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    RNA干擾SBF2對人口腔癌細胞株SCC15增殖、凋亡及侵襲的影響

    2016-12-06 03:35:13李天客張素欣
    中國老年學雜志 2016年21期
    關鍵詞:口腔癌細胞株抑制率

    李天客 陳 中 包 陽 張素欣

    (河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院口腔科,河北 石家莊 050071)

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    RNA干擾SBF2對人口腔癌細胞株SCC15增殖、凋亡及侵襲的影響

    李天客 陳 中 包 陽 張素欣

    (河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院口腔科,河北 石家莊 050071)

    目的 探討RNA干擾SET結合因子2(SBF2)表達對人口腔癌細胞株SCC15增殖、凋亡及侵襲的影響。方法 根據(jù)SBF2的mRNA序列及siRNA設計原則,設計并合成3條靶向SBF2基因的siRNA(SBF2-siRNA1、SBF2-siRNA2、SBF2-siRNA3),以陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000為載體轉(zhuǎn)染取對數(shù)生長期SCC15細胞,同時設轉(zhuǎn)染不針對任何基因的隨機序列(siRNA-NC)。轉(zhuǎn)染48 h后采用實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測SBF2干擾效率,分別于轉(zhuǎn)染24、48、72 h采用WST-1法評價討RNA干擾SBF2對SCC15細胞增殖的影響,分別于轉(zhuǎn)染24、48 h后采用Annexin V-FITC/PI雙標流式細胞術和Transwell小室法檢測SCC15細胞的凋亡率及穿膜細胞數(shù)以評價RNA干擾SBF2對凋亡和侵襲能力的影響。結果 與僅行轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000處理的對照組相比,SBF2-siRNA1、SBF2-siRNA2和SBF2-siRNA3組SCC15細胞中SBF2 mRNA水平均降低(P<0.05),且干擾率由高至低依次為SBF2-siRNA2>SBF2-siRNA3> SBF2-siRNA1,故選取干擾效率最高的SBF2-siRNA2用于后續(xù)實驗。與對照組和siRNA-NC組相比,SBF2-siRNA組的增殖抑制率和凋亡率均升高,而穿膜細胞數(shù)降低,以上差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);對照組和siRNA-NC組以上指標的無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。結論 RNA靶向干擾SBF2表達可抑制人口腔癌細胞增殖及侵襲能力并誘導其凋亡。

    RNA干擾;SET結合因子2;口腔癌;增殖;凋亡

    口腔癌是頭部常見的惡性腫瘤,確切發(fā)病機制尚不清楚,臨床治療手段較局限且效果不理想〔1〕。惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多基因多途徑共同作用的結果,涉及多個基因的異常表達,故探討影響口腔癌惡性行為的關鍵基因?qū)τ谠摬〉姆乐斡兄匾饬x〔2〕。SET結合因子2(SBF2)是一個新近發(fā)現(xiàn)的與癌癥相關的一個因子,Wu等〔3〕發(fā)現(xiàn)SBF2基因與胰腺癌患者的生存有關,Long等〔4〕研究發(fā)現(xiàn)在胰腺癌細胞中靶向沉默SBF2可抑制胰腺癌細胞增殖并誘導其凋亡,以上提示該基因在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中起一定作用,但目前SBF2基因在口腔癌中的作用效果及方式尚不清楚。為此,本研究設計了3條靶向針對SBF2的小干擾RNA(siRNA),通過高效轉(zhuǎn)染常用的口腔癌細胞株SCC15以篩選干擾效果最強的siRNA,進一步觀察對其增殖、凋亡及侵襲的影響。

    1 材料與方法

    1.1 細胞株與試劑 人口腔癌細胞株SCC15購自中國科學院上海細胞庫,WST細胞增殖毒性分析試劑盒購自中國碧云天生物技術有限公司,胎牛血清(FBS)購自TBD公司,RPMI 1640培養(yǎng)基及Opti-MEM培養(yǎng)基購自Gibco BRL公司,Annexin-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自晶美生物工程有限公司,胰蛋白酶購自 Promega公司,陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、Trizol及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Invitrogen公司,核酸染料SYBR Green I購自北京鼎國生物科技有限公司,Transwell小室購自美國Corning公司。

