全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測(cè)化學(xué)損傷致癇大鼠海馬腦片電生理特性

徐祖才 張 駿 黃 浩 王 靜 徐忠祥 彭 燕 陳 婭 徐 平

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州 遵義 563003)

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·基礎(chǔ)研究·

全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測(cè)化學(xué)損傷致癇大鼠海馬腦片電生理特性

徐祖才 張 駿 黃 浩 王 靜1徐忠祥 彭 燕 陳 婭 徐 平

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州 遵義 563003)

目的 應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測(cè)化學(xué)損傷致癇大鼠海馬腦片神經(jīng)元基本電生理特性。方法 將成年SD大鼠建立氯化鋰-匹羅卡品模型后，急性分離獲得海馬腦片，應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗電流鉗技術(shù)實(shí)時(shí)觀察化學(xué)損傷致癇大鼠海馬腦片CA1區(qū)錐體神經(jīng)元膜電位及其單位時(shí)間內(nèi)動(dòng)作電位頻率的變化情況；通過(guò)全細(xì)胞膜片鉗電壓鉗技術(shù)，檢測(cè)化學(xué)損傷后大鼠海馬腦片CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的誘發(fā)興奮性突觸后電流的變化情況。結(jié)果 急性分離所得海馬腦片CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的胞體飽滿并可見(jiàn)突起?？稍诖笫蠛ｑR腦片CA1區(qū)錐體神經(jīng)元記錄到自發(fā)的動(dòng)作電位及刺激誘發(fā)興奮性突觸后電流，且化學(xué)損傷后神經(jīng)元膜電位絕對(duì)值降低，動(dòng)作電位頻率加快，誘發(fā)的興奮性突觸后電流幅值升高。結(jié)論 全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)可以用于癲癇大鼠急性分離所得海馬腦片的電生理研究，化學(xué)損傷后神經(jīng)元興奮性明顯升高，為開(kāi)展癲癇相關(guān)的功能研究提供了新的途徑。

全細(xì)胞膜片鉗；癲癇；海馬腦片

癲癇的發(fā)作機(jī)制與神經(jīng)系統(tǒng)遞質(zhì)紊亂密切相關(guān)〔1〕。近年來(lái)，腦片作為研究對(duì)象在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用越發(fā)廣泛；目前可以通過(guò)急性分離及離體培養(yǎng)獲得腦片，雖離體培養(yǎng)腦片較為穩(wěn)定及存活時(shí)間佳，但急性分離腦片與動(dòng)物的生理特性更加接近;隨著電生理技術(shù)的不斷發(fā)展，膜片鉗結(jié)合腦片技術(shù)在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用更是方興未艾。雖然膜片鉗的使用過(guò)程中對(duì)腦片中細(xì)胞活性及功能要求高，但筆者的前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，成年大鼠急性分離海馬腦片可保存較好的生理學(xué)特性，且適于用與全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)的記錄〔2〕。在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，筆者擬通過(guò)全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，檢測(cè)氯化鋰-匹羅卡品致癇大鼠海馬腦片CA1區(qū)神經(jīng)元的基礎(chǔ)電生理特性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 雄性成年SD大鼠，體重200 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；Bicuculine、Nacl、Kcl、Cs-methanesulfonate、EGTA、HEPES、K2ATP、BAPTA、phosphocreatine、Na2ATP、Na3GTP及葡萄糖由美國(guó)sigma公司生產(chǎn)，其余配液所需常見(jiàn)分析純級(jí)無(wú)機(jī)鹽由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院兒研所提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)器材 玻璃微電極(外徑1.0 mm)由南京六合泉實(shí)驗(yàn)器材廠生產(chǎn)，P97 玻璃電極拉制儀由美國(guó)Shutter 公司生產(chǎn)，倒置相差顯微鏡及紅外微分干涉相差顯微鏡由日本Nikon公司生產(chǎn)，MF-79 玻璃電極拋光儀由日本Narishige公司生產(chǎn)，Multiclamp 700B放大器、Digidata 1200轉(zhuǎn)換器及數(shù)據(jù)分析軟件Clampfit 9.2(膜片鉗系統(tǒng))由美國(guó)Axon公司生產(chǎn)，蠕動(dòng)泵由美國(guó)WPI公司生產(chǎn)，恒溫腦片孵育槽由美國(guó)Warner公司生產(chǎn)，NVSLM1型振動(dòng)切片機(jī)由英國(guó)Campden 公司生產(chǎn)，95%O2+5%CO2混合氣及100% N2由重慶朝陽(yáng)氣體供應(yīng)公司供應(yīng)。

