一測(cè)多評(píng)法測(cè)定敗醬草中3種三萜類成分

涂正偉，李東華，關(guān)鑫，鹿燕敏，高穎華

一測(cè)多評(píng)法測(cè)定敗醬草中3種三萜類成分

涂正偉1，李東華1，關(guān)鑫1，鹿燕敏1，高穎華2

目的：建立HPLC同時(shí)測(cè)定敗醬草中齊墩果酸、熊果酸和常春藤皂苷元3種三萜類成分的“一測(cè)多評(píng)”法。方法：以齊墩果酸為內(nèi)參物，采用HPLC測(cè)定含量，建立其與熊果酸和常春藤皂苷元的相對(duì)校正因子（RCF），以相對(duì)保留時(shí)間（RRT）進(jìn)行色譜峰定位，計(jì)算熊果酸和常春藤皂苷元的量；用外標(biāo)法測(cè)定6批次敗醬草中熊果酸和常春藤皂苷元的量，比較計(jì)算值與實(shí)測(cè)值的差異，驗(yàn)證一測(cè)多評(píng)的可行性和重現(xiàn)性。結(jié)果：測(cè)得熊果酸和常春藤皂苷元的平均相對(duì)校正因子為0.860（RSD 1.24％）、0.934（RSD 0.79％）；在不同HPLC和色譜柱下，熊果酸和常春藤皂苷元RCF的RSD分別為0.85％、0.72％，RRT的RSD分別為0.71％、1.07％；熊果酸和常春藤皂苷元的計(jì)算值和實(shí)測(cè)值之間的夾角余弦值分別為0.999 97和0.999 89，兩種方法所測(cè)得的兩種成分的含量相對(duì)偏差都在±5％以內(nèi)。結(jié)論：一測(cè)多評(píng)法用于敗醬草的三萜類多成分含量測(cè)定準(zhǔn)確可行，重現(xiàn)性好。

一測(cè)多評(píng)法；高效液相色譜；敗醬草；三萜類成分

敗醬草為敗醬科敗醬屬植物黃花敗醬Patrinia scabiosaefolia Fisch.ex Trev.和白花敗醬Patrinia Vil?losa(Thunb.)Juss.的全草。具有清熱解毒、破瘀排膿的功效，主治腸癰、肺癰、熱毒癰腫、痢疾和產(chǎn)后瘀滯腹痛[1-2]。吳咸中院士將其與大黃、黃芩、白頭翁組成清熱解毒方長(zhǎng)期用于臨床治療化膿性闌尾炎、闌尾膿腫以及其他多種原因引起的腹腔感染甚或出現(xiàn)MODS者，取得了很好的治療效果。本課題組研究發(fā)現(xiàn)清熱解毒方可以改善膿毒癥大鼠的肝、腎及血小板功能，其中敗醬草在提高存活率及降低血小板活化方面發(fā)揮重要的作用[3]。敗醬草主要含三萜類成分，其中主要活性成分是以齊墩果酸、熊果酸和常春藤皂苷元為苷元的皂苷。有研究采用HPLC技術(shù)以外標(biāo)法同時(shí)測(cè)定了敗醬草中齊墩果酸、熊果酸和常春藤皂苷元3種三萜類成分含量[4]，但考慮到日常檢測(cè)中使用三種對(duì)照品的高成本，本文試圖建立以1種對(duì)照品來快速準(zhǔn)確測(cè)定敗醬草中3種三萜類成分的“一測(cè)多評(píng)法（quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS）”。即在多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)時(shí)，以藥材中某一典型組分（有對(duì)照品供應(yīng)者）為內(nèi)標(biāo)，建立該組分與其他組分之間的相對(duì)校正因子（relative correction factor，RCF），通過校正因子計(jì)算其他組分的含量的方法[5]。

