鹵米松對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞維生素D受體表達(dá)的影響

劉　蓮，張　斌，何　威，王儒鵬，周春麗，王　為，王玉娟，黃　珂

? 論著 ?

鹵米松對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞維生素D受體表達(dá)的影響

劉蓮，張斌，何威，王儒鵬，周春麗，王為，王玉娟，黃珂

劉　蓮

目的觀察鹵米松對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞維生素D受體（vitamin D receptor，VDR）表達(dá)的影響，以探討糖皮質(zhì)激素對(duì)維生素D3衍生物治療銀屑病效應(yīng)的潛在影響。方法采用CCK8法觀察不同濃度鹵米松、卡泊三醇在不同時(shí)相點(diǎn)下對(duì)HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的影響；采用反轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、蛋白印跡法，觀察不同濃度鹵米松在不同時(shí)相點(diǎn)作用下HaCaT細(xì)胞VDR的表達(dá)情況。結(jié)果鹵米松可增強(qiáng)卡泊三醇對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的抑制作用；鹵米松作用24 h、48 h后，HaCaT細(xì)胞中VDR mRNA及蛋白水平均明顯升高，并呈劑量依賴性效應(yīng)。結(jié)論鹵米松上調(diào)VDR的表達(dá)可能有助于提高角質(zhì)形成細(xì)胞對(duì)維生素D3衍生物作用的反應(yīng)性，從而有可能提高維生素D3衍生物對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的治療效應(yīng)。

鹵米松；卡泊三醇；維生素D受體；增殖；角質(zhì)形成細(xì)胞

尋常性銀屑病是一種以紅斑、鱗屑為主要臨床表現(xiàn)的慢性復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚疾病，以表皮細(xì)胞過(guò)度增殖、異常分化為其組織病理特征[1]。外用療法為治療銀屑病的主要手段之一，糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid，GC）和維生素D3衍生物（vitamin D3 analog）是治療銀屑病的一線外用藥物之一。GC與維生素D3衍生物主要分別通過(guò)與細(xì)胞中對(duì)應(yīng)的受體GRα、VDR相結(jié)合而發(fā)揮效應(yīng)。大量臨床觀察表明，GC聯(lián)合維生素D3衍生物外用治療銀屑病的療效明顯優(yōu)于兩藥單用[2]。曾有研究發(fā)現(xiàn)地塞米松可上調(diào)小鼠鱗狀細(xì)胞癌癌細(xì)胞中VDR的表達(dá)[3]，這提示了GC對(duì)VDR表達(dá)的潛在調(diào)節(jié)效應(yīng)。鑒于GRα和VDR均屬于核受體超家族成員并可能存在著一定程度的相互影響，那么當(dāng)外用GC與維生素D3衍生物聯(lián)合治療銀屑病時(shí)，GC是否對(duì)維生素D3衍生物的治療效應(yīng)產(chǎn)生影響呢？為此，本實(shí)驗(yàn)以HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察不同濃度鹵米松、卡泊三醇在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT細(xì)胞）增殖的影響及鹵米松作用后VDR的表達(dá)情況，以探討鹵米松對(duì)維生素D3衍生物治療效應(yīng)的潛在影響。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞來(lái)源HaCaT細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細(xì)胞所。

1.1.2主要試劑卡泊三醇、鹵米松（澳美藥業(yè)惠贈(zèng)），二甲基亞砜（美國(guó)Sigma公司），胎牛血清（杭州四季青公司），1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶（Hyclone公司），兔抗人VDR多克隆抗體（美國(guó)Abcam公司），兔抗小鼠GAPDH單克隆抗體（碧云天生物工程有限公司），辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔、辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗小鼠（北京中杉金橋公司），聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜，Millipore公司），BeyoECL Plus顯色試劑（碧云天生物工程有限公司），RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTM II試劑盒（日本TaKaRa Bio株式會(huì)社），CCK-8試劑盒（日本同仁生化研究所）。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及處理用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。根據(jù)國(guó)外相關(guān)研究[4,5]和本課題組預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將鹵米松和卡泊三醇溶解于二甲基亞砜中配置成10-1mol/L的原液，使用時(shí)再用完全培養(yǎng)基稀釋，設(shè)定鹵米松和卡泊三醇的作用濃度和時(shí)間，以含不同濃度的鹵米松（10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/ L、10-4mol/L）、 卡 泊 三 醇（10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L）及未加藥的培養(yǎng)液作用于HaCaT細(xì)胞24 h、48 h，分別收集細(xì)胞中的蛋白質(zhì)和RNA。

