新疆藥桑葉中黃酮類化合物的分離與鑒定

張貴會(huì),王 賀,何春秋,楊 玲

(1.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,新疆阿拉爾 843300;2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆阿拉爾 843300)

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新疆藥桑葉中黃酮類化合物的分離與鑒定

張貴會(huì),王 賀,何春秋,楊 玲

(1.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,新疆阿拉爾 843300;2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆阿拉爾 843300)

采用色譜分離技術(shù)從藥桑葉醇提物的乙酸乙酯萃取部分分離黃酮類化合物,通過(guò)核磁共振(NMR)和高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS-MS)鑒定其結(jié)構(gòu)。分離得到四個(gè)黃酮類化合物,結(jié)構(gòu)表征為蘆丁(1)、槲皮素-3-O-葡萄糖苷(2)、金絲桃苷(3)、山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖(4)。其中化合物(3)、(4)首次從新疆藥桑葉中分離得到。

藥桑葉(MorusnigraL.),黃酮,結(jié)構(gòu)鑒定,槲皮素-3-O-葡萄糖苷,金絲桃苷

藥桑在植物分類學(xué)上屬桑科(Moraceac)、桑屬(MorusL.)、黑桑種(MorusnigraL.),是我國(guó)國(guó)內(nèi)唯一具有22倍花性染色體的桑品種,是新疆目前桑品種分類鑒定中唯一黑桑種[1]。在新疆主要栽培地為南疆阿克蘇、庫(kù)車及和田地區(qū),桑葉是?？浦参锷５娜~,約占桑樹(shù)地上部產(chǎn)量的64%,桑葉是常用的維吾爾族醫(yī)藥材,可用于治療一些疾病,如關(guān)節(jié)腫痛、手足麻木等疾病[2]。桑葉含化學(xué)物質(zhì)種類多,而且具有多種生物活性,黃酮類化合物是桑葉的主要功能性成分之一,主要包括蕓香苷、槲皮素、異槲皮素、二氫山奈素等[3-4],含量約占干質(zhì)量的1.0%～3.0%[5]。研究表明桑葉中的黃酮類化合物,具有明顯的抗氧化活性[6-7]。

P. Bassinet等[8]從桑葉(Morusinsignis)70%乙醇提取物的乙酸乙酯和正丁醇溶解部分分離得到2-甲基苯并呋喃類化合物、3-O-葡萄糖苷、熊果酸、莰非醇-3-0-葡萄糖苷和五羥黃酮-3-葡萄糖苷等化合物。N. Asano等[9]主要對(duì)桑白皮中的化學(xué)成分進(jìn)行研究,從中分離得到桑根酮、桑酮醇、桑酮、二氫桑色素、二氫山奈酚、桑橙素等。Kim等[10]從桑葉中分離得到包括山萘酚、葡萄糖苷、紫云英苷等9個(gè)黃酮苷類化合物。陳菁菁等[11]從桑葉(Mulberry)中分離得到槲皮素葡萄糖苷、槲皮素蕓香苷、木犀草素蕓香苷等7個(gè)黃酮類化合物。鄭夢(mèng)嬌等[12]從扶桑葉(Hibiscusrosa-sinensis)的乙醇提取物中分離得到芹菜素-3-C-阿拉伯糖-6-C-葡萄糖苷、山奈酚-C-六碳糖苷、菜素-C-二糖苷等4個(gè)黃酮類化合物。目前對(duì)于新疆藥桑葉中黃酮類化合物的研究主要集中在對(duì)蘆丁、槲皮素-3-O-葡萄糖苷和槲皮素等含量的測(cè)定[13-14]。王芳等[15]對(duì)藥桑葉黃酮類化合物進(jìn)行分離純化及活性研究,發(fā)現(xiàn)藥桑葉黃酮類化合物具有明顯的抗氧化活性。