1.3 方法

1.3.1 建立氯化鋰-匹羅卡品化學(xué)損傷致癇大鼠模型及海馬腦片急性分離 隨機(jī)選取健康成年SD大鼠，以127 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)予以腹腔注射氯化鋰注射(LiCl)；成功注射后20 h左右，以1 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)給予腹腔注射阿托品注射液；注射成功后30 min，再以50 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)予以腹腔注射新鮮配置的匹羅卡品；匹羅卡品藥物注射后，對(duì)其行為學(xué)改變進(jìn)行密切監(jiān)視，對(duì)出現(xiàn)Racine評(píng)分〔3〕4～5級(jí)的，視為建模成功。 建模成功后24 h的大鼠用于海馬腦片急性分離。參照之前實(shí)驗(yàn)步驟〔2〕，先配好相應(yīng)的使用液體，其中切片液的主要成分如下：2.5 mmol/L KCl、6 mmol/L MgCl2·H2O、1 mmol/L CaCl2、1.25 mmol/L NaH2PO4、26 mmol/L NaHCO3、220 mmol/L蔗糖及10 mmol/L 葡萄糖；人工腦脊液(ACSF)主要成分：124 mmol/L NaCl、2 mmol/L CaCl2、2 mmol/L MgCl2、1.23 mmol/L NaH2PO4、3 mmol/L KCl、26 mmol/L NaHCO3及10 mmol/L 葡萄糖。冰鎮(zhèn)切片液備用(冰水混合物，少量冰)，提前半小時(shí)使用95% O2+5% CO2的混合氣將切片液及ACSF充氣胞和，模型鼠以1 ml/100 g的3.5% 水合氯醛腹腔注射麻醉備用。斷頭取腦后，將海馬組織置于切片機(jī)上，切成350 μm厚的海馬腦片備用。正常大鼠海馬腦片分離步驟相同。

1.3.2 動(dòng)作電位及自發(fā)的興奮性突觸后電流(eEPSC)的記錄 在全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)下，使用電流鉗模式記錄動(dòng)作電位情況。其中記錄動(dòng)作電位電極內(nèi)液的配方：60 mmol/L K2SO4、40 mmol/L HEPES、60 mmol/L NMG、12 mmol/L phosphocreatine、0.5 mmol/L BAPTA、4 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L Na3GTP及2 mmol/L Na2ATP。通過(guò)比較，分析化學(xué)損傷后海馬神經(jīng)元膜電位及其單位時(shí)間內(nèi)動(dòng)作電位頻率的變化情況。使用電壓鉗模式記錄eEPSC，其中記錄自發(fā)eEPSC電極內(nèi)液的配方：130 mmol/L Cs-methanesulfonate、10 mmol/L HEPES、10 mmol/L CsCl、4 mmol/L NaCl、1 mmol/L MgCl2、1 mmol/L EGTA、5 mmol/L NMG、5 mmol/L MgATP、0.5 mmol/L Na2GTP及12 mmol/L

phosphocreatine。使用正常的ACSF灌流記錄，待得到穩(wěn)定的數(shù)據(jù)后，進(jìn)行采集分析。正常組及模型組海馬腦片的記錄模式一致，分析化學(xué)損傷后海馬神經(jīng)元在40 mV、20 mV、0 mV、-20 mV、-40 mV及-60 mV不同鉗制電壓下，eEPSC的變化情況。

1.4 膜片鉗數(shù)據(jù)分析及制圖軟件 上述Clampfit 9.2可進(jìn)行大部分的數(shù)據(jù)分析及制圖，此外還應(yīng)用到origin 8.5進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的分析和圖片的處理。正常大鼠與癲癇大鼠膜電位及動(dòng)作電位頻率比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不同鉗制電位下兩組神經(jīng)元eEPSC的幅值比較采用重復(fù)方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 急性分離所得海馬腦片形態(tài)學(xué)觀察 急性分離所得癲癇大鼠海馬腦片，直接肉眼視光澤度可，在顯微鏡低倍下觀察，可發(fā)現(xiàn)海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元結(jié)構(gòu)清晰且呈線型；經(jīng)紅外處理后，在顯示器上可見(jiàn)海馬CA1區(qū)的錐體細(xì)胞外形飽滿，且各細(xì)胞的突起清晰可見(jiàn)，該區(qū)的錐體神經(jīng)元選擇進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄時(shí)，易于封接。見(jiàn)圖1。

