二至天癸顆粒對初老小鼠胚胎線粒體膜電位及發(fā)育潛能的影響

郭穎,連方

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南250014；2山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)

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二至天癸顆粒對初老小鼠胚胎線粒體膜電位及發(fā)育潛能的影響

郭穎1，2,連方2

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南250014；2山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)

目的 觀察補腎中藥二至天癸顆粒對初老小鼠胚胎線粒體膜電位(ΔΨm)及早期胚胎發(fā)育潛能的影響。方法 將80只初老(12月齡)小鼠隨機分為治療組和對照組各40只，分別給予二至天癸顆粒、安慰劑灌胃，連續(xù)給藥10 d；兩組小鼠進(jìn)行超促排卵，收集卵細(xì)胞進(jìn)行體外受精；觀察受精及胚胎發(fā)育情況，計算受精率及正常卵裂率；取二細(xì)胞、四細(xì)胞、八細(xì)胞胚胎以及桑堪胚和囊胚，采用JC-1染色法檢測各期胚胎ΔΨm。結(jié)果 治療組小鼠受精率為52.9%(656/1 240)、正常卵裂率為83.2%(546/656)，對照組分別為37.0%(414/1 120)、65.2%(270/414)；兩組受精率、正常卵裂率比較，P均<0.05。在二細(xì)胞、四細(xì)胞、八細(xì)胞、桑椹胚及囊胚期，治療組ΔΨm均高于相同細(xì)胞時期的對照組，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。結(jié)論 補腎中藥二至天癸顆?？赡芡ㄟ^改善初老小鼠胚胎ΔΨm，進(jìn)而提高受精率、卵裂率，從而改善卵母細(xì)胞質(zhì)量及早期胚胎的發(fā)育潛能。

補腎法；二至天癸顆粒；中藥；線粒體膜電位；卵母細(xì)胞；早期胚胎；初老小鼠

隨著國家出臺全面二孩政策，高齡婦女的生育問題成為目前生殖醫(yī)學(xué)界的熱點問題。然而，生育能力隨著年齡的增長逐漸下降，尤其是35歲以上的婦女，卵細(xì)胞質(zhì)量降低是生育能力顯著下降的重要原因[1，2]。線粒體作為與早期胚胎發(fā)育潛能密切相關(guān)的供能結(jié)構(gòu)，其性狀直接影響胚胎質(zhì)量及體外受精的結(jié)局。隨著對線粒體結(jié)構(gòu)的深入研究，可在細(xì)胞器水平對卵母細(xì)胞及胚胎發(fā)育潛能進(jìn)行評估[3]。在中醫(yī)學(xué)“腎主生殖”理論指導(dǎo)下，中醫(yī)藥在輔助生殖技術(shù)領(lǐng)域中的應(yīng)用越來越受到學(xué)者的關(guān)注。2015年9月～2016年3月，我們以線粒體膜電位(ΔΨm)為切入點，觀察補腎中藥二至天癸顆粒對初老小鼠胚胎ΔΨm的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 12月齡(初老)健康昆明雌鼠80只，3月齡(壯年)健康昆明雄鼠40只，體質(zhì)量(35±5)g，由山東大學(xué)動物中心提供，實驗動物合格證：SCXK(魯)20030004；實驗動物均在(25±2)℃ 室溫、明暗交替各12 h 的條件下飼養(yǎng)。二至天癸顆粒購買于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,主要成分為女貞子、旱蓮草、枸杞子、菟絲子、當(dāng)歸、白芍、川芎、熟地黃、制香附、炙甘草等；安慰劑，由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室提供，主要由糊精組成。人絕經(jīng)期尿促性腺激素(HMG，批號：160501)、人絨毛膜促性腺激素(HCG，批號：160503)，均由麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠生產(chǎn)。受精輸卵管培養(yǎng)液、卵裂輸卵管培養(yǎng)液、緩沖輸卵管培養(yǎng)液及組織培養(yǎng)油、人血清白蛋白、即用型透明質(zhì)酸酶，均購自美國SAGE公司。ΔΨm檢測試劑盒(JC-1)，購自武漢碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與干預(yù)處理 將80只雌性小鼠隨機分為治療組和對照組各40只，分籠飼養(yǎng)。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，每日下午定時連續(xù)灌胃給藥10 d；治療組用二至天癸顆粒，對照組用安慰劑。運用人與動物的體表面積計算法進(jìn)行計算[4]，每日喂藥量為0.1 g/d。