1.2.2CCK-8增殖試驗(yàn)選用3～5代HaCaT細(xì)胞為研究對(duì)象，將HaCaT細(xì)胞配制成細(xì)胞懸液，96孔板中每孔加入3×103個(gè)細(xì)胞，設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)12 h后棄培養(yǎng)基，加入100 μl不同濃度卡泊三醇溶液（10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L）。參照文獻(xiàn)[6]，選用10-5mol/L鹵米松與不同濃度卡泊三醇（10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L）混合后作用于HaCaT細(xì)胞，加藥24 h、48 h后，棄培養(yǎng)基，PBS洗2遍，每孔中加入含10% CCK-8的無(wú)血清培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min，用酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)各孔A值，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.3qRT-PCR

1.2.3.1引物設(shè)計(jì)按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR原則設(shè)計(jì)引物，檢索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)、Nucleotide數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)計(jì)內(nèi)參引物三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH），GAPDH引物：上游CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG，下游CGTCAAAGGTGGAGGAGTGG，擴(kuò)增片段119 bp，VDR引物：上游CAGAGTGTGGGAAGGGAGAG，下游TTGGGTGGTGGAGTGAGAAT，擴(kuò)增片段111 bp，均已行BLAST特異性驗(yàn)證，引物由上海英濰捷基生物公司合成。

1.2.3.2RNA提取參照RNAiso Plus說(shuō)明書進(jìn)行RNA提取，采用雙光束微量核酸蛋白測(cè)定儀于A260/ A280比值判定RNA純度，并取4 μl RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，驗(yàn)證RNA的完整性。

1.2.3.3cDNA合成參照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser說(shuō)明書配制相關(guān)試劑，42℃2 min去除基因組DNA，37℃ 15 min、85℃ 5 s反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，向體系中加入180 μl無(wú)菌水稀釋10倍，-20℃保存。

1.2.3.4qRT-PCR反應(yīng)和結(jié)果分析參照SYBR?Premix Ex TaqTMII說(shuō)明書，選擇20 μl反應(yīng)體系，設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，兩步法擴(kuò)增，預(yù)變性1個(gè)循環(huán)95℃ 30 s，PCR反應(yīng)40個(gè)循環(huán)95℃ 15 s、60℃ 34 s，融解曲線1個(gè)循環(huán)95℃ 15 s、60℃ 1 min、95℃ 15 s。采用2-△△CT法對(duì)qRT-PCR結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4Western blot檢測(cè)冰PBS洗不同組別的HaCaT細(xì)胞1次，加入預(yù)冷的含PMSF的全細(xì)胞裂解液于冰上裂解20 min，4℃離心（12 000 r/ min）5 min后保留上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度后加入上清1/4量的蛋白上樣緩沖液，沸水煮8 min，以5%上層膠、10%下層膠的SDS-聚丙烯胺凝膠電泳（恒壓100 V，70 min），電泳結(jié)束后將蛋白印跡到PVDF膜上（100 mA，60 min），6%的脫脂牛奶封閉2 h，TBST洗膜4次×5 min，將PVDF膜和一抗（VDR和GAPDH一抗工作濃度1∶1000）加入抗體孵育盒中4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜4次×5 min，二抗（辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔、辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗工作濃度1∶1000）37℃孵育1 h，TBST洗膜4次×5 min，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17進(jìn)行分析,單組采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較用LSD法，兩組效應(yīng)采用析因設(shè)計(jì)方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1鹵米松對(duì)卡泊三醇抑制HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的影響

