來(lái)源于不同品種魷魚(yú)硫酸軟骨素理化性質(zhì)比較

李燕妮,郭 琳,許維娜

(濱州醫(yī)學(xué)院葡萄酒學(xué)院,山東煙臺(tái) 264003)

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來(lái)源于不同品種魷魚(yú)硫酸軟骨素理化性質(zhì)比較

李燕妮,郭 琳,許維娜

(濱州醫(yī)學(xué)院葡萄酒學(xué)院,山東煙臺(tái) 264003)

以美洲大赤魷、巴氏柔魚(yú)、阿根廷魷魚(yú)和太平洋褶皺柔魚(yú)四種魷魚(yú)軟骨為原料,經(jīng)過(guò)酶解、超濾濃縮和乙醇沉淀的方法獲得硫酸軟骨素,其粘均分子量范圍6.7×104(阿根廷魷魚(yú))～1.57×105(美洲大赤魷),硫酸軟骨素E型(CS-E)二糖占總二糖比例的17%～46.9%。研究表明,四種魷魚(yú)都可以作為CS-E的生物來(lái)源。

魷魚(yú),硫酸軟骨素,酶解高效液相,硫酸軟骨素E

目前全球魷魚(yú)產(chǎn)量一直處于增長(zhǎng)的狀態(tài),從中提取的硫酸軟骨素可以成為一種穩(wěn)定的硫酸軟骨素新來(lái)源。硫酸軟骨素(Chondroitin Sulfate,CS)是糖胺多糖的一個(gè)亞族,是線性、復(fù)雜、聚合度分散的天然多糖,廣泛分布于動(dòng)物組織的細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞表面。近些年來(lái),越來(lái)越多的證據(jù)證實(shí),硫酸軟骨素在細(xì)胞分裂、細(xì)胞增殖、分化、遷移和創(chuàng)傷愈合中發(fā)揮重要的功能。根據(jù)CS硫酸化位點(diǎn)不同,通常將天然來(lái)源的CS硫酸化二糖分為A、B、C、D、E、F、H、K、L和M等類(lèi)型[1-3](見(jiàn)圖1)。

硫酸軟骨素E(CS-E)作為一種硫酸化二糖,或以硫酸軟骨素E二糖為表征的多糖,擁有其他種類(lèi)硫酸軟骨素所不具備的獨(dú)特藥理活性[1],用于抗單皰疹病毒,與一般的激素藥物相比,其引起過(guò)敏的可能性更低;CS-E作為抗癌藥物,能有效抑制癌細(xì)胞向肺的轉(zhuǎn)移[4-6];Scientific Reports 2015年報(bào)道表明,CS-E可以抑制雌激素缺乏誘發(fā)的骨質(zhì)疏松[7]。這些都表明CS-E可以作為未來(lái)有效的新藥研究對(duì)象。本文對(duì)美洲大赤魷(Dosidicus gigas),巴氏柔魚(yú)(Ommastrephes bartramii),阿根廷魷魚(yú)(Illex argentinus),太平洋褶皺柔魚(yú)(Todarodes pacificus)四種魷魚(yú)(Ommastrephidaes)軟骨來(lái)源的硫酸軟骨素進(jìn)行比較,闡明不同來(lái)源CS-E的理化性質(zhì)和二糖結(jié)構(gòu)區(qū)別,以便于對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的藥學(xué)應(yīng)用研究。

圖1 常見(jiàn)硫酸軟骨素二糖單位Fig.1 Repeating unit of chondroitin sulfate

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

四種魷魚(yú)軟骨 煙臺(tái)大宸食品有限公司;硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)品及硫酸軟骨素二糖標(biāo)準(zhǔn)品 sigma公司;硫酸軟骨素ABC酶 sigma公司;氫氧化鈉、鹽酸、乙醇等其它試劑 上?；瘜W(xué)試劑有限公司,均為分析純;200萬(wàn) u/g木瓜蛋白酶 廣西南寧龐博生物工程有限公司。

Primo R 高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Heraeus公司;Minimate TFF system超濾機(jī) PALL;8453 紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì) 惠普上海儀器有限公司;1260 Infinity 液相色譜 安捷倫;BILON-WSN4A 烏氏粘度計(jì) 上海比朗儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 粘均分子量的測(cè)定 采用文獻(xiàn)[8]中測(cè)定高分子特征黏度的方法。