1 材料與方法

1.1 材料高效液相色譜儀（Aglient1100，美國(guó)安捷倫公司），高效液相色譜儀（Dionex Ultimate3000，美國(guó)戴安公司），分析天平（BP211D，德國(guó)賽多利斯公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-52AA，上海雅榮生化儀器設(shè)備有限公司），恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器（KQ-700GDV，昆山市超聲儀器有限公司）。常春藤皂苷元對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)111733-201205），齊墩果酸對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110709-200505），熊果酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110742-200517)。分別自河北安國(guó)和安徽亳州各采購3批次敗醬草樣品，經(jīng)南開醫(yī)院草藥房趙玉均老師鑒定，其中安國(guó)購買的第1批次和亳州購買的第3批次為白花敗醬，其余均為黃花敗醬。甲醇（天津市康科德科技有限公司）為色譜純?cè)噭?，水為超純水，其他試劑均為分析純?/p>

1.2 方法

1.2.1 色譜條件色譜柱為Phenomenex Synergi 4μ Hydro-RP（250×4.6 mm，80A）、Dionex Acclaim120 C18（5μm，250×2.1 mm）、Kromasil C18（5μm，250× 4.6mm），后兩者僅2.3項(xiàng)下使用；以甲醇-0.5％醋酸銨（87∶13）為流動(dòng)相，流速為1 mL/min，DAD檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，柱溫為30℃。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備取齊墩果酸、熊果酸和常春藤皂苷元對(duì)照品適量，精密稱定，用甲醇溶解，制成每毫升含265.0μg齊墩果酸、250.0μg熊果酸、122.5μg常春藤皂苷元的混合對(duì)照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備將敗醬草藥材粉碎過20目篩，取2 g藥材粉末，精密稱定，精密量取50mL甲醇，超聲30min，過濾，棄去開始少量濾液，精密量取續(xù)濾液25 mL置于茄形燒瓶中，減壓蒸干。向蒸干的殘?jiān)屑?5 mL甲醇、1 mL濃鹽酸，80℃下回流反應(yīng)4 h，反應(yīng)完將反應(yīng)液減壓蒸干。加5 mL水懸浮，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，用氯仿萃取3次，每次15mL，合并氯仿層，減壓蒸干。將蒸干的樣品用少量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶定容，混勻，吸取1mL樣品溶液于12 000 r/min離心10min，取上清液即得供試品溶液。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密吸取上述混合對(duì)照品溶液2、4、8、12、16、20μL注入液相色譜儀，按1.2.1項(xiàng)下HPLC條件測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量X為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸計(jì)算得回歸方程和線性范圍。

2 結(jié)果

2.1 HPLC方法考察

2.1.1 系統(tǒng)適用性在本實(shí)驗(yàn)條件下，齊墩果酸、熊果酸和常春藤皂苷元的峰形良好，相互之間及與供試品溶液中其他物質(zhì)分離度良好，具有較好的專屬性，保留時(shí)間分別約為17.3 min、18.3 min和7.4 min，見圖1。

圖1 敗醬草樣品（A）和對(duì)照品（B）的HPLC圖譜

2.1.2 線性關(guān)系按1.2.4項(xiàng)下方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸計(jì)算得齊墩果酸、熊果酸和常春藤皂苷元的回歸方程分別為：Y=461.2X-5.873（r=0.999 5）、Y=396.2X-4.538（r=0.999 5）和Y=432.0X-3.307（r= 0.999 5），齊墩果酸、熊果酸和常春藤皂苷元分別在0.53～5.30μg、0.50～5.00μg和0.245～2.45μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 精密度試驗(yàn)精密吸取1.2.2所制混合對(duì)照品溶液20μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，齊墩果酸、熊果酸和常春藤皂苷元峰面積的RSD值分別為0.37％、0.73％和0.86％。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液分別于0、2、6、12、18、24 h進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算齊墩果酸、熊果酸和常春藤皂苷元峰面積的RSD值分別為0.89％、2.04％和1.27％，表明供試品溶液室溫放置24 h穩(wěn)定。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn)取2 g敗醬草藥材粉末，共6份，精密稱定，按1.2.3項(xiàng)下方法制備樣品，測(cè)定齊墩果酸、熊果酸和常春藤皂苷元的平均含量為2.056、1.982和0.240 mg/g藥材，RSD值分別為3.94％、3.97％和2.43％。