CCK8法檢測(cè)HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖，增殖率=實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%。與對(duì)照組比較，不同濃度卡泊三醇作用于HaCaT細(xì)胞24 h、48 h后，顯著抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖（P＜0.05），呈濃度依賴性趨勢(shì)（圖1a）。在10-5mol/L鹵米松作用下，不同濃度卡泊三醇作用于HaCaT細(xì)胞24 h、48 h后，卡泊三醇對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的濃度依賴性抑制效應(yīng)仍有增強(qiáng)（圖1b）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)鹵米松與卡泊三醇兩藥聯(lián)用對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的抗增殖作用較單用卡泊三醇的抗增殖作用更強(qiáng)（P＜0.05），說(shuō)明兩藥之間有交互效應(yīng)。

圖1　CCK8法檢測(cè)各組角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖情況

2.2鹵米松對(duì)HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞VDR mRNA表達(dá)的影響

不同濃度鹵米松作用于HaCaT細(xì)胞24 h、48 h后，經(jīng)qRT-PCR檢測(cè)VDR的表達(dá)，采用2-△△CT法計(jì)算各組表達(dá)量，結(jié)果表明：①與對(duì)照組比較，不同濃度鹵米松作用HaCaT細(xì)胞24 h后，VDR mRNA表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），并呈劑量依賴性；②與對(duì)照組比較，鹵米松作用HaCaT細(xì)胞48 h后，VDR mRNA仍上調(diào)（P＜0.05），無(wú)明顯劑量依賴性（圖2）。

圖2　qRT-PCR檢測(cè)各組VDR mRNA表達(dá)情況

2.3鹵米松對(duì)HaCaT細(xì)胞中VDR蛋白表達(dá)的影響

不同濃度鹵米松作用于HaCaT細(xì)胞24 h、48 h后，經(jīng)Western blot檢測(cè)，VDR蛋白的相對(duì)量結(jié)果表明：與對(duì)照組比較，不同濃度鹵米松作用于HaCaT細(xì)胞24 h、48 h后，VDR蛋白表達(dá)均上調(diào)（P＜0.05），并呈劑量依賴性（圖3）。

圖3　Western blot檢測(cè)各組VDR蛋白表達(dá)情況

3　討論

尋常性銀屑病是皮膚科臨床常見的慢性復(fù)發(fā)性炎癥性疾病。糖皮質(zhì)激素和維生素D3衍生物是銀屑病外用治療中的一線藥物。鹵米松是一種強(qiáng)效的外用糖皮質(zhì)激素，具有抗炎、免疫抑制、抗細(xì)胞增殖等作用。GC主要是通過(guò)與細(xì)胞質(zhì)中GRα結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)作用，GC與GRα的復(fù)合體移位至細(xì)胞核內(nèi)與糖皮質(zhì)激素受體操縱元件(GRE)結(jié)合后，進(jìn)而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[7]。維生素D3衍生物主要與細(xì)胞核內(nèi)的VDR結(jié)合后，與類視黃醇x受體（RXR）形成異二聚體VDR-RXR，再與靶基因上的維生素D受體操縱元件（VDRE）結(jié)合，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，發(fā)揮抗細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞分化、免疫調(diào)節(jié)等功能，此外還可與細(xì)胞膜上的VDR結(jié)合而發(fā)揮調(diào)節(jié)鈣、磷代謝的作用[8]。

鹵米松與維生素D3衍生物分別通過(guò)與核激素受體GRα、VDR結(jié)合而發(fā)揮效應(yīng)。Yu等[9]研究發(fā)現(xiàn)，采用地塞米松作用于小鼠鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞（SCCVII/ SF）后，可上調(diào)小鼠癌細(xì)胞中VDR的表達(dá)，提示地塞米松可通過(guò)上調(diào)細(xì)胞中VDR的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)1,25-二羥維生素D3的抗腫瘤細(xì)胞效應(yīng)。Hidalgo等[3]發(fā)現(xiàn)，地塞米松可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)SCCVII/SF細(xì)胞中VDR的表達(dá)，呈時(shí)間及劑量依賴性，且該作用與GR的表達(dá)密切相關(guān)，因此認(rèn)為GR、VDR可能存在交叉對(duì)話情況，且推測(cè)GC能增強(qiáng)維生素D3衍生物的抗腫瘤效應(yīng)。此外，Swami等[10]發(fā)現(xiàn)，維生素D3可下調(diào)人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）中的雌激素受體的表達(dá)。上述研究結(jié)果提示了不同核激素受體之間的相互影響，也對(duì)本課題組觀察鹵米松對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞VDR表達(dá)的影響的相關(guān)研究的展開具有啟示作用。