目前對(duì)桑葉中黃酮類化合物分離及其活性有一定的研究,但對(duì)新疆藥桑葉中黃酮類化合物的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定研究報(bào)道較少,本研究利用現(xiàn)代分離手段和色譜分離技術(shù)對(duì)藥桑葉黃酮類化合物進(jìn)行分離純化,采用核磁共振(NMR)和高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS-MS)解析化合物的結(jié)構(gòu),旨在為更深入研究和開(kāi)發(fā)新疆藥桑葉(MorusnigraL.)的藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藥桑葉 2014年7月采自新疆庫(kù)車,經(jīng)塔里木大學(xué)邱愛(ài)軍副教授鑒定為藥桑葉(MorusnigraL.),藥桑葉粉碎過(guò)100目篩備用;甲醇、甲酸 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司,為色譜純;95%乙醇、石油醚、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇 天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司,均為分析純;AB-8大孔吸附樹(shù)脂 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;6410高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜 美國(guó)安捷倫公司;中壓柱色譜系統(tǒng) 上海樂(lè)風(fēng)儀器設(shè)備有限公司,配有TBP5002型二元梯度液相泵、TBP-5000紫外檢測(cè)器、TBP-5001餾分收集器、進(jìn)樣單元、ODS反相C18硅膠色譜柱(460 mm×36 mm,50 μm);2767Waters制備液相色譜 美國(guó)Waters公司,配有Waters2489雙波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器、四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱;島津LC-20AT型高效液相色譜儀,配有LC-20AT二元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、SPD-M20A紫外檢測(cè)器 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制備 取過(guò)100目篩的藥桑葉粉末5 kg,用體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇與藥桑葉粉末25∶1混勻在25 ℃下浸泡72 h,重復(fù)浸提3次,用布氏漏斗抽濾,合并濾液,減壓濃縮,加入等體積95%乙醇并置于4 ℃冰箱12 h使多糖沉淀,過(guò)濾除去多糖,濾液濃縮得浸膏0.7 kg,將浸膏用水分散,依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇多次萃取,其中將乙酸乙酯萃取部分濃縮后備用。

1.2.2 黃酮類化合物的純化 取乙酸乙酯部分10 g用適量的水溶解,過(guò)濾,濾液過(guò)已活化的AB-8型大孔吸附樹(shù)脂依次用蒸餾水-乙醇體系進(jìn)行梯度洗脫(100∶1;80∶20;60∶40;40∶60;20∶80;v/v),經(jīng)薄層層析分析將流出部分分為(Ⅰ～Ⅴ)。

1.2.3 中亞柱色譜分離條件 取第Ⅲ部分用硅藻土拌樣,經(jīng)中壓柱色譜(Flash反相C18色譜柱(460 mm×36 mm,50 μm);檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)328 nm,上樣量5 g),用蒸餾水-甲醇(90∶10;75∶25;50∶50;30∶70;0∶100;V/V),流速20 mL/min梯度洗脫,每段洗脫體積800 mL,得到Fr1、Fr2、Fr3、Fr4、Fr5五段餾分,用高效液相色譜檢測(cè)各段餾分,餾分Fr1、Fr3、Fr4、Fr5中主要成分保留時(shí)間非常相近的化合物,經(jīng)柱色譜和制備液相很難得到很好的分離,故不做下一步分離,本實(shí)驗(yàn)只對(duì)餾分Fr2中各成分進(jìn)行分離。

1.2.4 色譜分離條件 分析型液相色譜分離條件:色譜柱Waters-Xbridge(250 mm×4.6 mm,5 μm);流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)328 nm;柱溫箱溫度40 ℃;進(jìn)樣濃度1 g/L;進(jìn)樣量20 μL;流動(dòng)相甲醇-水;梯度洗脫(0～10 min 5%～25%甲醇、10～30 min 25%～75%甲醇、30～40 min 75%～100%甲醇),餾分Fr2中各化合物之間實(shí)現(xiàn)了基線分離。

制備型液相色譜分離條件:色譜柱為Waters-Xbridge(250 mm×19 mm,5 μm);流速15 mL/min;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量為500 μL;樣品濃度為200 g/L;其余條件與分析型液相色譜條件相同。

1.2.5 單體化合物純度的測(cè)定 高效液相色譜條件:Waters-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)328 nm;進(jìn)樣量20 μL;柱溫40 ℃;流動(dòng)相:水(A)-甲醇(B);等度洗脫(A∶B=65∶35;V/V)10 min。

