薄層掃描法測定毛頭牛蒡子中牛蒡苷和苷元的含量

趙 爽， 駱秀珍， 唐 瑤， 韋 朔， 古麗阿扎提·買合買提， 周曉英

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 烏魯木齊 830011)

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薄層掃描法測定毛頭牛蒡子中牛蒡苷和苷元的含量

趙 爽， 駱秀珍， 唐 瑤， 韋 朔， 古麗阿扎提·買合買提， 周曉英

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 烏魯木齊 830011)

目的 測定毛頭牛蒡子中牛蒡苷和苷元的含量。方法 以氯仿-甲醇(10∶1)為展開劑，在高效薄層板上對毛頭牛蒡子中的牛蒡苷及苷元進(jìn)行分離，并以280 nm為檢測波長對毛頭牛蒡子進(jìn)行掃描測定。結(jié)果 牛蒡苷和牛蒡苷元的線性范圍分別為1.020～6.120、0.101～0.606 μg；加樣回收率分別為99.71%和98.11%,毛頭牛蒡子中牛蒡苷和苷元的含量分別為93.75 mg/g 和2.05 mg/g。結(jié)論 薄層掃描法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于測定毛頭牛蒡子中牛蒡苷和苷元的含量。

毛頭牛蒡子； 薄層掃描； 牛蒡苷； 苷元

毛頭牛蒡(Arctium tomentosum Mill)在新疆分布廣泛，是新疆特有的藥用植物，其干燥成熟果實(shí)毛頭牛蒡子在維吾爾醫(yī)中用于多種疾病的治療[1]。毛頭牛蒡子中含有氨基酸、多糖、木脂素、脂肪油等多種化學(xué)成分[2-4]。有研究表明木脂素類化學(xué)成分具有抗腫瘤、抗炎等活性[5-7]。本研究采用薄層色譜掃描法測定毛頭牛蒡子中牛蒡苷和牛蒡苷元的含量，該法操作方便、快速，可為毛頭牛蒡子的質(zhì)量控制提供依據(jù),現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 XS105型十萬分之一電子天平(瑞士梅特勒-托利多)，RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器(上海亞榮生化儀器廠)，Linomat5薄層色譜點(diǎn)樣器(CAMAG)，薄層色譜點(diǎn)樣針(CAMAG)，薄層色譜照相儀(REPROSTAR3)，TLC SCANNER3薄層掃描儀(CAMAG)，薄層板加熱器(CAMAG)，薄層色譜展開缸(上海信宜儀器廠)，超聲清洗儀(SK3200H，上海漢克科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試藥 毛頭牛蒡子采集于新疆阿勒泰地區(qū)，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院李永和主任藥師鑒定為毛頭牛蒡(Arctium tomentosum Mill)的干燥成熟果實(shí)，牛蒡子苷對照品(上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：090516)，牛蒡苷元對照品(上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：090712)，甲醇、氯仿均為分析純試劑(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品溶液的制備 精密稱取毛頭牛蒡子粉末0.300 0 g用石油醚回流脫脂后,將毛頭牛蒡子粉末置于錐形瓶中，加入甲醇30 mL，超聲提取30 min，將提取液過濾，蒸干，殘?jiān)舆m量甲醇溶解，定容至10 mL，過0.22 μm微孔濾膜，備用。

2.2 對照品溶液的配制 精密稱取牛蒡苷0.010 2 g和牛蒡苷元0.010 1 g，分別加甲醇溶解定容至5 mL。吸取牛蒡苷和牛蒡苷元對照品溶液各5 mL和0.5mL，加甲醇定容至10 mL，作為混合對照品溶液，備用(其中牛蒡苷和牛蒡苷元的濃度分別為1.020 mg/mL和0.101mg/mL)。

2.3 薄層層析及薄層掃描條件 高效硅膠G板(安徽良臣)預(yù)先在110℃活化30 min，冷卻至室溫備用。分別取對照品溶液3 μL、樣品溶液2 μL點(diǎn)于薄層板，以氯仿∶甲醇(10∶1)為展開劑展開，取出晾干，在365 nm下掃描。檢測波長：280 nm，帶寬：6 mm，狹縫：4.00 mm×0.3 mm，掃描速度：20 mm/s，掃描結(jié)果見圖1～3。