筆者的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)10-5mol/L鹵米松作用后，卡泊三醇對(duì)HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞的抗增殖作用明顯增強(qiáng)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)，鹵米松與卡泊三醇具有交互效應(yīng)。由此引發(fā)我們對(duì)這一現(xiàn)象發(fā)生的內(nèi)在原因的興趣，促使我們進(jìn)一步探討鹵米松對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞VDR表達(dá)的影響。本研究發(fā)現(xiàn)鹵米松在不同時(shí)相點(diǎn)作用后，HaCaT細(xì)胞VDR無(wú)論是在mRNA或者是蛋白水平均有上調(diào)的現(xiàn)象，并呈濃度依賴性效應(yīng)。這提示GRα、VDR兩類核激素受體之間可能存在交叉對(duì)話途徑，這與Hidalgo等、Yu等的發(fā)現(xiàn)具有相似性。鹵米松對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞VDR表達(dá)的上調(diào)效應(yīng)，不但可部分解釋鹵米松增強(qiáng)卡泊三醇抑制HaCaT細(xì)胞增殖效應(yīng)的現(xiàn)象，還可能部分解釋臨床實(shí)踐中所觀察到的糖皮質(zhì)激素與維生素D3衍生物外用治療銀屑病的療效優(yōu)于藥物單用的現(xiàn)象，這為臨床上外用鹵米松與維生素D3衍生物聯(lián)合治療銀屑病提供了一定的實(shí)驗(yàn)研究依據(jù)。目前就GRα、VDR核激素受體之間如何進(jìn)行交叉對(duì)話的確切機(jī)制尚不清楚，仍有待進(jìn)一步研究。

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（本文編輯敖俊紅）

Effects of halometasone on expression of vitamin D receptor in human HaCaT keratinocytes

LIU Lian，ZHANG Bin，HE Wei，et al
Department of Dermatology, Xinqiao Hospital, the Third Military Medical University, Chongqing 400037, China

ObjectiveTo investigate the effects of halometasone on the expression of vitamin D receptor(VDR) in human keratinocytes so as to evaluate the potential effects of halometasone on the therapeutic efficacy of topical vitamin D3 analog in psoriasis. Methods HaCaT cells were treated by halometasone and calcipotriol with different concentrations for various durations. The cell proliferation was observed by CCK8 assay. Quantitative real-time PCR and Western blotting were used to detect the expression level of VDR mRNA and protein. Results Halometasone significantly enhanced the inhibitory effects of calcipotriol on keratinocyte proliferation. Halometasone upregulated the expression of VDR at the level of mRNA and protein in a concentration-dependent manner. ConclusionThe upregulation of VDR expression by halometasone in keratinocytes may partly explain the phenomenon that halometasone could enhance the therapeutic efficacy of topical vitamin D3 analog in the treatment of psoriasis.

Halometasone；Calcipotriol；Vitamin D receptor；Proliferation；Keratinocyte [JPractDermatol, 2016, 9(2):81-83]

R986；R758.63

A

1674-1293(2016)02-0081-03

10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20160201

中華醫(yī)學(xué)會(huì)皮膚性病學(xué)分會(huì)澳美制藥銀屑病研究基金

重慶400037，第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚科及風(fēng)濕免疫科（劉蓮，張斌，何威，王儒鵬，周春麗，王為，王玉娟，黃珂）

劉蓮，在讀碩士研究生，住院醫(yī)師，研究方向：鹵米松與卡泊三醇對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞作用的影響及機(jī)制研究，E-mail: liulian422@163.com

何威，E-mail: weiheskin@163.com

（2016-01-20

2016-03-03）