CAFs及IL-8對裸鼠人卵巢癌移植瘤生長的影響

李猛，楊璐璐，陳琢，陳穎

（1中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院，沈陽110032；2中國醫(yī)科大學(xué)；3沈陽醫(yī)學(xué)院）

·基礎(chǔ)研究·

CAFs及IL-8對裸鼠人卵巢癌移植瘤生長的影響

李猛1，楊璐璐2，陳琢3，陳穎1

（1中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院，沈陽110032；2中國醫(yī)科大學(xué)；3沈陽醫(yī)學(xué)院）

目的 探討癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）及白細(xì)胞介素8（IL-8）對裸鼠卵巢癌生長的促進(jìn)作用。方法CAFs和成纖維細(xì)胞（NFs）原代培養(yǎng)并鑒定，培養(yǎng)人卵巢癌細(xì)胞株（OVCAR3細(xì)胞）。將10只裸鼠隨機(jī)分為10組，分別接種NFs、CAFs、OVCAR3、NFs+OVCAR3、CAFs+OVCAR3及IL-8（100 ng／mL）干預(yù)后的以上細(xì)胞，并根據(jù)相應(yīng)接種細(xì)胞分組，建立裸鼠皮下移植瘤模型。觀察各組成瘤情況，計算腫瘤體積；處死裸鼠，剝離瘤體，HE染色后鏡下觀察裸鼠荷瘤組織病理變化。結(jié)果 NFs組、CAFs組、NFs+OVCAR3組、CAFs+IL-8組、NFs+IL-8組、NFs+ OVCAR3+IL-8組未見腫瘤生長。OVCAR3+CAFs+IL-8組、OVCAR3+CAFs組、OVCAR3+IL-8組成瘤體積明顯大于OVCAR3組（P均＜0.05），在前期OVCAR3+CAFs+IL-8組成瘤體積最大（P均＜0.05）。HE染色鏡下見OVCAR3+CAFs+IL-8組癌組織惡性程度最高。結(jié)論 CAFs、IL-8能在體內(nèi)促進(jìn)裸鼠卵巢癌移植瘤的生長，且二者有協(xié)同作用。

卵巢腫瘤；癌相關(guān)成纖維細(xì)胞；白細(xì)胞介素8；小鼠

近年來研究證明，卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移與腫瘤微環(huán)境、慢性炎癥有密切關(guān)系［1，2］。卵巢癌微環(huán)境中癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）能分泌多種因子促進(jìn)腫瘤血管、淋巴管生成，促進(jìn)腫瘤的侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［3］。慢性炎癥的長期刺激可誘發(fā)人正常細(xì)胞增殖、突變、阻止細(xì)胞凋亡并且導(dǎo)致細(xì)胞惡變［4］，還能通過誘導(dǎo)浸潤在腫瘤微環(huán)境的細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和趨化因子等增加患癌風(fēng)險。白細(xì)胞介素8（IL-8）可通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和血管生成來促進(jìn)卵巢癌的進(jìn)展［5］。但目前關(guān)于腫瘤微環(huán)境、慢性炎癥導(dǎo)致卵巢癌發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制仍不清楚。本研究于2015年6～11月通過建立裸鼠卵巢癌移植瘤模型，探討CAFs及IL-8對卵巢癌成瘤的作用。

1　材料與方法

1.1材料 人卵巢癌細(xì)胞株OVCAR3（中國醫(yī)科大學(xué)贈送）；DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、青鏈霉素（Hyclone公司），磷酸鹽緩沖液（PBS）、IL-8（中杉金橋），胰蛋白酶、胎牛血清（天津?yàn)蠊荆谆鶃嗧浚⊿igma公司）；BALB／C-nu雌性裸鼠10只（北京華阜康），4～5周齡，體質(zhì)量14～16 g，按三級動物要求由中國醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心在SPF環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.2CAFs、成纖維細(xì)胞（NFs）提取及鑒定 無菌條件下取卵巢癌組織標(biāo)本3例、宮頸癌根治術(shù)中正常卵巢組織標(biāo)本3例。取上皮性卵巢癌組織，反復(fù)清洗，修剪，剪碎，置于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，傳至3代進(jìn)行CAFs免疫組化鑒別。從正常卵巢組織提取并培養(yǎng)NFs，鑒別同CAFs。將胞質(zhì)中出現(xiàn)淡棕色或棕黃色顆粒判為陽性染色。CAFs細(xì)胞的波形蛋白和α-SMA均為陽性表達(dá)，胞質(zhì)呈黃棕色著色，角蛋白呈陰性表達(dá)。NFs細(xì)胞的波形蛋白為陽性表達(dá)，胞質(zhì)呈黃棕色著色，α-SMA與細(xì)胞角蛋白均為陰性表達(dá)。

