miR-206對高磷誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細(xì)胞鈣化的影響及機(jī)制

邵娟，吳基良，李敏才

（湖北科技學(xué)院，湖北咸寧437100）

miR-206對高磷誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細(xì)胞鈣化的影響及機(jī)制

邵娟，吳基良，李敏才

（湖北科技學(xué)院，湖北咸寧437100）

目的 觀察微小RNA-206（miR-206）對β-甘油磷酸鈉（β-GP）誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）鈣化的影響，并探討其機(jī)制。方法 取原代培養(yǎng)大鼠主動脈VSMCs并進(jìn)行細(xì)胞鑒定。將VSMCs隨機(jī)分為5組：空白對照組、模擬物陰性對照組、miR-206模擬物組、抑制物陰性對照組、miR-206抑制物組，用相應(yīng)引物進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48 h，各組給予β-GP 10 mmol／L誘導(dǎo)VSMCs鈣化。誘導(dǎo)4 d，茜素紅染色鏡下觀察各組鈣化情況，采用微量酶標(biāo)法檢測細(xì)胞堿性磷酸酶（ALP）活性，采用免疫熒光法檢測細(xì)胞縫隙連接蛋白43（Cx-43）表達(dá)。結(jié)果 VSMCs轉(zhuǎn)染后48 h，經(jīng)β-GP誘導(dǎo)4 d，與陰性對照組比較，miR-206模擬物組鈣化結(jié)節(jié)減少，miR-206抑制物組鈣化結(jié)節(jié)增多；與陰性對照組比較，miR-206模擬物組ALP活性及Cx43表達(dá)降低（P均＜0.05），miR-206抑制物組ALP活性及Cx43表達(dá)升高（P均＜0.05）。結(jié)論 miR-206可能通過調(diào)控Cx43表達(dá)抑制β-GP誘導(dǎo)的大鼠VSMCs鈣化。

微小RNA-206；β-甘油磷酸鈉；血管平滑肌細(xì)胞；鈣化；大鼠

血管鈣化是動脈粥樣硬化、糖尿病、慢性腎衰竭等疾病普遍存在的病理改變［1］。既往研究認(rèn)為，血管鈣化是一個被動的鈣磷沉積于血管壁的過程；但近年來發(fā)現(xiàn)血管鈣化是一個主動的可調(diào)控的生物學(xué)過程［2］。微小RNA（miRNA）是一類由22個核苷酸組成小RNA分子［3］，通常在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)，是近年來的研究熱點(diǎn)。最近研究發(fā)現(xiàn)，miR-206參與了血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）的功能調(diào)節(jié)和心血管系統(tǒng)疾病的進(jìn)程［4］，但具體機(jī)制尚不明確。2014年12月～2015年12月，本研究以高磷誘導(dǎo)的大鼠VSMCs鈣化為基礎(chǔ)，探討miR-206對VSMC鈣化的影響及可能的機(jī)制。

1　材料與方法

1.1動物、試劑及儀器 清潔級SD雄性大鼠15只，8周齡，180～200 g，購自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心；DMEM／F12培養(yǎng)基（Hyclone）、FBS及Opti-MEM無血清培養(yǎng)基（Gibco）、Lipo2000（Invitrogen）、miR-206相關(guān)轉(zhuǎn)染試劑（上海吉瑪公司）；引物序列（由上海吉瑪公司合成）：miR-206模擬物上游5′-UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGG-3′、下游5′-ACACACUUCCUUACAUUCCAUU-3′，模擬物陰性對照上游5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′、下游5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′，miR-206抑制物序列5′-CCACACACUUCCUUACAUUCCA-3′，抑制物陰性對照序列5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′；茜素紅、大鼠α-SMA抗體（Sigma）；細(xì)胞縫隙連接蛋白43（Cx-43）抗體、Runx2抗體（Abcam）；堿性磷酸酶（ALP）試劑盒（南京建成生物公司）。

1.2VSMCs培養(yǎng)及鑒定 SD大鼠麻醉后迅速取出胸主動脈移至超凈臺內(nèi)，無菌條件下縱行剪開血管，用棉簽擦去內(nèi)膜后剝離血管中膜并剪碎，用組織貼壁法進(jìn)行原代培養(yǎng)，經(jīng)自然純化后，選取3～8代生長良好的VSMCs進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取第3代VSMCs以1×105／孔的密度接種于放有滅菌蓋玻片的六孔板內(nèi)制作細(xì)胞爬片，待細(xì)胞貼壁生長至60%～70%融合時，去培養(yǎng)基，分別用免疫細(xì)胞熒光及化學(xué)染色法鑒定VSMCs特異性抗體α-SMA表達(dá)。經(jīng)免疫熒光染色，胞質(zhì)為綠色熒光；經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色，胞質(zhì)為棕黃色，均呈陽性表達(dá)，具有VSMCs的表型特征。

