骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)卵巢早衰模型小鼠卵巢功能的影響

范 雪 王愛(ài)娟 張 云 李 楠 于 洋 艾 浩

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，遼寧 錦州 121001)

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骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)卵巢早衰模型小鼠卵巢功能的影響

范 雪 王愛(ài)娟 張 云1李 楠 于 洋2艾 浩

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，遼寧 錦州 121001)

目的 探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)卵巢早衰模型小鼠的影響。方法 取ICR小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用于細(xì)胞移植。健康ICR小鼠60只隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、治療組。對(duì)照組小鼠不進(jìn)行任何干預(yù)，模型組和治療組小鼠腹腔注射順鉑建立化療性損傷小鼠卵巢早衰動(dòng)物模型。治療組造模后一次性原位注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行治療。觀察大鼠一般情況、動(dòng)情周期，并測(cè)定血清中E2、FSH含量以及卵巢組織形態(tài)改變。結(jié)果 模型組小鼠動(dòng)情周期紊亂，經(jīng)過(guò)干細(xì)胞治療后的小鼠動(dòng)情周期基本恢復(fù)正常。與對(duì)照組比較，模型組E2下降，F(xiàn)SH水平升高(P<0.05)。經(jīng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療后E2上升，F(xiàn)SH水平下降，幾近恢復(fù)正常水平。模型組濾泡大部分受到破壞，濾泡數(shù)量明顯少于對(duì)照組(P<0.01)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療后濾泡及黃體數(shù)目均明顯增加(包括新形成的黃體)，與模型組比較差異顯著(P<0.01)。結(jié)論 順鉑可致卵泡顆粒細(xì)胞凋亡，造成卵巢功能過(guò)早衰退，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)調(diào)節(jié)血清中各激素含量，可降低順鉑對(duì)卵巢的損害，促進(jìn)卵泡發(fā)育，改善并增強(qiáng)卵巢功能。

卵巢早衰；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；順鉑

卵巢早衰(POF)是由多種病因?qū)е碌穆雅莨δ芩ソ?。POF治療棘手,近年國(guó)內(nèi)外取得了應(yīng)用干細(xì)胞恢復(fù)卵巢功能及生育力等方面的動(dòng)物試驗(yàn)成果，為POF患者卵巢功能及生育功能的恢復(fù)帶來(lái)了希望〔1〕。目前成體干細(xì)胞治療包括生殖干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)和胎兒間充質(zhì)干細(xì)胞的治療，因其取材方便且不涉及倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)而在實(shí)驗(yàn)中得到廣泛應(yīng)用〔2〕。有研究顯示，干細(xì)胞移植治療POF，可改變卵巢組織形態(tài)，使卵巢彈性和韌性得到一定程度上的恢復(fù)，而干細(xì)胞分泌的一些因子可改善卵泡數(shù)量和質(zhì)量以及減少卵巢內(nèi)凋亡細(xì)胞的作用，并借此有效改善了卵巢功能〔3,4〕。本研究擬為POF的臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及試劑 健康ICR小鼠62只，清潔級(jí)，雌性，體質(zhì)量28～30 g，由錦州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。注射用順鉑(CDDP，10 mg/支)，齊魯制藥公司生產(chǎn)。ELISA試劑盒均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs的分離、純化培養(yǎng)與鑒定 取2只ICR小鼠，脫臼法處死后無(wú)菌條件下取其股骨和脛骨，沖出骨髓，用含10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液將骨髓制成單細(xì)胞懸液，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，通過(guò)貼壁篩選法篩選出純度較高的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。原代培養(yǎng)5～7 d后，收集bMSCs，加入抗體，按照PE/FITC標(biāo)記，CD34/44/45/105的流式細(xì)胞鑒定，證明其為bMSCs〔4〕。取第3代bMSCs，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后重懸細(xì)胞，細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106/ml的細(xì)胞懸液，用于細(xì)胞移植注射。

1.2.2 POF模型小鼠的建立及分組 將60只ICR小鼠隨機(jī)均分為三組(n=20)，對(duì)照組不做任何處理，模型組和干細(xì)胞治療組小鼠腹腔注射順鉑6 mg/kg生理鹽水配比制備小鼠早衰模型〔5〕，每天同一時(shí)間注射1次，連續(xù)注射14 d。造模期間每天進(jìn)行陰道涂片，觀察動(dòng)情周期的變化，以確定造模成功。造模后模型組小鼠不進(jìn)行任何干預(yù)。干細(xì)胞治療組小鼠造模后用0.2%戊巴比妥鈉0.1 ml麻醉，背面朝上，鈍性分離筋膜，可見(jiàn)腎臟上方的白色脂肪墊，拖出脂肪墊找出兩側(cè)卵巢，將卵巢固定，每側(cè)緩慢注射BMSCs 20 μl，同時(shí)注意止血，關(guān)腹后給予青霉素10萬(wàn)U預(yù)防感染。細(xì)胞移植后1 w檢測(cè)損傷卵巢的修復(fù)情況。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 陰道涂片及血中激素測(cè)定 每天早、晚8：00各一次取小鼠陰道脫落細(xì)胞涂片，于光學(xué)顯微鏡下觀察其性周期，根據(jù)脫落細(xì)胞類(lèi)型按標(biāo)準(zhǔn)分析動(dòng)情周期，以動(dòng)情期或動(dòng)情間期占總觀察時(shí)間的百分比為其構(gòu)成比〔6〕。在造模2 w后取各組小鼠眶靜脈血，ELISA法測(cè)定血清卵泡激素(FSH)和雌二醇(E2)，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。