1.2.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 采用福林酚法。

1.2.3 比旋度測(cè)定 參照中國(guó)藥典附錄的方法[9]。

1.2.4 CS含量測(cè)定 采用美國(guó)藥典氯化十六烷基吡啶(Hexadecylpyridinium chloride,CPC)法檢測(cè)[10]。

1.2.5 硫酸軟骨素二糖的測(cè)定 采用高效液相法:ZorbaxSAX色譜柱4.6 mm×250 mm,流速1.5 mL·min-1,柱溫35 ℃,紫外232 nm檢測(cè)。流動(dòng)相A為0.2 mol·L-1NaCl,pH3.5,流動(dòng)相B1.5 mol·L-1NaCl,pH3.5[11]。

表1 不同品種魷魚(yú)硫酸軟骨素基本理化性質(zhì)

1.2.6 硫酸軟骨素的分離 取1 kg鮮新魷魚(yú)軟骨,勻漿后加入5.0 L純化水,使用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH7.5～8.0,加入4.0 g(相當(dāng)于軟骨質(zhì)量的0.4%)木瓜蛋白酶于50 ℃水解6 h。調(diào)節(jié)pH6.0,85 ℃處理10 min。將水解液5000 r/min離心20 min后去除不容物后再用微孔濾膜過(guò)濾澄清。

1.2.7 硫酸軟骨素的純化及得率 純化的過(guò)程分為超濾濃縮和乙醇沉淀兩個(gè)部分。超濾選用截留分子量10 ku的超濾膜進(jìn)行水解液的濃縮,將料液濃縮到1/6體積。濃縮后的料液加入四倍體積無(wú)水乙醇,2000 r/min離心5 min得到硫酸軟骨素沉淀,于60 ℃烘干4 h。CS得率的計(jì)算公式如下:

CS得率(%)=硫酸軟骨素沉淀重量/魷魚(yú)軟骨重量×100

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸軟骨素基本理化性質(zhì)

由表1可知,四種魷魚(yú)CS的粘均分子量差別很大,其中美洲大赤魷體重最大,其CS粘均分子量1.57×105,也是最大的,阿根廷魷魚(yú)體型偏小,其CS粘均分子量為6.7×104,但以上4種魷魚(yú)軟骨素粘均分子量都高于鯊魚(yú)硫酸軟骨素(4.5×104)和豬硫酸軟骨素(2.1×104)[12];四種魷魚(yú)中蛋白質(zhì)含量在2.9%～3.6%之間,都滿足美國(guó)藥典小于6.0%的質(zhì)量要求[10],其中北太平洋魷魚(yú)的蛋白質(zhì)含量最小,若對(duì)CS產(chǎn)品純度要求較高時(shí),北太平洋魷魚(yú)可作為首選。

比旋度是各國(guó)藥典中鑒別不同生物來(lái)源CS的方法之一。四種魷魚(yú)CS比旋度都在-25°左右,差別不大。這與同為海洋動(dòng)物的鯊魚(yú)CS(-12°～-19°)不一致,而與陸生動(dòng)物的比旋度相接近(-20°～-30°)[13]。

CS得率在2.7%～3.3%之間,其中阿根廷魷魚(yú)最高(3.3%),但都比一般陸生動(dòng)物的低,比如新鮮的豬和牛鼻軟骨硫酸軟骨素含量就高達(dá)10%[3]。

2.2 硫酸軟骨素二糖的構(gòu)成

使用硫酸軟骨素ABC酶將不同魷魚(yú)硫酸軟骨素徹底水解成二糖,采用中國(guó)藥典所用酶解高效液相的分析方法,可分析出其中的二糖含量,結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知,四種魷魚(yú)的二糖單位CS-0含量在17.7%～21.7%之間,一般陸生動(dòng)物如牛和豬來(lái)源的CS中CS-0含量?jī)H為6.0%～9.0%,這也是魷魚(yú)CS與陸生動(dòng)物CS二糖含量的差別之一。

表2 不同品種魷魚(yú)軟骨硫酸軟骨素二糖組成

注:鯊魚(yú)軟骨素中的雙硫酸化二糖不是CS-E,而是CS-D。但是四種魷魚(yú)CS中CS-A單位與CS-C單位的比例卻與陸生動(dòng)物的類(lèi)似(均大于1.0),尤其與牛CS(1.4～1.8)最為相近,與鯊魚(yú)的不同(小于1.0)[14]。

魷魚(yú)CS擁有特殊的二糖單元,即CS-E,其一個(gè)二糖單元含有兩個(gè)硫酸基。四種魷魚(yú)CS中CS-E含量范圍為17%～46.9%,品種之間含量差別較大,以阿根廷魷魚(yú)CS的含量最高。魷魚(yú)CS在與蛋白質(zhì)或其他細(xì)胞組分發(fā)生相互反應(yīng)時(shí),硫酸基起到了非常重要的作用[1],因此阿根廷魷魚(yú)提取的CS可能具有更高的生物活性。