圖1 混合對照品薄層掃描圖

圖2 毛頭牛蒡子樣品薄層掃描圖

圖3 毛頭牛蒡子樣品及混合對照品的3D掃描圖

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 μL點(diǎn)于同一高效硅膠G板，按“2.3”項(xiàng)下方法測定吸光度積分值，以混合對照品點(diǎn)樣量為自變量(X)，峰面積積分值為因變量(Y)，進(jìn)行線性回歸，得牛蒡苷回歸方程：Y=2 131X+1 504.7，r=0.999 3；牛蒡苷元回歸方程：Y=775.04X-255.37，r=0.999 4。結(jié)果表明，牛蒡苷和牛蒡苷元分別在1.020～6.120 μg和0.101～0.606 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對照品溶液2、4、6 μL，在1 d內(nèi)分別測定相同點(diǎn)樣量的對照品6份，為日內(nèi)精密度；分別測定相同點(diǎn)樣量的樣品各6份，連續(xù)測定3 d，為日間精密度，操作方法同“2.3”項(xiàng)下。結(jié)果牛蒡苷和牛蒡苷元日內(nèi)精密度的RSD分別為1.82%、2.36%，牛蒡苷和牛蒡苷元日間精密度的RSD分別為1.14%、1.34%，表明精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，于0、2、4、6、8、12、24、48 h測定結(jié)果，牛蒡苷和牛蒡苷元峰面積積分值的RSD(n=6)分別為1.54%、1.92%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.7 穩(wěn)健性試驗(yàn) 穩(wěn)健性試驗(yàn)是通過改變某個(gè)特定的色譜參數(shù)，進(jìn)行重復(fù)的試驗(yàn)，來考察結(jié)果是否隨著色譜參數(shù)的變化而產(chǎn)生改變。本試驗(yàn)通過對展開劑的組成、飽和時(shí)間、展開劑的體積、相對濕度、掃描時(shí)間及展開距離進(jìn)行微小改變來考察穩(wěn)健性。結(jié)果這些改變對牛蒡苷和牛蒡苷元的影響較小，RSD為0.94%～2.58%，RSD均<3%，表明試驗(yàn)穩(wěn)健性較好，見表1。

表1 穩(wěn)健性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.8 回收率試驗(yàn) 取已知含量的牛蒡苷和牛蒡苷元的毛頭牛蒡子粉末5份，分別加入牛蒡苷9.376 mg、牛蒡苷元0.204 mg，加標(biāo)樣品按“2.1”項(xiàng)下方法提取，按“2.3”項(xiàng)下方法展開及測定。結(jié)果牛蒡苷的平均回收率為99.71%，RSD=1.19%；牛蒡苷元的平均回收率為98.11%，RSD=1.38%(n=5)。結(jié)果表明，該方法用于測定牛蒡苷和牛蒡苷元含量準(zhǔn)確可靠。

2.9 檢測限和定量限 精密量取一定量的牛蒡苷和牛蒡苷元對照品，用甲醇稀釋成每1 mL含0.005 1 mg牛蒡苷和牛蒡苷元0.004 0 mg的溶液，點(diǎn)于同一高效硅膠G板，分別點(diǎn)樣1、2、3、4、5 μL，每個(gè)點(diǎn)點(diǎn)3次，按“2.3”項(xiàng)下條件展開，掃描。信噪比S/N為3∶1時(shí)的樣品濃度為檢測限，信噪比S/N為10∶1時(shí)的樣品濃度為定量限。結(jié)果牛蒡苷的檢測限為15.3 ng，定量限為51.0 ng；牛蒡苷元的檢測限為12.0 ng，定量限為40.0 ng。

2.10 樣品含量的測定 按“2.1”項(xiàng)下方法對毛頭牛蒡子樣品進(jìn)行提取，按“2.3”項(xiàng)下方法展開及測定，計(jì)算樣品中牛蒡苷和牛蒡苷元的含量，結(jié)果牛蒡苷和牛蒡苷元的含量分別為93.75 mg/g和 2.05 mg/g，見表2。