1.3.2 各組小鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察 頸椎脫位法處死小鼠，同時(shí)取卵巢待測(cè)。收集的卵巢經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟包埋，切片常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察卵巢組織及卵泡的形態(tài)，同時(shí)在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)黃體及各個(gè)時(shí)期濾泡數(shù)量，取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS15.5軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 陰道脫落細(xì)胞涂片 模型組小鼠動(dòng)情期〔(9.4±5.2)%〕顯著降低，動(dòng)情間期〔(42.5±17.2)%〕延長(zhǎng)，出現(xiàn)動(dòng)情周期紊亂；而治療組小鼠動(dòng)情周期〔(18.9±8.7)%〕和動(dòng)情間期〔(25.7±4.7)%〕與對(duì)照組〔(20.7±9.2)%、(24.0±3.5)%〕比較無(wú)顯著差異(P>0.05)；治療組與模型組比較，動(dòng)情周期紊亂顯著降低(P<0.05)。

2.2 各組FSH和E2含量比較 與對(duì)照組E2〔(185.25±30.30)pmol/L〕、FSH〔(0.95±0.50)pmol/L〕比較，模型組E2含量〔(127.35±22.98)pmol/L〕顯著下降，而FSH含量〔(1.91±0.63)pmol/L〕顯著增加(P<0.05)，治療組E2含量〔(170.32±29.27)pmol/L〕比模型組顯著升高(P<0.05)，而FSH水平〔(1.05±0.29)pmol/L〕顯著降低，接近正常水平。

2.3 各組小鼠卵巢組織炎形態(tài)學(xué)分析 對(duì)照組小鼠卵巢體積較大，卵泡生長(zhǎng)活躍，排列整齊，黃體細(xì)胞豐富，清晰可見(jiàn)。模型組卵泡數(shù)量明顯較少，排列紊亂，形態(tài)不一，黃體數(shù)目明顯減少。治療組可見(jiàn)卵泡數(shù)目和黃體數(shù)量均增多，形態(tài)和數(shù)目均好于模型組，層次清晰，僅次于對(duì)照組形態(tài)。見(jiàn)表1，圖1。

表1 各組小鼠卵巢濾泡及黃體計(jì)數(shù)比較(個(gè)，

圖1 各組小鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察(HE，×200)

3 討 論

POF由多種原因引起，但最常見(jiàn)的原因是自體免疫功能異常，病理改變是卵泡靜止、數(shù)量減少甚至消失，代之以結(jié)締組織增生。目前臨床上常以激素替代治療為主〔7〕，但治療效果具有一定局限性，且容易導(dǎo)致癌癥發(fā)生。

干細(xì)胞是人體一類(lèi)具有自我更新、多向分化潛能的細(xì)胞，不僅有組織細(xì)胞的再生修復(fù)作用，還有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)功能，給POF帶來(lái)了全新的細(xì)胞再生治療模式〔8〕。研究顯示，干細(xì)胞可以通過(guò)血液循環(huán)遷徙到患者卵巢，在早衰卵巢內(nèi)逐漸分化為卵巢細(xì)胞，并發(fā)揮卵巢功能，分泌雌激素。干細(xì)胞治療可有效遏制卵巢進(jìn)一步早衰，保護(hù)卵巢，重塑卵巢結(jié)構(gòu)〔9〕，恢復(fù)卵巢功能，有效改善患者癥狀，對(duì)因缺乏雌激素而引起的骨質(zhì)疏松也有很好的治療作用。

BMSCs來(lái)源廣、獲取容易、擴(kuò)展能力強(qiáng)、免疫原性低、能歸巢、無(wú)醫(yī)學(xué)倫理爭(zhēng)議等優(yōu)點(diǎn)，成為再生醫(yī)學(xué)、干細(xì)胞療法中主要選擇細(xì)胞之一。同種異體細(xì)胞移植實(shí)際上是一種最強(qiáng)烈的免疫治療，可降低受體的供體細(xì)胞排斥反應(yīng)和降低產(chǎn)品潛在的同種異體反應(yīng)〔10〕。本研究中模型組小鼠表現(xiàn)為性周期紊亂，性周期延長(zhǎng)至7～10 d，提示這些小鼠卵巢內(nèi)卵泡較正常卵泡發(fā)育緩慢。有的小鼠持續(xù)停留在動(dòng)情期，而不出現(xiàn)動(dòng)情后期的表現(xiàn)，這可能與小鼠POF而引起卵泡不能發(fā)育成熟或不能排卵、無(wú)黃體生成有一定相關(guān)性〔11〕。BMSCs治療組小鼠動(dòng)情周期基本回復(fù)正常，說(shuō)明BMSCs有較好療效。

本實(shí)驗(yàn)研究顯示，BMSCs移植至早衰小鼠卵巢后可能參與調(diào)整血液激素水平，使卵泡和黃體數(shù)量增加。另外，干細(xì)胞再生的卵巢細(xì)胞也可以對(duì)腦垂體分泌的相關(guān)激素作出及時(shí)、正確的反應(yīng)，使體內(nèi)激素水平處于平衡狀態(tài)。

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〔2015-11-12修回〕

(編輯 袁左鳴)

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81173443)；遼寧省科學(xué)計(jì)劃項(xiàng)目(No.2010042)

艾 浩(1974-)，男，博士，教授，主任醫(yī)師，主要從事卵巢早衰研究。

范 雪(1982-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事婦產(chǎn)科疾病的診斷與治療研究。

R71

A

1005-9202(2016)21-5222-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.003

1 北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)婦產(chǎn)科

2 錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院超聲科