現(xiàn)以美洲大赤魷硫酸軟骨素為例,其酶解高效液相圖譜見(jiàn)圖2。

圖2 美洲大赤魷硫酸軟骨素酶解高效液相圖Fig.2 Dosidicus gigas cartilage chondroitin sulfate enzymolysis-HPLC

3 結(jié)論

本文比較了四種魷魚(yú)軟骨硫酸軟骨素的粘均分子量、蛋白質(zhì)含量、CS含量和二糖單元組成等影響硫酸軟骨素作為藥物的理化性質(zhì)。其中不同品種魷魚(yú)其粘均分子量范圍為6.7×104～1.57×105,魷魚(yú)特有的CS-E二糖單元含量差別較大,其中阿根廷魷魚(yú)CS-E二糖含量最高。本文為選擇魷魚(yú)軟骨作為硫酸軟骨素原料提供了數(shù)據(jù)參考。

[1]Shuhei Yamada,Kazuyuki Sugahara. Potential Therapeutic application of chondroitin sulfate/dermatan sulfate[J].Current Drug Discovery Technologies,2008,5(4):289-301.

[2]Nicola Volpi. Analytical aspects of pharmaceutical grade

chondroitin sulfates[J].Pharmaceutical Sciences,2007,96(12):3168-3180.

[3]Chiara Schiraldi,Donatella Cimini,Mario De Rosa. Production of chondroitin sulfate and chondroitin[J]. Appl Microbiol Biotechnol,2010,87:1209-1220.

[4]Bergefall K,Trybala E,Johansson M,et al.Chondroitin sulfate characterized by the E-disaccharide unit is a potent inhibitor of herpes simplex virus infectivity and provides the virus binding sites on gro2C cells[J].Virology,1995,208(2):531-539.

[5]Sato Y,Nakanishi K,Tokita Y,et al. A highly sulfated chondroitin sulfate preparation,CS-E,prevents excitatory amino acid-induced neuronal cell death[J].J Neurochem,2008,104(6):1565-1576.

[6]Li F,Ten Dam GB,Murugan S,et al. Involvement of highly sulfated chondroitin sulfate in the metastasis of the lewis lung carcinoma cells[J].J Biol Chem,2008,283(49):34294-34304.

[7]Toshiyasu Koike,Tadahisa Mikami,Miharu Shida,et al. Chondroitin sulfate-E mediates estrogen-induced osteoanabolism[J].Scientific Reports,2015,5:8994,1-6

[8]史敏娟.低相對(duì)分子質(zhì)量硫酸軟骨素的制備和性質(zhì)研究[D].四川:西南科技大學(xué),2013.

[9]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典第二部[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015:1340-1341.

[10]United States Pharmacopeia(USP 39-NF34)[M]. The United States:The United States Pharmacopeia Convention,2016:6570-6572.

[11]王皓,于廣利,趙峽.大鼠腎臟糖胺聚糖的種類(lèi)及其二糖組成分析[J].光譜學(xué)與光譜分析,2010,30(9):2484-2487.

[12]孫凌云,范慧紅.高效凝膠滲透色譜法測(cè)定硫酸軟骨素的分子量及其分布[J].中國(guó)生化藥物雜志,2001,22(4):180-181.

[13]范慧紅.硫酸軟骨素質(zhì)量控制研究進(jìn)展[C].2015第七屆硫酸軟骨素會(huì)議專(zhuān)刊,15-28.

[14]Neha S Gandhi,Ricardo L Mancera. The structure of glycosaminoglycans and their interactions with proteins[J]. Chemical Biology Drug Design,2008,72(6):455-482.

The properties of chondroitin sulfate from variousOmmastrephidaes

LI Yan-ni,GUO Lin,XU Wei-na

(School of Enology,Binzhou Medical College,Yantai 264003,China)

Chondroitin sulfate(CS)was purified from the cartilage of Dosidicus gigas,Ommastrephes bartramii,Illex argentinus,Todarodes pacificus,and characterized in an effort to find alternative sources and new peculiar structures of this complex biomacromolecule utilized in the pharmaceutical and nutraceutical industry. Molecular mass values of CS was ranging from 6.7×104for Illex argentinus up to 1.57×105for Dosidicus gigas. The disulfated disaccharides was in a range of 17.0%～46.9%. The presence of theseOmmastrephidaesmay be a useful marke for the origin of CS.

Ommastrephidaes;Chondroitin Sulfate;Enzymolysis-HPLC;CS-E

2016-06-28

李燕妮(1980-)，女，碩士，講師，研究方向：海洋產(chǎn)物分離提取，E-mail：lyn0158@126.com。

山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃(J16LC57)。

TS

A

1002-0306(2016)20-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.20.000