    1.2 細胞培養(yǎng) 將SCC15細胞復蘇后,接種于含10% FBS、100 U/ml青霉素及100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)瓶中,于37℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),48 h后首次更換培養(yǎng)液,棄去未貼壁細胞,此后每2~3 d換液1次,倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài),待達80%~90%融合后,胰酶消化傳代。

    1.3 小干擾RNA引物設計及轉(zhuǎn)染 根據(jù)SBF2的mRNA序列(NM_030962.3)及特異性siRNA引物設計網(wǎng)站(http://sidirect2.rnai.jp)設計3條靶向SBF2基因的siRNA(SBF2-siRNA1、SBF2-siRNA2、SBF2-siRNA3),同時設計不針對任何基因的隨機序列(siRNA-NC),以上序列均由上海吉瑪制藥有限公司合成。SBF2-siRNA1:5′-UUUGAAUUCCCAAUUGCUGGA-3′,SBF2-siRNA2:5′-AUUUUCCUGUAUUAAUUCCUG-3′,SBF2-siRNA3:5′-UAAAGAUCUCUACUACUUCUG-3′,siRNA-NC:5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′ 。

    1.4 siRNA轉(zhuǎn)染 于轉(zhuǎn)染24 h前將對數(shù)生長期SCC15細胞以2×105個/ml的濃度接種于6孔板,將50 μl含200 pmol 靶向SBF2 siRNA的Opti-MEM培養(yǎng)基及50 μl 含轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000的Opti-MEM培養(yǎng)基混合5 min,將以上混合物加入2 ml接種SCC15細胞的不含血清及抗生素的RPMI 1640培養(yǎng)基,4 h后采用含血清的培養(yǎng)基替換,培養(yǎng)48 h后采用實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測SBF2干擾效率。

    1.5 qRT-PCR檢測SCC15細胞中SBF2 mRNA水平 采用Trizol試劑提取SCC15細胞中的總RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄成為cDNA,采用SYBR Green I染料進行RT-PCR擴增,條件:95℃變性3 min,(95 ℃ 30 s+60 ℃ 30 s)共40個循環(huán),72℃ 30 s延伸。采用2-△△Ct進行相對定量分析,計算SBF2相對于內(nèi)參的表達量。SBF2上游引物:5′-AAGGAGTCTGTATTTGGGAATGT-3′,下游引物:5′-GGCTAGAGACGTTTACATTGGG-3′;β-actin上游引物:5′-AGCGGGAAATCGTGCGTGAC-3′,下游引物:5′-ACTCCTGCTTGCTGATCCACATC-3′。選取干擾率最高的siRNA進行后續(xù)試驗,根據(jù)siRNA片段轉(zhuǎn)染情況將SCC15細胞共分為SBF2-siRNA組和siRNA-NC組,同時設僅行轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000處理的對照組。

    1.6 WST-1法檢測細胞增殖 取3組轉(zhuǎn)染后的SCC15細胞,以每孔2×103個接種于96孔板,每組設3個復孔,分別于轉(zhuǎn)染24、48、72 h后向每孔加入WST-1工作液10 μl,繼續(xù)孵育3 h后,于450 nm波長下采用酶標儀檢測吸光值(A),根據(jù)公式計算RNA靶向干擾SBF2相對于對照組的增殖抑制率:抑制率(%)=(A對照組-A干擾組)/A對照組×100%。

    1.7 Annexin V-FITC/PI雙標流式細胞術檢測凋亡情況 收集3組轉(zhuǎn)染24、48 h的SCC15細胞1×106個,經(jīng)PBS緩沖液沖洗后,加入200 μl 1 ×Annexin V結合液懸浮細胞,加入10 μl Annexin-FITC,室溫避光反應10 min后加入10 μl PI,避光反應15 min后,采用FACSCalibur 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