圖1 急性分離腦片海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元

2.2 電流鉗模式下記錄動(dòng)作電位 正常組和模型組的記錄軌跡圖見(jiàn)圖2，分別對(duì)開(kāi)始記錄后5 min、20 min和35 min的軌跡圖進(jìn)行描記，發(fā)現(xiàn)在不同組別所記錄神經(jīng)元膜電位及每秒動(dòng)作電位次數(shù)已趨于穩(wěn)定，其中膜電位絕對(duì)值的比較，正常組(-63.83±0.70)較模型組(-51.67±0.67)降低(P<0.01)；每秒動(dòng)作電位次數(shù)相比，模型組(14.83±0.48)較正常組(1.67±0.33)明顯增多(P<0.01)。

圖2 動(dòng)作電位軌跡圖

2.3 電壓鉗模式下記錄誘發(fā)的eEPSC 在全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)的電壓鉗模式下，將電位分別鉗制在40 mV、20 mV、0 mV、-20 mV、-40 mV及-60 mV的前提下，刺激強(qiáng)度為40 μS、60 μA及0.1 Hz (刺激電極為雙極鎢絲制成，距離胞體約150 μm)。整個(gè)記錄過(guò)程使用ACSF+10 μmol/L Bicuculine灌流，即可記錄到穩(wěn)定的eEPSC，且在對(duì)應(yīng)的不同鉗制電位下，模型組的eEPSC的幅值較正常組明顯升高(P<0.01，P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 不同鉗制電位下正常組及模型組的eEPSC幅值

3 討 論

癲癇是最常見(jiàn)的且具有致殘性的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，且其發(fā)作也是不可預(yù)知的,在通常情況下癲癇患者需要長(zhǎng)期甚至是終身使用抗癲癇藥物治療；此外，盡管現(xiàn)行抗癲癇藥物治療方案推廣良好，但是，仍有相當(dāng)部分患者最后成為藥物難治性癲癇〔4,5〕。

隨著藥物難治性癲癇患者術(shù)前評(píng)估能力的不斷提升以及手術(shù)技術(shù)的日趨改良，國(guó)內(nèi)外相關(guān)患者接受手術(shù)治療也越來(lái)越多，因此，以癲癇患者的手術(shù)切除標(biāo)本為研究對(duì)象的實(shí)驗(yàn)研究也越來(lái)越多，發(fā)現(xiàn)腦組織中有異常表達(dá)的蛋白質(zhì)，也包括一些離子通道蛋白〔6～8〕。此外，也有學(xué)者在癲癇患者腦脊液中發(fā)現(xiàn)了一些異常表達(dá)的蛋白,甚至提出這些異常蛋白即為與癲癇或是難治性癲癇相關(guān)的生物標(biāo)記物〔9,10〕。

然而，任何異常表達(dá)的蛋白，與癲癇之間到底是因果關(guān)系還是伴隨現(xiàn)象，試圖通過(guò)人腦組織標(biāo)本及腦脊液的相關(guān)檢測(cè)不得而知，因此癲癇的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)被廣泛使用以證實(shí)相關(guān)蛋白的作用機(jī)制。其中，氯化鋰-匹羅卡品致癲癇大鼠模型，已被廣泛使用于癲癇的發(fā)病機(jī)制研究〔11,12〕。然而，因動(dòng)物在體膜片鉗的推廣程度首先以及全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)的廣泛運(yùn)用，使得尋找一種可以使用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)而又能與癲癇動(dòng)物模型相一致的腦片或細(xì)胞模型成為研究者們追逐的熱點(diǎn)。其中原代海馬神經(jīng)元癲癇樣放電模型被使用過(guò)，且也有一定的實(shí)驗(yàn)價(jià)值，然而，因其與動(dòng)物在體模型缺乏一致性，而使得實(shí)驗(yàn)的相關(guān)性和延續(xù)性受限〔13〕。

因此，離體腦片，特別是能與在體動(dòng)物保持一致性和延續(xù)性的成年大鼠腦片的使用，可以為癲癇相關(guān)蛋白功能的研究提供很好的研究對(duì)象〔2〕。本實(shí)驗(yàn)所提供的氯化鋰-匹羅卡品癲癇大鼠的海馬腦片制備過(guò)程可靠，所得腦片活性強(qiáng)，在全細(xì)胞膜片鉗的封接過(guò)程順利，且通過(guò)電流鉗記錄，發(fā)現(xiàn)化學(xué)損傷后海馬錐體神經(jīng)元的膜電位絕對(duì)值降低，從而興奮性增加，通過(guò)與正常大鼠的對(duì)比分析，也證實(shí)了化學(xué)損傷后，神經(jīng)元的動(dòng)作電位頻率明顯加快。然而，雖然化學(xué)損傷后神經(jīng)元興奮性增加，膜電位絕對(duì)值降低，然而，神經(jīng)元仍然可以被長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定記錄到動(dòng)作電位。不同鉗制電壓狀態(tài)下，檢測(cè)一定強(qiáng)度電流刺激所得的eEPSC，發(fā)現(xiàn)雖然損傷后神經(jīng)元在不同鉗制電壓下的eEPSC幅值均較正常大鼠升高，同樣提示興奮性增強(qiáng)，然而，仍然可以承受外源性電流的刺激，穩(wěn)定記錄到eEPSC。

1 Xu Z,Xu P,Chen Y,etal.ENT1 inhibition attenuates epileptic seizure severity via regulation of glutamatergic neurotransmission〔J〕.Neuromolecul Med,2015;17(1):1-11.