1.2.6 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜條件:負(fù)離子模式,離子源ESI;干燥氣:350 ℃;氣流:10 L/min;霧化壓力:40 psi;離子源溫度:330 ℃;電壓:4000 V;碎裂電壓:100 V;碰撞能量:10 V和40 V。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離得到的單體化合物

其中Fr2餾分經(jīng)制備型HPLC(5%～25%甲醇)得到化合物1(31 mg);(25%～75%甲醇)可得化合物2(6.3 mg)和化合物3(8.6 mg);(75%～100%甲醇)得到化合物4(7.8 mg)。

2.2 單體化合物純度測(cè)定

由圖1可知,由HPLC圖譜按峰面積歸一化法計(jì)算化合物1、化合物2、化合物3、化合物4的純度分別為97.7%、98.3%、97.0%、98.1%?；衔?、化合物3有兩個(gè)雜質(zhì)峰,可能原因收集范圍寬所致,各化合物從保留時(shí)間上分析,化合物2保留時(shí)間3.8 min、化合物3保留時(shí)間4.0 min、保留時(shí)間微小差異可能原因是取代基的種類和數(shù)目相似,推測(cè)這兩種化合物可能是同分異構(gòu)體,化合物1、化合物4保留時(shí)間差異很大可能與所連接的糖種類與數(shù)目有關(guān),推測(cè)這四種化合物結(jié)構(gòu)相似的黃酮類化合物。

圖1 單體化合物HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of monomer compounds

2.3 黃酮類化合物質(zhì)譜分析及可能結(jié)構(gòu)

采用HPLC-MS-MS聯(lián)用技術(shù),可以獲得每個(gè)色譜峰在負(fù)離子模式下所對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜信息,由圖2可知,準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-(m/z 609)可知該化合物的相對(duì)分子質(zhì)量為610,碎片離子峰(m/z 301)為準(zhǔn)分子離子峰丟失一個(gè)中性片段m/z 308而產(chǎn)生的,根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量初步判斷m/z 308的中性片段為蕓香糖,[M-H-308]-(m/z301)為槲皮素,與文獻(xiàn)一致[16]。

圖2 化合物ⅠESI-MS圖及結(jié)構(gòu)Fig.2 Compound I ESI-MS diagram and structure

由圖3可知,在負(fù)離子模式下,準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-(m/z 463)可知該化合物的相對(duì)分子質(zhì)量為464,碎片離子峰(m/z 301)是準(zhǔn)分子離子峰丟失一個(gè)m/z 162的中性片段產(chǎn)生的,根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量初步判斷m/z 162的中性片段為葡萄糖基,[M-H-162]-(m/z 301)為槲皮素,與文獻(xiàn)一致[17]。

圖3 化合物ⅡESI-MS圖及結(jié)構(gòu)Fig.3 Compound Ⅱ ESI-MS diagram and structure

由圖4可知,在負(fù)離子模式下,準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-(m/z 463)可知該化合物的相對(duì)分子質(zhì)量為464,碎片離子峰(m/z 301)是由準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-(m/z 463)丟失一個(gè)中性片段m/z 162產(chǎn)生的,根據(jù)相對(duì)分子量初步判斷該中性片段m/z 162為葡萄糖基的中性片段,碎片離子峰(m/z 271)可能是由碎片離子峰(m/z 301)裂解一個(gè)羥基產(chǎn)生的4′,5,7-三羥基黃酮,證明碎片離子峰(m/z 301)為槲皮素,與文獻(xiàn)一致[18]。

圖4 化合物ⅢESI-MS圖及結(jié)構(gòu)Fig.4 Compound Ⅲ ESI-MS diagram and structure

由圖5可知,在負(fù)離子模式下,準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-(m/z 447)可知該化合物的相對(duì)分子質(zhì)量為448,碎片離子峰[M-H-162]-(m/z 285)是由準(zhǔn)分子離子峰失去一個(gè)m/z 162的中性片段產(chǎn)生的,根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量初步判斷m/z 162的中性片段為吡喃葡萄糖基,[M-H-162]-(m/z 285)為山奈酚,與文獻(xiàn)一致[19]。