    1.8 Transwell小室檢測細胞侵襲情況 將3組轉(zhuǎn)染后的SCC15細胞置于已經(jīng)Matrigel膠包被的Transwell上室,Transwell下室加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基,24、48 h后用棉簽輕輕擦掉上室側(cè)未穿過膜的細胞以及基質(zhì)膠,下層侵襲的細胞經(jīng)4%多聚甲醛固定30 min,自然風干后用1%結晶紫染色,高倍鏡下(×400)隨機選取5個具有代表性的視野計數(shù)穿膜細胞數(shù)。實驗重復3次。

    1.9 統(tǒng)計學處理 采用SPSS18.0軟件行單因素方差分析(one way ANOVA),兩兩比較采用SNK法。

    2 結 果

    2.1 RNA干擾后SCC15細胞SBF2 mRNA水平變化 與僅行轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000處理的對照組相比,SBF2-siRNA1、SBF2-siRNA2和SBF2-siRNA3組SCC15細胞中SBF2 mRNA水平均降低(P<0.05),且抑制率由高至低依次為SBF2-siRNA2>SBF2-siRNA3> SBF2-siRNA1,故選取干擾效率最高的SBF2-siRNA2用于后續(xù)實驗。siRNA-NC組的SBF2 mRNA水平與對照組的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

    表1 RNA干擾后SCC15細胞SBF2 mRNA水平變化及干擾率

    與對照組比較:1)P<0.05;與SBF2-siRNA1組比較:2)P<0.05;與SBF2-siRNA2組比較:3)P<0.05;與SBF2-siRNA3組比較:4)P<0.05

    2.2 RNA干擾SBF2對SCC15細胞增殖的影響 SBF2-siRNA組SCC15細胞的增殖抑制率均高于對照組和siRNA-NC組(P<0.05),且對照組和siRNA-NC組增殖抑制率無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表2。

    表2 RNA干擾SBF2后SCC15細胞增殖抑制率變化

    與對照組比較:1)P<0.05;與SBF2-siRNA組比較:2)P<0.05,下表同

    2.3 RNA干擾SBF2對SCC15細胞凋亡的影響 SBF2-siRNA組SCC15細胞的凋亡率高于對照組和siRNA-NC組(P<0.05),且對照組和siRNA-NC組凋亡率無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表3。

    表3 RNA干擾SBF2后SCC15細胞凋亡率變化

    2.4 RNA干擾SBF2對SCC15細胞侵襲的影響 SBF2-siRNA組SCC15細胞的穿膜細胞數(shù)低于對照組和siRNA-NC組(P<0.05),且對照組和siRNA-NC組穿膜細胞數(shù)無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表4。

    表4 RNA干擾SBF2后SCC15細胞穿膜細胞數(shù)變化±s,個,n=3)

    3 討 論

    SBF2位于11p15.4,盡管其具有一個非活動性磷酸酶結構域,但其可提高MTMR2的催化活性并可能改變MTMR2的細胞定位〔5〕,而MTMR2在細胞內(nèi)的主要功能為磷脂酰肌醇-3-磷酸酶同時可拮抗某些磷脂酰肌醇-3激酶的活性〔6〕。此外,SBF2與MTMR2構成的復合體可影響某些細胞表面受體的分揀和降解,如介導腫瘤細胞生長的表皮生長因子受體的活性〔7〕,以上提示SBF2可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到一定作用。然而SBF2與口腔癌細胞增殖、凋亡及侵襲的關系目前尚不明確,故本研究設計靶向SBF2的siRNA并轉(zhuǎn)染常用的口腔癌SCC15細胞,采用體外研究的方法觀察干擾SBF2表達對SCC15細胞增殖、凋亡及侵襲的影響。