表2 毛頭牛蒡子中牛蒡苷和牛蒡苷元含量(n=3)

3 討論

在供試品溶液的制備過程中，由于毛頭牛蒡子中含有大量的脂肪油，故在提取前需進(jìn)行脫脂，避免干擾，故采用石油醚回流脫脂。本研究考察了氯仿-甲醇、氯仿-甲醇-冰乙酸、氯仿-甲醇-水-甲酸-冰乙酸3種展開系統(tǒng)對毛頭牛蒡子中的牛蒡子苷及苷元的展開效果，結(jié)果氯仿-甲醇系統(tǒng)展開效果較好，且氯仿-甲醇比例為10∶1時(shí)展開所得薄層色譜圖分離效果最好，故采用此展開條件。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明，薄層色譜掃描法測定毛頭牛蒡子中的牛蒡苷和牛蒡苷元，操作簡單、方便，線性、精密度、穩(wěn)定性、穩(wěn)健性均良好，可用于毛頭牛蒡子中牛蒡苷和苷元含量的測定。

[1] 駱秀珍,張浩科,周曉英,等.毛頭牛蒡子的紅外光譜分析及薄層色譜鑒別[J].西北藥學(xué)雜志,2015,30(4):352-354.

[2] 季志紅,阻力皮亞·艾山,周曉英.大孔吸附樹脂分離純化毛頭牛蒡子多糖的工藝研究[J]. 環(huán)球中醫(yī)藥,2013,6(2):81-83.

[3] 杜為軍,馬翠嬌,周曉英.毛頭牛蒡子中總木脂素含量測定[J].新疆師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2013,32(4):41-43.

[4] 周曉英,季志紅,劉露,等.維藥毛頭牛蒡子脂肪酸成分的GC-MS分析[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2013,36(4):464-471.

[5] 蘇勤勇,李曉梅,姚景春,等.牛蒡子苷元對大鼠腦膠質(zhì)瘤的作用及初步作用機(jī)制探討[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2015,31 (6):805-809.

[6] Wu JG,Wu JR,Sun LN, et al. Ameliorative effects of arctiin from Arctium lappa on experimental glomerulonephritis in rats[J]. J of Phytomed, 2009, 16(11): 1033-1041.

[7] Wu X, Dou YN, Yang Y, et al. Arctigenin exerts anti-colitis efficacy through inhibiting the differentiation of Th1 and Th17 cellsviaan mTORC1-dependent pathway[J]. Bioch Pharm, 2015, 96(11): 323-336.

(本文編輯 施洋)

Determination of arctiin and arctigenin in Arctium tomentosum Mill seeds with TLCS

ZHAO Shuang, LUO Xiuzhen， TANG Yao, WEI Shuo, Gulazat Mahmut, ZHOU Xiaoying

(PharmacyCollege，XinjiangMedicalUniversity，Urumqi830011，China)

Objective To set up the contents determination method of arctiin and arctigenin in Arctium tomentosum Mill seeds. Methods A TLCS method was used. The developer was consisted of chloroform and n-butyl alcohol of 10∶1, arctiin and arctigenin were isolated by high performance thin layer plate and scanned at 280 nm. Results The liner ranges of calibration curves were 1.020-6.120 mg/mL and 0.101-0.606 mg/mL for arctiin and arctigenin respectively. The sample recovery rate of arctiin and arctigenin were 99.71% and 98.11% respectively. Contents of arctiin and arctigenin in Arctium tomentosum Mill seeds were 93.75 mg/g and 2.05 mg/g respectively. Conclusion The method is simple, accurate, reproducible and can be used to determine the contents of arctiin and arctigenin of Arctium tomentosum mill.

ArctiumtomentosumMill seeds; TLCS; arctiin; arctigenin

新疆醫(yī)科大學(xué)第十期大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目(201510760020)

趙 爽(1995-)，女，在讀本科，研究方向：天然產(chǎn)物的活性篩選。

周曉英，女，碩士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：天然產(chǎn)物的質(zhì)量控制與活性篩選，E-mail：xy_zhou@qq.com。

R914

A

1009-5551(2016)12-1566-03

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.12.020

20196-4-16]