1.2.2 卵母細(xì)胞收集 第11天兩組腹腔內(nèi)注射HMG 10 IU/只。48 h后腹腔內(nèi)注射HCG 1O IU/只；于注射HCG后14 h剖腹取出小鼠卵巢及輸卵管，收集并處理卵丘復(fù)合物，評估卵母細(xì)胞質(zhì)量。將處理好的卵母細(xì)胞移入緩沖輸卵管培養(yǎng)液中，反復(fù)洗滌6次后置于受精輸卵管培養(yǎng)液，放入37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中備用。

1.2.3 精子獲取 取3月齡健康昆明雄鼠40只，剖腹取其附睪及輸精管；于緩沖輸卵管培養(yǎng)液中用TB針?biāo)核?，精子游出；放?7 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)1 h獲能備用。

1.2.4 體外受精和培養(yǎng) 用上游洗滌法洗滌精液，以5×106/mL活精子加入成熟卵母細(xì)胞培養(yǎng)皿中進(jìn)行受精，4～6 h觀察受精情況，計算受精率(受精卵細(xì)胞數(shù)/卵細(xì)胞總數(shù)×100%)；在卵裂輸卵管培養(yǎng)液中將受精卵繼續(xù)培養(yǎng)96～120 h，觀察胚胎發(fā)育情況，計算正常卵裂率(正常卵裂球數(shù)/受精卵總數(shù)×100%)。

1.2.5 各期胚胎ΔΨm檢測 采用JC-1染色法。取二細(xì)胞、四細(xì)胞、八細(xì)胞胚胎以及桑堪胚和囊胚，于胚胎的卵裂輸卵管培養(yǎng)液中培養(yǎng)。37 ℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱30 min，JC-1染色工作液按照1∶1比例加入培養(yǎng)液中染色25 min。緩沖輸卵管培養(yǎng)液反復(fù)沖洗胚胎數(shù)次，熒光顯微鏡下于綠色和紅色熒光模塊下觀察。用LUCIAG軟件獲得圖像，并分別測量同一胚胎的綠色及紅色熒光強度值，兩者比值即為ΔΨm。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料比較采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。P﹤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠受精率、正常卵裂率比較 治療組小鼠受精率為52.9%(656/1 240)、正常卵裂率為83.2%(546/656)，對照組分別為37.0%(414/1 120)、65.2%(270/414)；兩組受精率、正常卵裂率比較，P均<0.05。

2.2 兩組小鼠各階段胚胎ΔΨm比較 在二細(xì)胞、四細(xì)胞、八細(xì)胞、桑椹胚及囊胚期，治療組ΔΨm均高于相同細(xì)胞時期的對照組，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見表1。

表1 兩組小鼠各階段胚胎ΔΨm比較

注：與對照組同細(xì)胞時期比較，*P<0.05。

3 討論

隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，在堅持胚胎宏觀形態(tài)學(xué)分析的基礎(chǔ)上，胚胎的微觀形態(tài)學(xué)研究受到越來越多的重視，為臨床優(yōu)質(zhì)胚胎的選擇提供了更準(zhǔn)確的依據(jù)。因此，關(guān)于胚胎各種胞質(zhì)因子、線粒體、紡錘體等的研究越來越多。線粒體有著重要的基礎(chǔ)和臨床研究意義，可以提供能量并具有遺傳功能。有研究證實，隨著年齡的增加，卵細(xì)胞線粒體抵抗損傷能力逐漸下降；在相同的外部刺激發(fā)生時，更容易產(chǎn)生功能缺失[5]。高齡婦女的抗氧化能力下降，腺苷三磷酸(ATP)提供的能量減少，阻礙了發(fā)生于卵母細(xì)胞減數(shù)分裂時染色體的正常分離，導(dǎo)致非整倍體胚胎的形成，這正是復(fù)發(fā)性流產(chǎn)和胚胎反復(fù)種植失敗的因素之一[6～8]。