圖5 化合物Ⅳ ESI-MS圖及結(jié)構(gòu)Fig.5 Compound Ⅳ ESI-MS diagram and structure

2.4 化合物結(jié)構(gòu)解析

化合物1黃色粉末(甲醇);mp.176～178 ℃,ESI-MS m/z:609[M-H]-1H-NMR(CD3OD,400 MHz)δ:6.20(1H,d,J=2.0 Hz,H-6),6.42(1H,d,J=1.8Hz,H-8),6.83(1H,d,J=8.5Hz,H-5′),7.54(1H,d,J=2.0 Hz,H-6′),5.22(1H,d,J=6.9Hz,葡萄糖的端基氫),4.31(1H,鼠李糖的端基氫),1.06(3H,鼠李糖的甲基氫);13C-NMR(CD3OD,100 MHz)δ:157.0(C-2),133.3(C-3),177.9(C-4),161.0(C-5),98.6(C-6),165.2(C-7),93.3(C-8),156.3(C-9),104.2(C-10),121.2(C-1′),115.3(C-2′),144.8(C-3′),148.2(C-4′),115.3(C-5′),121.4(C-6′),101.2(C-1″),74.5(C-2″),76.9(C-3″),70.1(C-4″),75.0(C-5″),66.4(C-6″),101.8(C-1?),70.2(C-2?),69.9(C-3?),71.8(C-4?),68.3(C-5?),17.7(C-6?)。該數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20-21]一致確定為蘆丁。

化合物2黃色針狀結(jié)晶(甲醇);mp.225～227 ℃;ESI-MS m/z:463[M-H]-1H-NMR(CD3OD,400 MHz)δ:12.60(1H,s,5-OH),6.17(1 H,d,J=1.2Hz,H-6),6.38(1H,d,J=1.2Hz,H-8),7.49(1H,d,J=1.2Hz,H-2′),6.82(1H,d,J=7.8 Hz,H-5′),7.58(1H,dd,J=1.8,7.8Hz,H-6′),5.47(1H,d,J=7.3H z,H-1″),3.07～3.63(6H,m,H-2″,H-3″,H-4″,H-5″,H-6′,);13C-NMR(CD3OD,100 MHz)δ:156.9(C-2),133.7(C-3),177.7(C-4),161.5(C-5),99.6(C-6),164.1(C-7),94.0(C-8),156. 4(C-9),104.3(C-10),122.0(C-1′),115.6(C-2′),145.3(C-3′),149.1(C-4′),116.6(C-5′),121.5(C-6′),101.2(C-1″),74.5(C-2″),76.9(C-3″),70.1(C-4″),78.0(C-5″),61.4(C-6″)。該數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22-24]一致,確定化合物2為槲皮素-3-O-葡萄糖苷。

化合物3淡黃色針狀結(jié)晶(甲醇);mp.227～229 ℃;ESI-MS m/z:463[M-H]-1H-NMR(CD3OD,400 MHz)δ:12.61(1H,s,5-OH),6.17(1 H,d,J=1.2Hz,H-6),6.38(1H,d,J=1.2Hz,H-8),7.52(1H,d,J=1.8Hz,H-2′),6.80(1H,d,J=7.8 Hz,H-5′),7.65(1H,dd,J=1.8,7.8Hz,H-6′),5.38(1H,d,J=7.2H z,H-1″);13C-NMR(CD3OD,100 MHz)δ:156.5(C-2),133.8(C-3),177.7(C-4),161.6(C-5),102.6(C-6),165.2(C-7),94.0(C-8),156.74(C-9),104.3(C-10),121.99(C-1′),115.4(C-2′),145.3(C-3′),149.0(C-4′),116.3(C-5′),121.9(C-6′),99.2(C-1″),75.9(C-2″),73.9(C-3″),71.5(C-4″),68.3(C-5″),60.4(C-6″)。該數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[25-27]一致,確定化合物3為金絲桃苷。