    本研究在轉(zhuǎn)染靶向SBF2的3條siRNA后發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染后SCC15細胞中的SBF2 mRNA水平均降低,提示靶向干擾成功,可干擾SBF2表達。細胞的增殖及凋亡過程受到嚴格的調(diào)控,兩者的動態(tài)失衡是腫瘤難以有效控制的關鍵,而對于口腔癌細胞,控制增殖及凋亡亦是關鍵點〔8,9〕。本研究發(fā)現(xiàn),靶向SBF2 siRNA對SCC15細胞活性的抑制作用呈時間依賴性,也表明SBF2在SCC15細胞的增殖過程中發(fā)揮重要作用。與Long等〔4〕的研究一致,靶向干擾SBF2表達可抑制胰腺癌細胞PANC-1的增殖,提示該基因可能參與了惡性腫瘤細胞的增殖調(diào)控過程,推測可能原因為SBF2可影響與腫瘤增殖相關受體的活性及表達,如表皮生長因子受體等〔6〕。Long等〔4〕亦發(fā)現(xiàn)SBF2干擾后PANC-1細胞的凋亡率亦升高,提示該基因同樣也參與了對凋亡通路的調(diào)節(jié)過程,下一步將重點研究沉默該基因?qū)χ匾蛲鐾返挠绊憽ong等〔4〕指出SBF2干擾可通過抑制TGF-β通路的活性,本研究推測SBF2有可能通過作用TGF-β通路來發(fā)揮對SCC15細胞增殖及凋亡的影響。

    鑒于復發(fā)轉(zhuǎn)移至頸部淋巴結或遠處器官是口腔癌治療失敗的主要原因〔10,11〕,故抑制其復發(fā)轉(zhuǎn)移有重要臨床意義,因此本研究探索干擾SBF2表達對SCC15細胞侵襲的影響。本文結果提示靶向轉(zhuǎn)染SBF2可能成為預防口腔癌復發(fā)轉(zhuǎn)移的新靶點,更表明SBF2對癌細胞惡性轉(zhuǎn)換的影響是多個方面的。

    1 Siegel RL,Miller KD,Jemal A.Cancer statistics,2016〔J〕.CA Cancer J Clin,2016;66(1):7-30.

    2 翟 越,趙海豐.黃芩素對 SCC15口腔癌細胞增殖和 Caspase-3活性的影響〔J〕.中國老年學雜志,2015;35(1):139-41.

    3 Wu C,Kraft P,Stolzenberg-Solomon R,etal.Genome-wide association study of survival in patients with pancreatic adenocarcinoma〔J〕.Gut,2014;63(1):152-60.

    4 Long J,Liu Z,Wu X,etal.siRNA-mediated SBF2 silencing may inhibit pancreatic cancer cells via attenuation of the TGF-β signaling pathway〔J〕.Technol Cancer Res Treat,2016;15(2):308-13.

    5 Senderek J,Bergmann C,Weber S,etal.Mutation of the SBF2 gene,encoding a novel member of the myotubular in family,in Charcot-Marie-Tooth neuropathy type 4B2/11p15〔J〕.Hum Mol Genet,2003;12(3):349-56.

    6 Berger P,Tersar K,Ballmer-Hofer K,etal.The CMT4B disease-causing proteins MTMR2 and MTMR13/SBF2 regulate AKT signaling〔J〕.J Cell Mol Med,2011;15(2):307-15.

    7 Tersar K,Boentert M,Berger P,etal.Mtmr13/Sbf2-deficient mice:an animal model for CMT4B2〔J〕.Hum Mol Genet,2007;16(24):2991-3001.

    8 萬英明.重組人乳鐵蛋白對口腔癌Tca8113細胞周期及周期調(diào)控因子cyclinD1、p19和 p27基因表達的影響〔J〕.中國老年學雜志,2015;35(5):1323-4,1325.

    9 強 璐,柴楣才.PPAR-γ對口腔癌細胞轉(zhuǎn)移能力的影響及其機制〔J〕.山西醫(yī)科大學學報,2012;43(11):817-21.

    10 陳國棟,卿安蓉.近距離腔內(nèi)照射聯(lián)合外照射治療控制口腔癌術后復發(fā)的臨床效果評價〔J〕.醫(yī)學綜述,2015;21(6):1144-5,1150.

    11 李莎莎,周 旋,張瀏陽,等.口腔舌癌與口底癌患者預后的比較研究〔J〕.天津醫(yī)藥,2013;41(6):523-6.

    〔2015-10-19修回〕

    (編輯 徐 杰)

    張素欣(1974-),女,副主任醫(yī)師,博士,主要從事口腔癌的綜合治療研究。

    李天客(1983-),男,主治醫(yī)師,碩士,主要從事口腔癌的綜合治療研究。

    R73

    A

    1005-9202(2016)21-5260-03;

    10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.020

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