1.3細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 將VSMCs隨機(jī)分為5組：空白對照組、模擬物陰性對照組、miR-206模擬物組、抑制物陰性對照組、miR-206抑制物組。各組用Lipo2000按以下條件進(jìn)行轉(zhuǎn)染：VSMCs以2×105／孔的密度接種于六孔板，加入不含抗生素的DMEM／F12培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)70%時開始轉(zhuǎn)染。各取相應(yīng)引物10 μL（終濃度為100 nmol／L），另取Lipo2000 5 μL分別稀釋于Opti-MEM無血清培養(yǎng)基250 μL中，靜置5 min。將以上兩種液體輕輕混勻，室溫靜置20 min形成復(fù)合物。將復(fù)合物滴入培養(yǎng)板中并輕輕晃動，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 h后換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。同時轉(zhuǎn)染對照組。轉(zhuǎn)染48 h后，各組細(xì)胞給予β-GP 10 mmol／L誘導(dǎo)VSMCs鈣化，每2天更換1次培養(yǎng)液。經(jīng)誘導(dǎo)4 d，去培養(yǎng)液，D-Hanks液洗3遍，用4%多聚甲醛固定15 min，D-Hanks液再洗3遍，加入1%茜素紅室溫孵育30 min，蒸餾水沖洗、干燥，倒置顯微鏡下觀察到橘紅色結(jié)節(jié)即為鈣鹽沉積。

1.4VSMCs內(nèi)ALP活性測定 經(jīng)β-GP誘導(dǎo)4 d，用微量酶標(biāo)法檢測VSMCs內(nèi)ALP活性。按試劑盒說明書進(jìn)行操作，結(jié)果用BCA法測定的細(xì)胞蛋白含量予以校正。每組設(shè)3個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取均值。ALP活性計(jì)算公式：ALP活性（金氏單位／度（0.1 mg／mL）÷待測樣本蛋白濃度（gprot／mL）。

1.5VSMCs內(nèi)Cx43表達(dá)檢測 采用免疫熒光法。β-GP誘導(dǎo)4 d取各組細(xì)胞，去培養(yǎng)液，加PBS洗5 min×3次，加4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS洗滌5 min×3次，加3%H2O2室溫避光封閉20 min，PBS洗滌5 min×3次，加0.25%TritonX-100室溫避光破膜20 min，PBS洗滌5 min×3次，加5%BSA避光封閉30 min，滴加1∶500稀釋的兔抗Cx43（用PBS替代一抗作為空白對照）于濕盒內(nèi)4℃孵育過夜；取出濕盒復(fù)溫30 min，PBS洗滌5 min×3次，滴加熒光標(biāo)記的二抗室溫避光孵育1 h，加入DAPI染核，用含抗熒光淬滅的封片液封片，在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。使用IPP軟件分析圖像熒光強(qiáng)度。取6次實(shí)驗(yàn)結(jié)果平均值，并對結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，將空白對照組熒光強(qiáng)度值設(shè)定為1，使用IPP軟件直接測量綠色熒光強(qiáng)度值作為Cx43的相對表達(dá)量

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism5統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用±s表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1miR-206對高磷誘導(dǎo)VSMCs鈣化結(jié)節(jié)的影響

VSMCs經(jīng)β-GP誘導(dǎo)4 d，茜素紅染色結(jié)果顯示：與陰性對照組比較，miR-206模擬物組鈣化結(jié)節(jié)減少，miR-206抑制物組鈣化結(jié)節(jié)增多。

2.2miR-206對高磷誘導(dǎo)VSMCs內(nèi)ALP活性及Cx43表達(dá)的影響 與陰性對照組比較，轉(zhuǎn)染miR-206模擬物組ALP活性及Cx43蛋白表達(dá)降低（P均＜0.05），而轉(zhuǎn)染miR-206抑制物組ALP活性及Cx43蛋白表達(dá)升高（P均＜0.05），見表1。

表1　各組ALP活性、Cx43表達(dá)比較（±s）

表1　各組ALP活性、Cx43表達(dá)比較（±s）

注：與模擬物陰性對照組比較，*P＜0.05；與抑制物陰性對照組比較，＃P＜0.05。

組別ALP活性（U／grot）Cx43（熒光強(qiáng)度）空白對照組257.62±13.051.00±0.13模擬物陰性對照組322.37±16.69169.08±11.72 miR-206模擬物組230.55±14.44*23.25±2.26*抑制物陰性對照組236.41±17.9310.91±1.27 miR-206抑制物組305.25±13.47＃211.73±18.88＃