化合物4黃色粉末(甲醇);mp.192～194 ℃;ESI-MS m/z:447[M-H]-1H-NMR(CD3OD,400 MHz)δ:12.61(1H,s,OH),8.08(2H,d,J=8.9Hz,H-2,6),6.93(2H,d,J=8.9Hz,H-3,5),6.45(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.26(1H,d,J=2.9Hz,H-6),5.38(1H,d,J=7.4H z,H-1″);13C-NMR(CD3OD,100 MHz)δ:156.4(C-2),133.2(C-3),177.3(C-4),156.6(C-5),68.3(C-6),165.2(C-7),94.0(C-8),161.7(C-9),104.3(C-10),121.6(C-1′),130.8(C-2′),115.4(C-3′),160.0(C-4′),115.3(C-5′),130.9(C-6′),102.2(C-1″),73.9(C-2″),77.6(C-3″),71.0(C-4″),76.3(C-5″),60.8(C-6″)。該數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[28-29]一致,確定化合物4為山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

3 討論

在測(cè)定單體化合物純度時(shí),選擇等度洗脫,這樣可以節(jié)省時(shí)間和溶劑,要在紫外吸收全波長(zhǎng)范圍內(nèi)觀察是否有其他雜質(zhì)峰,因?yàn)樵诓煌奈詹ㄩL(zhǎng)下一些雜質(zhì)峰有最大吸收才能顯現(xiàn)出來(lái),這樣才能確定分離得到的單體化合物是否是單一的化合物。

在高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS-MS)解析化合物的結(jié)構(gòu)時(shí),考察了正負(fù)離子模式下,待測(cè)成分的裂解情況發(fā)現(xiàn)負(fù)離子模式下,待測(cè)黃酮類化合物更易產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子峰,響應(yīng)靈敏度相對(duì)較高,故選擇負(fù)離子模式檢測(cè)。可能是黃酮類化合物其分子中的羥基很容易形成穩(wěn)定的氧負(fù)離子,所以在負(fù)離子模式檢測(cè)所得總離子流圖有較好的信噪比,故實(shí)驗(yàn)最終選擇在負(fù)離子模式下進(jìn)行。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)藥桑葉醇提物乙酸乙酯部分總黃酮的提取和分離,采用大孔樹(shù)脂AB-8、中壓柱色譜、高效液相、制備液相分離純化得到高純度的黃酮單體化合物,采用核磁共振(NMR)、高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS-MS)、鑒定其分子結(jié)構(gòu):化合物1為槲皮素-3-O-蕓香糖苷(Rutinum)、化合物2為槲皮素-3-O-葡萄糖苷(Isoquercitrin)、化合物3為金絲桃苷(Hyperin)、化合物4為山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖(kaempferol-1-3-O-β-D-glucopyranoside)。其中化合物3、4首次從新疆藥桑葉中分離得到。本研究對(duì)藥桑葉中乙酸乙酯相黃酮進(jìn)行分離鑒定,旨在為進(jìn)一步有效利用這一寶貴的天然植物資源提供理論依據(jù),也為藥桑葉的綜合利用和深入研究提供理論基礎(chǔ),為開(kāi)發(fā)藥桑葉中的黃酮奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

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Isolation and Identification of flavonoids compounds from XinjiangMorusnigraL.

ZHANG Gui-hui,WANG He,HE Chun-qiu,YANG Ling*

(1.College of Life Science,Tarim University,Alar 843300,China;2.Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resources in Tarim Basin,Xinjiang Production& Construction Corps,Alar 843300,China)

Flavonoids were isolated from ethyl acetate extract of alcohol extract ofMorusnigraL.by means of various chromatographic techniques.And they were identified by nuclear magnetic resonance(NMR)and HPLC-MS-MS. Four flavonoids were isolated and identified as Rutinum(1),Isoquercitrin(2),Hyperin(3)and kaempferol-1-3-O-β-D-glucopyranoside(4),respectively. Compou-nds(3)and(4)were isolated fromMorusnigraL. for the first time.

MorusnigraL.;flavonoids;structure identification;isoquercitrin;hyperin

2016-05-06

張貴會(huì)(1986-)，男，在讀碩士研究生，主要從事天然產(chǎn)物分子結(jié)構(gòu)與功能方面的研究，E-mail:1144696239@qq.com。

*通訊作者:楊玲(1965-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事天然產(chǎn)物分子結(jié)構(gòu)與功能方面的研究，E-mail：yang ling zj @sina.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31460080)資助。

TS

A

1002-0306(2016)20-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.20.000