1.3OVCAR3、CAFs、NFs培養(yǎng) 于37℃、5%CO2條件下，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)CAFs和NFs，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)OVCAR3。待OVCAR3、CAFs和NFs生長至70%～80%，取部分OVCAR3、CAFs、NFs用含IL-8（100 ng／mL）培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，根據(jù)計數(shù)用PBS將各類細(xì)胞分別配制成終濃度為2×107／mL、4×107／mL。再按1∶1比例將濃度為2×107／mL的細(xì)胞分別混合制成OVCAR3+CAFs、NFs+ OVCAR3、OVCAR3+CAFs+IL-8、NFs+OVCAR3+ IL-8細(xì)胞混懸液（終濃度4×107／mL）。1.4 裸鼠皮下移植瘤模型建立 將10只裸鼠隨機(jī)分為10組，分別接種NFs、CAFs、OVCAR3、NFs+ OVCAR3、CAFs+OVCAR3及IL-8干預(yù)后的以上細(xì)胞。每只裸鼠分別取3處接種細(xì)胞，將裸鼠雙前肢腋窩皮下和后背作為接種點(diǎn)，每處接種0.15 mL，注射后用鑷子夾閉針孔，觀察成瘤情況。當(dāng)腫瘤長至0.3 cm×0.3 cm時，記錄測量腫瘤最大徑線（a）、與最大徑線垂直的最長徑線（b），計算腫瘤體積（V＝1／6πab2）（mm3）。觀察腫瘤，待腫瘤表面破潰時處死裸鼠，剝離瘤體，一部分立即放入-80℃冰箱保

存，另一部分用甲醛固定后石蠟包埋，保存。HE染色后觀察裸鼠荷瘤組織病理變化。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料用±s表示，多組比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1CAFs和IL-8對裸鼠移植瘤生長的影響 NFs組、CAFs組、NFs+OVCAR3組、CAFs+IL-8組、NFs +IL-8組、NFs+OVCAR3+IL-8組未見腫瘤生長。其余各組腫瘤體積生長變化見表1。

表1　各組不同時點(diǎn)腫瘤體積比較（mm3，±s）

表1　各組不同時點(diǎn)腫瘤體積比較（mm3，±s）

注：與OVCAR3組比較，aP＜0.05；與OVCAR3+IL-8組比較，bP＜0.05；與CAFs+OVCAR3組比較，cP＜0.05。

組別腫瘤體積接種第17天接種第19天接種第21天接種第23天接種第25天OVCAR3組16.21±1.4319.35±1.2223.50±2.74106.96±11.82163.15±1.85 OVCAR3+IL-8組46.93±6.93a59.82±7.10a92.85±10.67a131.57±15.48a170.66±4.49aCAFs+OVCAR3組67.25±8.75ab100.46±14.94ab147.70±16.04ab219.37±21.98ab282.78±54.94abCAFs+OVCAR3+IL-8組63.54±11.74abc75.38±17.59abc135.74±21.97ab187.93±39.35ac241.15±79.39ac

2.2裸鼠成瘤組織的病理變化 裸鼠成瘤組織HE染色鏡下見OVCAR3+CAFs+IL-8組癌組織惡性程度最高（經(jīng)中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院病理科證實(shí)）。