2.1.6 加樣回收率取已知含量的敗醬草藥材粉末6份，每份2 g，精密稱定，分別精密加入齊墩果酸、熊果酸和常春藤皂苷元對(duì)照品適量，按1.2.3項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按1.2.1項(xiàng)下HPLC條件測(cè)定。齊墩果酸、熊果酸和常春藤皂苷元的平均回收率為97.32％、98.04％和97.56％，RSD值分別為3.12％、2.56％和2.21％。

2.2 相對(duì)校正因子測(cè)定依據(jù)被測(cè)物質(zhì)的進(jìn)樣質(zhì)量(m)與其色譜峰面積(A)成正比關(guān)系，即m=f·A。以齊墩果酸（OA）為內(nèi)標(biāo)，熊果酸（UA）和常春藤皂苷元（H）的RCF分別為[6]：，結(jié)果見表1。

表1 熊果酸和常春藤皂苷元的相對(duì)校正因子考察

2.3 相對(duì)校正因子重現(xiàn)性考察按1.2.4項(xiàng)下條件，考察不同色譜柱及高效液相色譜儀對(duì)相對(duì)校正因子和待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的相對(duì)保留時(shí)間(relative retention time，RRT）的影響，按2.2項(xiàng)下公式計(jì)算，結(jié)果見表2。

表2 不同HPLC和色譜柱下熊果酸和常春藤皂苷元的RCF和RRT重現(xiàn)性考察

2.4 樣品測(cè)定取自河北安國(guó)和安徽亳州購買的6批次敗醬草樣品，按照1.2.3項(xiàng)下供試品溶液處理方法制備供試品溶液，分別精密吸取供試品、混合標(biāo)準(zhǔn)品20μL按1.2.1項(xiàng)下HPLC方法進(jìn)樣分析。分別采用外標(biāo)法和QAMS法計(jì)算6批次敗醬草樣品中熊果酸和常春藤皂苷元的含量，結(jié)果見表3。

2.5 一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法結(jié)果的比較研究將外標(biāo)法實(shí)測(cè)含量與QAMS計(jì)算的含量采用夾角余弦值進(jìn)行比較。夾角余弦值計(jì)算公式

結(jié)果顯示，兩種方法測(cè)得的熊果酸和常春藤皂苷元的計(jì)算值和實(shí)測(cè)值之間的夾角余弦值分別為0.999 97和0.999 89，兩種方法測(cè)得含量沒有顯著性差異，且兩種方法所得的含量相對(duì)偏差都在±5％以內(nèi)。

3 討論

敗醬草主要含三萜皂苷類成分，其中主要活性成分是以齊墩果酸、熊果酸和常春藤皂苷元為苷元的皂苷，這些皂苷在經(jīng)歷胃腸道時(shí)會(huì)部分水解成苷元齊墩果酸和常春藤皂苷元[7-9]。熊果酸對(duì)二甲苯引起的小鼠耳腫脹有很強(qiáng)的抗炎作用，齊墩果酸和熊果酸對(duì)四氯化碳引起的肝損傷有明顯的保護(hù)作用。肝臟是多種病原體及其毒素的重要清除場(chǎng)所，因此敗醬草三萜類成分對(duì)肝臟的保護(hù)作用降低了機(jī)體對(duì)感染及內(nèi)毒素的敏感性，抑制了膿毒癥的炎癥反應(yīng)[10-11]。因此本研究主要以測(cè)定三種三萜皂苷元來評(píng)價(jià)敗醬草的質(zhì)量。

在敗醬草藥材中，三萜類成分以苷和苷元兩種形式存在，本研究在制備供試品溶液時(shí)通過水解步驟使三萜皂苷水解為苷元，因此測(cè)得的齊墩果酸、熊果酸和常春藤皂苷元含量包含了游離苷元和苷兩種形式的量，能準(zhǔn)確地反映三種三萜類成分的量。供試品溶液制備方法借鑒了2005版《中國(guó)藥典》木通的方法，但經(jīng)過考察考慮到正丁醇富集作用有限且難以除去，去除了正丁醇萃取的過程。另外對(duì)水解過程通過正交試驗(yàn)進(jìn)行了重新考察確定了本研究的水解方法。