3　討論

血管鈣化是心血管疾病致死的主要危險因素，特別是對于終末期腎?。?］。近年來，越來越多的證據(jù)表明，血管鈣化是一個類似于骨形成的主動調(diào)節(jié)過程［6］，而VSMCs轉(zhuǎn)化為成骨樣細(xì)胞在促進(jìn)血管鈣化的過程中起關(guān)鍵作用［7］。VSMCs具有表型轉(zhuǎn)換潛能，在一些因子刺激下，促進(jìn)VSMCs向成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，形成動脈中膜鈣化。ALP是細(xì)胞成骨分化的早期檢測指標(biāo)，通過水解有機(jī)磷酸酯，使局部無機(jī)磷含量增加，促使磷酸鈣沉積。茜素紅染色是一種經(jīng)典鈣鹽染色法，茜素紅作為一種蒽醌類衍生物，能與鈣鹽結(jié)合形成橘紅色復(fù)合物，是定性檢測鈣化的方法，可用于細(xì)胞成骨分化的晚期檢測。

最近研究發(fā)現(xiàn)，很多miRNAs（miR-125b、miR-204、miR-205、miR-30b／c、miR-133a等）均能負(fù)向調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞鈣化過程［8～12］。本研究結(jié)果表明，VSMCs轉(zhuǎn)染miR-206 mimics后48 h，經(jīng)β-GP誘導(dǎo)4 d，與陰性對照組相比，ALP活性和鈣化結(jié)節(jié)數(shù)目明顯減少；而轉(zhuǎn)染miR-206抑制物，與對照組相比，ALP活性和鈣化結(jié)節(jié)數(shù)目均增加。表明miR-206可負(fù)向調(diào)控VSMCs成骨樣分化，與以上文獻(xiàn)報(bào)道一致。

縫隙連接是存在于相鄰細(xì)胞間的膜通道結(jié)構(gòu)，基本組成單位是Cx［13］。在心血管系統(tǒng)中，心肌細(xì)胞及VSMCs間存在著豐富的縫隙連接，主要表達(dá)產(chǎn)物為Cx43。Cx43也是成骨細(xì)胞中主要連接蛋白，為細(xì)胞骨化重要標(biāo)記物之一。如小鼠基因敲除Cx43后，內(nèi)皮素不能有效誘導(dǎo)細(xì)胞的骨化［11］，說明Cx43在骨基質(zhì)合成、分泌和礦化中起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，瞬時轉(zhuǎn)染miR-206 mimics導(dǎo)致Cx43表達(dá)下調(diào)，而轉(zhuǎn)染miR-206 inhibitor可以上調(diào)Cx43表達(dá)，提示miR-206可以負(fù)向調(diào)控Cx43表達(dá)。這與文獻(xiàn)［15］報(bào)道m(xù)iR-206負(fù)向調(diào)節(jié)Cx43表達(dá)，抑制C2C12細(xì)胞成骨分化過程相一致。

綜上所述，上調(diào)miR-206表達(dá)能抑制高磷誘導(dǎo)的大鼠VSMCs鈣化，其作用機(jī)制可能與miR-206抑制Cx43表達(dá)有關(guān)。可為臨床治療血管鈣化提供一個新的靶點(diǎn)。而Cx43具體通過何種途徑調(diào)控VSMCs發(fā)生成骨樣分化及miR-206是否通過其他途徑調(diào)控VSMCs鈣化尚需更進(jìn)一步深入研究。

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Effect of miR-206 on high phosphorus-induced calcification in rat vascular smooth muscle cells

SHAO Juan，WU Jiliang，LI Mincai

（Hubei University of Science and Technology，Xianning 437100，China）

Objective To investigate the effect of microRNA-206（miR-206）on β-glycerophosphate（β-GP）-induced calcification in rat vascular smooth muscle cells（VSMCs）.Methods Aortal VSMCs were primarily cultured and identified in vitro.VSMCs were divided into five groups：control group，mimics negative control group，miR-206 mimic group，inhibitor negative control group and miR-206 inhibitor group.Each group was transfected by lipofectamine2000.After 48-hour transfection，each group was stimulated with 10 mmol／Lβ-GP to induce calcification of VSMCs.Observing calcium deposition with Alizarin red staining while detecting the alkaline phosphate（ALP）activity and the expression of connexin 43（Cx-43）respectively by Trace enzyme standard method and immunofluorescence method after induction for 4 days.Results After transfection 48 h，VSMCs were treated with β-GP for 4 days.Compared with the negative control group，the calcium deposition decreased in the miR-206 mimic group and increased in the miR-206 inhibitor group；the ALP activity and the expression of Cx43 decreased in the miR-206 mimic group and increased in the miR-206 inhibitor group（all P＜0.05）.Conclusions miR-206 may inhibit β-GP-induced calcification of VSMCs by regulating Cx43.

microRNA-206：β-glycerophosphate；vascular smooth muscle cells；calcification；rats

10.3969／j.issn.1002-266X.2016.21.004

R543

A

1002-266X（2016）21-0010-03

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81270355）；湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2014CFB211）。

邵娟（1988-），女，在讀碩士，主要研究方向?yàn)閯用}粥樣硬化血管鈣化的機(jī)制。E-mail：juanshaobhgs＠163.com

簡介：李敏才（1974-），男，副教授，博士，主要研究方向?yàn)樾难懿±?。E-mail：mincaili＠163.com

（2016-02-20）