3　討論

腫瘤微環(huán)境是近年來腫瘤課題研究的熱點(diǎn)，腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境是一個不可分割的整體，它們之間的功能互動性已經(jīng)得到了普遍的認(rèn)可，腫瘤基質(zhì)在腫瘤的發(fā)展、增殖及浸潤等進(jìn)程中起到了“土壤”的作用［6］。在卵巢癌腫瘤微環(huán)境中，CAFs的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于卵巢良性腫瘤和交界性腫瘤（P＜0.01），而且CAFs數(shù)量增加與卵巢癌患者出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移以及淋巴管密度和腫瘤微血管密度增加有關(guān)［7］。研究發(fā)現(xiàn)，CAFs能通過分泌組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶、血管內(nèi)皮生長因子、趨化因子等促進(jìn)腫瘤血管生成、淋巴管生成和腫瘤細(xì)胞的侵襲力來協(xié)同促進(jìn)腫瘤發(fā)展及浸潤［7，8］。本實(shí)驗(yàn)中，CAFs+ OVCAR3組裸鼠皮下成瘤體積明顯高于OVCAR3組，表明CAFs能明顯促進(jìn)卵巢癌組織的增殖，這與以往文獻(xiàn)［8］報道一致。腫瘤細(xì)胞周圍的NFs可受到癌細(xì)胞分泌多種因子的影響，進(jìn)入活化狀態(tài)［1，9，10］。在本實(shí)驗(yàn)中，NFs+OVCAR3組在裸鼠皮下未見腫瘤生長，說明正常NFs對腫瘤無促進(jìn)作用，這與NFs低表達(dá)或不表達(dá)成纖維細(xì)胞活化蛋白（FAP）、IL-8、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）、HGF等有關(guān)［2］，而NFs轉(zhuǎn)化為活化NFs的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

持續(xù)、慢性的炎癥環(huán)境能促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致組織損傷并引起修復(fù)反應(yīng)，包括分泌生長因子、組織重建的酶類、免疫調(diào)節(jié)因子等，但慢性炎癥環(huán)境中所含的炎癥細(xì)胞、細(xì)胞因子及趨化因子等也可誘發(fā)人正常細(xì)胞增殖、突變，阻止細(xì)胞凋亡甚至惡變，并且能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、擴(kuò)散、浸潤［4，11］。炎癥環(huán)境中的趨化因子參與許多腫瘤的生長過程，如卵巢癌、乳腺癌和結(jié)腸癌等［12］，但趨化因子和趨化因子受體調(diào)節(jié)惡性疾病的發(fā)生及進(jìn)展的具體機(jī)制目前不清楚。IL-8是CAFs分泌的趨化因子之一，有文獻(xiàn)證明IL-8濃度為100 ng／mL時對腫瘤促進(jìn)作用最明顯［13］。在本實(shí)驗(yàn)中，OVCAR3+IL-8組裸鼠成瘤體積明顯大于OVCAR3組，表明IL-8能明顯促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖。本實(shí)驗(yàn)中OVCAR3+NFs+IL-8組未見明確的腫瘤形成，這與以往文獻(xiàn)報道相異［10，15］，可能與本實(shí)驗(yàn)中IL-8未能將NFs激活，也可能與NFs對腫瘤細(xì)胞有直接接觸抑制作用有關(guān)，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

CAFs在腫瘤的形成過程中分泌了IL-6、FAP、TGF-β、肝細(xì)胞生長因子、表皮生長因子等多種炎性因子和趨化因子，它們在腫瘤微環(huán)境中共同組成炎癥環(huán)境促進(jìn)腫瘤的生長［1，11］。在本實(shí)驗(yàn)中，OVCAR3+IL-8組裸鼠成瘤體積大于OVCAR3組，而OVCAR3+IL-8+CAFs組裸鼠成瘤體積最大，說明IL-8和CAFs協(xié)同作用促進(jìn)了卵巢癌細(xì)胞的生長；根據(jù)瘤組織HE染色提示，IL-8+OVCAR3+CAFs組的瘤細(xì)胞惡性程度最高，由此我們推測IL-8可能成為預(yù)測卵巢癌的惡性程度及預(yù)后的指標(biāo)之一。

綜上所述，CAFs和IL-8在卵巢癌增殖過程中發(fā)揮重要作用，未來或許通過抑制其產(chǎn)生或轉(zhuǎn)變來抑制卵巢癌的發(fā)展，成為卵巢癌治療的分子靶點(diǎn)；IL-8可能成為卵巢癌預(yù)后的判斷指標(biāo)之一。但CAFs和IL-8對卵巢癌發(fā)生、侵襲及浸潤的作用機(jī)制目前仍不明確，尚需進(jìn)一步研究。

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R-332；R737.31

A

1002-266X（2016）21-0025-03

遼寧省科學(xué)技術(shù)計劃項(xiàng)目（2013225021）；遼寧省“百千萬人才工程”資助項(xiàng)目（2012921031）。

陳穎（E-mail：chenying718＠tom.com）

（2015-12-30）