2 徐祖才，陳恒勝，劉 靚，等.膜片鉗技術(shù)在成年大鼠海馬腦片應(yīng)用的初步研究〔J〕.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012;37(9)：799-801.

3 Wang L,Lv Y,Deng W,etal.5-HT6 Receptor recruitment of mTOR modulates seizure activity in epilepsy〔J〕.Mol Neurobiol,2015;51(3):1292-9.

4 Xu Y,Zeng K,Han Y,etal.Altered expression of CX3CL1 in patients with epilepsy and in a rat model〔J〕.Am J Pathol，2012；180(5):1950-62.

5 French JA.Can evidence-based guidelines and clinical trials tell us how to treat patients〔J〕? Epilepsia,2007;48(7):1264-7.

6 Zhu B,Zha J,Long Y,etal.Increased expression of copine Ⅳ in patients with refractory epilepsy and a rat model〔J〕.J Neurol Sci,2016;360:30-6.

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8 Xi Z,Deng W,Wang L,etal.Association of alpha-soluble NSF attachment protein with epileptic seizure〔J〕.J Mol Neurosci,2015;57(3):417-25.

9 Xi ZQ,Wang X,Luo J,etal.Fibronectin is a potential cerebrospinal fluid and serum epilepsy biomarker〔J〕.Epilepsy Behav,2015;48:66-9.

10 Rong H,Jin L,Wei W,etal.Alpha-synuclein is a potential biomarker in the serum and CSF of patients with intractable epilepsy〔J〕.Seizure,2015;27:6-9.

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〔2016-08-16修回〕

(編輯 曲 莉)

Electrophysiological properties in the chemical injury epileptic rat hippocampal brain slices examined by whole-cell patch clamp technique

XU Zu-Cai,ZHANG Jun,HUANG Hao,et al.

Department of Neurology,Affiliated Hospital of Zunyi Medical College,Zunyi 563003,Guizhou,China

Objective To observe the electrophysiological properties in the epileptic rat hippocampal brain slices by whole-cell patch clamp technique.Methods After epileptic rat model was successfully established,the hippocampal brain slices were acutely dissociated，whose basic electrophysiological properties were detected by whole-cell patch clamp technique.After chemical injury,the changing of membrane potential and action potential were recorded by the current clamp technique，and the changing of evoked excitatory postsynaptic current(eEPSC)was recorded by the potential clamp technique.Results On acutely dissociated hippocampal brain slices of epileptic rats,good physical shape and obvious neurite of pyramidal neurons in CA1 region could be observed.Spontaneous action potential and evoked excitatory postsynaptic current could be detected on pyramidal neurons in CA1 region by whole-cell patch clamp technique.After chemical injury,the neuronal membrane potential absolute value became lower and action potential frequency became faster.In addition,the eEPSC amplitude became higher.Conclusions The physiological activities of pyramidal neurons in CA1 region are high enough for sealing.In addition,the whole-cell patch clamp technique is suitable for detecting the electrophysiological properties.It is found that neuronal excitability increased significantly after chemical injury,which could provide a new pathway for the functional research of epilepsy.

Whole-cell patch clamp;Epilepsy;Hippocampal brain slice

國(guó)家自然科學(xué)基金(81260201，81560224)；貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目〔黔科合J字(2013)2327號(hào)〕；遵義市優(yōu)秀青年科技人才培養(yǎng)項(xiàng)目〔遵科合人(2014)10號(hào)〕；貴州省高校優(yōu)秀科技創(chuàng)新人才支持計(jì)劃〔黔教合KY字(2014)247〕；貴州省科技合作計(jì)劃項(xiàng)目〔黔科合LH字(2015)7520號(hào)〕；貴州省衛(wèi)計(jì)委科技基金(gzwjkj 2015-1-052)

徐 平(1963-)，男，博士，主任醫(yī)師，主要從事癲癇及認(rèn)知功能障礙研究。

徐祖才(1981-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事癲癇的基礎(chǔ)與臨床研究。

R742.1

A

1005-9202(2016)21-5217-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.001