質(zhì)量評(píng)價(jià)對(duì)中藥生產(chǎn)過程極為重要，而一般說來單一成分往往無法準(zhǔn)確反映藥材的質(zhì)量，但多成分評(píng)價(jià)則由于中藥標(biāo)準(zhǔn)品價(jià)格昂貴大大增加了檢測(cè)成本，而一測(cè)多評(píng)法恰好可以有助于解決這個(gè)問題?！耙粶y(cè)多評(píng)法”是由王智民教授于2006年首次提出，該方法適用于對(duì)照品難得或制備成本高或不穩(wěn)定的情況下同類多成分同時(shí)測(cè)定，降低中藥多成分質(zhì)量評(píng)價(jià)成本[12]。該法提出后，多個(gè)課題組將“一測(cè)多評(píng)法”運(yùn)用到多種中藥材和中成藥制劑的多成分質(zhì)量評(píng)價(jià)中去[13-15]，如采用一測(cè)多評(píng)法測(cè)定枇杷葉有效部位中6種三萜酸成分的量和一清膠囊中的5種大黃蒽醌類成分等。本研究選擇齊墩果酸這個(gè)很常見且價(jià)格較為低廉的標(biāo)準(zhǔn)品作為內(nèi)參，通過HPLC確立了和熊果酸和常春藤皂苷元的相對(duì)校正因子，準(zhǔn)確可行、重現(xiàn)性較好。通過一測(cè)多評(píng)法測(cè)算的熊果酸和常春藤皂苷元含量與外標(biāo)法測(cè)定的含量沒有顯著性差異，相對(duì)偏差均在±5％以內(nèi)，說明QAMS法可以用于敗醬草的三萜類多成分的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

表3 6批次敗醬草藥材中3種三萜類成分的含量(外標(biāo)法和QAMS法)

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（收稿：2016-01-26修回：2016-05-20）

（責(zé)任編輯 劉洪斌）

Determ ination of Three Triterpenoids Com ponents Content in Herba Patriniae w ith QAMS

TU Zheng-wei,LIDong-hua,GUAN Xin,et al.Tianjin Institute of Integrative Medicine for Acute Abdominal Dis?eases,Tianjin Nankai Hospital,Tianjin(300100),China

Objective To establish a quantitative analysis method ofmulti-components by single-marker (QAMS)for determinating oleanolic acid，ursolic acid and hederagenin simultaneously in Herba Patriniae by HPLC.M ethods The content of internal reference substance Oleanolic acid was determined by HPLC,and the relative correlation factors(RCF)of oleanolic acid and ursolic acid,oleanolic acid and hederagenin were es?tablished.The chromatographic peaks of ursolic acid and hederagenin were located by the relative retention time (RRT).The contents of the two determinands were calculated according to the respective RCF and the injection content of oleanolic acid.The contents of ursolic acid and hederagenin in 6 batches Herba Patriniae were deter?mined in the external standard method and were contrasted with the calculated value to verify the feasibility and repeatability of the QAMSmethod.Results The RCF of ursolic acid and hederagenin with reference to Olea?nolic acid were 0.860（RSD 1.24％）and 0.934（RSD 0.79％）respectively.In different HPLC and column,the RSD of the RCF were 0.85％and 0.72％respectively,and the RSD of the RRT were 0.71％and 1.07％respec?tively.The included angle cosine value between the calculated and themeasured value of ursolic acid and heder?agenin were 0.999 97and 0.999 89 respectively,and the relative deviation of the contents in two methods all were less than±5％.Conclusion The QAMS is a kind of accurate and feasiblemethod to determine the con?tents of themulti-components simultaneously in Herba Patriniae．

Quantitative analysismethod ofmulti-components by single-marker；HPLC；herba Patriniae；triterperioids

R285.5

A

1007-6948(2016)05-0479-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2016.05.017

天津市衛(wèi)生局基金資助項(xiàng)目（11020）

1.天津市中西醫(yī)結(jié)合急腹癥研究所（天津300100）

2.天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所（天津300700）

涂正偉，E-mail:tuzhengwei132912@163.com