在卵細(xì)胞和胚胎發(fā)育的初期，線粒體多不成熟；發(fā)育到桑葚胚時，從形態(tài)學(xué)上分析一定比例的不成熟線粒體向成熟線粒體轉(zhuǎn)化；直至囊胚期，胞內(nèi)線粒體基本上全部轉(zhuǎn)化為成熟線粒體[9]。在人第2次減數(shù)分裂中期的卵母細(xì)胞中，經(jīng)由電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)10萬～30萬個線粒體，線粒體DNA(mtDNA)經(jīng)由PCR檢測為2萬～80萬個。mtDNA是評估卵細(xì)胞受精能力的重要指標(biāo)之一，其數(shù)量減少將導(dǎo)致卵母細(xì)胞受精能力下降[10]。有研究已經(jīng)在受精失敗的卵細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，mtDNA只有2萬～6萬個[11]。因此，可以推測正是由于低含量的mtDNA使卵母細(xì)胞正常的成熟受到影響，從而使這些卵母細(xì)胞發(fā)生受精障礙或影響胚胎的發(fā)育潛能[12～14]。卵母細(xì)胞與精子結(jié)合形成受精卵，繼續(xù)分裂形成胚胎，在這個過程中細(xì)胞數(shù)目是不斷增加的。但是，這期間線粒體數(shù)目是不隨著細(xì)胞數(shù)目增加而增多的，只能以提高自身功能、釋放大量ATP的方式來滿足細(xì)胞的能量需求。Van Blerkom等[15]發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增長，成熟卵母細(xì)胞的ΔΨm降低，卵母細(xì)胞的質(zhì)量和胚胎發(fā)育潛能也隨之降低。

本研究結(jié)果顯示，在不同的胚胎階段，治療組鼠胚的ΔΨm與對照組相比活性更高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。研究表明，線粒體功能正常與否直接關(guān)系到卵母細(xì)胞質(zhì)量及胚胎的發(fā)育潛能。當(dāng)線粒體的功能減弱時，產(chǎn)生的ATP量不足以支撐卵母細(xì)胞的受精、受精卵的分裂和胚胎的繼續(xù)發(fā)育。當(dāng)線粒體的功能過于增強時，ATP的產(chǎn)量過剩，細(xì)胞中出現(xiàn)大量的有害物質(zhì)從而使氧化磷酸化過程受阻，進(jìn)而影響胚胎的發(fā)育潛能。與對照組相比，治療組各階段發(fā)育的鼠胚其ΔΨm均有提高，而ΔΨm與ATP呈正相關(guān)。因此，我們的研究顯示，二至天癸顆?？筛纳坡涯讣?xì)胞質(zhì)量和胚胎發(fā)育，該作用可能是通過提高ΔΨm和ATP含量來實現(xiàn)的。

本研究以ΔΨm為切入點，將祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)與現(xiàn)代輔助生殖技術(shù)相結(jié)合，探討二至天癸顆粒影響初老小鼠卵母細(xì)胞質(zhì)量及早期胚胎發(fā)育潛能的機制。隨著年齡的增加，女性腎氣漸衰，卵巢功能減弱，生殖能力低下，這與《內(nèi)經(jīng)》的七七理論是一致的。在臨床治療中，女性生殖功能下降以補腎為主。本實驗結(jié)果顯示，補腎中藥二至天癸顆?？商岣擀う穖來改善卵母細(xì)胞質(zhì)量和胚胎發(fā)育潛能，為臨床補腎中藥提高卵細(xì)胞質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)，從分子水平豐富了腎主生殖理論的科學(xué)內(nèi)涵。但本研究也有一定的局限性，樣本量較少，只是從實驗研究的角度進(jìn)行了探討，下一步我們將進(jìn)行大樣本、多中心的隨機雙盲臨床研究，使傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)與現(xiàn)代技術(shù)相結(jié)合，為生殖醫(yī)學(xué)的發(fā)展提供新思路。

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·臨床研究·

國家自然科學(xué)基金資助項目(81273790，81473720)；山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃項目(2015WSB23005)。

連方(E-mail: f_lian@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.42.013

R2-031

A

1002-266X(2016)42-0043-03

2016-08-12)