影響p53基因?qū)Ω渭?xì)胞生長(zhǎng)的正常調(diào)節(jié)功能，使其半衰期延長(zhǎng)至6～12 h，AFB1暴露使p53基因發(fā)生突變，最終協(xié)同導(dǎo)致p53蛋白出現(xiàn)較高的陽(yáng)性表達(dá)率。因此，推測(cè)p53蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與AFB1的暴露有一定關(guān)系。在本次實(shí)驗(yàn)中，p53基因突變及蛋白的表達(dá)在實(shí)驗(yàn)組A組和對(duì)照組C組都有較高的陽(yáng)性率，但結(jié)果存在一定差異，推測(cè)是否因p53基因的某些內(nèi)含子發(fā)生了突變，而導(dǎo)致其半衰期延長(zhǎng)；或是p53基因本身結(jié)構(gòu)的改變，以及與機(jī)體內(nèi)其他因素或通路等對(duì)p53的作用，使其半衰期延長(zhǎng)而致本實(shí)驗(yàn)組A組p53蛋白呈現(xiàn)較高的表達(dá)率，這些需在今后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)p53蛋白表達(dá)的研究，再次發(fā)現(xiàn)在HBV/AFB1雙暴露作用下，p53蛋白有較高的陽(yáng)性表達(dá)率，為HCC一種高頻發(fā)生的分子生物學(xué)事件。

本實(shí)驗(yàn)研究中p53exon7-249突變與p53蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。在HCC發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程中，由于在HBV和AFB1雙暴露因素下，p53基因突變及蛋白表達(dá)存在一定的相關(guān)性，通過(guò)“病毒-化學(xué)”的協(xié)同作用，致使p53基因發(fā)生突變，因而導(dǎo)致其半衰期延長(zhǎng)，所編碼的蛋白累積，因此通過(guò)免疫組化法可在HCC癌組織中檢測(cè)到p53蛋白的表達(dá)。但p53基因本身具有多條循環(huán)通路及其他因子調(diào)節(jié)和相互影響，即使發(fā)生突變，其半衰期也未必延長(zhǎng)。另外，p53某些調(diào)節(jié)功能的改變，或因理化因素的影響而導(dǎo)致其半衰期延長(zhǎng)，通過(guò)免疫組化法可檢測(cè)到p53蛋白表達(dá)陽(yáng)性，但其基因本身結(jié)構(gòu)并無(wú)改變，也可無(wú)突變。因此，關(guān)于在HBV和AFB1雙暴露或單暴露的情況下p53基因突變與蛋白表達(dá)的相關(guān)關(guān)系，還需在今后實(shí)驗(yàn)研究中進(jìn)一步證實(shí)。

綜上，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明廣西地區(qū)HCC患者在HBV及AFB1雙暴露下，p53基因突變及蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率均升高，其中p53exon7-249突變?yōu)槠渫蛔儫狳c(diǎn)，為該地區(qū)HCC發(fā)生常見的一種分子生物學(xué)事件。p53基因的高突變率及蛋白高表達(dá)率可能與該地區(qū)HBV及AFB1雙暴露因素的協(xié)同作用有關(guān)。乙型肝炎病毒、黃曲霉毒素均為HCC的高危因素，其可促進(jìn)HCC發(fā)生、發(fā)展，為HCC的病因?qū)W和預(yù)防提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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