小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性觀察

陳沖，馮文利，王榮，楊斐斐，王麗娜，鄭國光

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院血液學(xué)研究所血液病醫(yī)院，天津300020)

?

小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性觀察

陳沖，馮文利，王榮，楊斐斐，王麗娜，鄭國光

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院血液學(xué)研究所血液病醫(yī)院，天津300020)

目的 觀察小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性。方法 采用流式細(xì)胞術(shù)分選獲得小鼠小腹腔巨噬細(xì)胞(SPM)和大腹腔巨噬細(xì)胞(LPM)，采用流式細(xì)胞儀計數(shù)細(xì)胞數(shù)量，瑞氏-吉姆薩染色觀察細(xì)胞形態(tài)；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期、凋亡細(xì)胞，采用實(shí)時熒光定量PCR法檢測抑凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因p53；流式細(xì)胞儀檢測綠色熒光蛋白平均熒光強(qiáng)度(MFI)，評價其吞噬功能。結(jié)果 LPM的細(xì)胞絕對數(shù)顯著多于SPM，其直徑大于SPM，P均﹤0.01。SPM呈圓形，且大小一致；LPM呈卵圓形，大小不均。體外培養(yǎng)4、12、24 h時LPM細(xì)胞凋亡率均低于SPM，P均﹤0.01。SPM中p53基因相對表達(dá)量高于LPM，P﹤0.05；SPM與LPM中Bcl-2基因相對表達(dá)量比較，P>0.05。SPM處于G0/G1期和G2/S/M期細(xì)胞比例分別為95.8%±1.56%、4.87%±0.98%，LPM分別為97.9%±0.17%、2.76%±1.25%，P均﹥0.05。SPM和LPM綠色熒光蛋白MFI分別為1 495.33±427.21、2 837.00±450.83，P﹤0.05。結(jié)論 小鼠SPM和LPM的細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)、增殖、凋亡和吞噬功能均存在一定差異，該異質(zhì)性可能與其在腹腔中的功能有關(guān)。

巨噬細(xì)胞；小腹腔巨噬細(xì)胞；大腹腔巨噬細(xì)胞；細(xì)胞周期；細(xì)胞凋亡；吞噬功能；異質(zhì)性；小鼠

巨噬細(xì)胞存在于體內(nèi)各種器官和組織，但其異質(zhì)性顯著，不僅不同組織中的巨噬細(xì)胞在形態(tài)學(xué)、表型和功能上存在差異，同一組織中巨噬細(xì)胞也有異質(zhì)性[1～3]。近年的研究證實(shí),組織中的巨噬細(xì)胞有兩個起源，一個是由單核細(xì)胞分化而來，另一個是由胚胎期定位到組織的原始細(xì)胞分化而來，它們可以進(jìn)行自我更新[4]。目前，骨髓、神經(jīng)組織、結(jié)締組織中巨噬細(xì)胞的表型和功能的異質(zhì)性報道比較多[3～6]。腹腔內(nèi)巨噬細(xì)胞在維持腹腔內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面起著重要作用，可分為小腹腔巨噬細(xì)胞(SPM)和大腹腔巨噬細(xì)胞(LPM)兩種類型[7]，二者在炎癥狀態(tài)下的應(yīng)答反應(yīng)不同[5]。2016年1～7月，我們對比觀察了SPM和LPM的細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)、增殖、凋亡和吞噬功能的差異?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 健康SPF級6～8周雌性C57小鼠30只，體質(zhì)量18～20 g，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所動物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號：SCXK(津)2009-0002；RNeasy Mini試劑盒 (美國Qiagen公司)，MML-V逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Invitrogen公司)，SYBR Premix Ex Taq試劑盒(瑞士Roche公司)；APC標(biāo)記的抗小鼠F4/80抗體、PE標(biāo)記PI和MHC-Ⅱ抗體(美國Biolegend公司)；Annexin V Kit(美國BD Bioscience公司)；Latex Beads(美國Sigma公司)；實(shí)時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)，流式細(xì)胞分析儀(FACS Canto Ⅱ型和FACS Aria Ⅲ型，美國BD公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 腹腔內(nèi)巨噬細(xì)胞的分離和分選 頸椎脫臼法處死小鼠，沿腹中線用注射器注入3～4 mL預(yù)冷的生理鹽水，并輕輕按摩腹部5 min，注射器收集滲出液，重復(fù)2～3次。4 ℃下以250 g離心10 min，棄上清備用。取腹腔細(xì)胞懸液并計數(shù)，用APC標(biāo)記的抗小鼠F4/80和PE標(biāo)記MHC-Ⅱ抗體進(jìn)行標(biāo)記，利用F4/80和MHC-Ⅱ設(shè)門，其中F4/80lowMHC-Ⅱ+為SPM、F4/80highMHC-Ⅱ-為LPM。用Aria Ⅲ型流式細(xì)胞儀分選獲得SPM和LPM。

1.2.2 SPM和LPM細(xì)胞計數(shù)及形態(tài)觀察 取分選獲得的SPM和LPM，用CantoⅡ型流式細(xì)胞儀計數(shù)SPM和LPM，計算SPM和LPM的比例；收集SPM和LPM，進(jìn)行瑞氏-吉姆薩染色，觀察細(xì)胞形態(tài)并測量細(xì)胞直徑。

1.2.3 細(xì)胞凋亡檢測 將7×104個細(xì)胞接種在500 μL含10%血清的DMEM中，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)；1 650 r/min離心10 min，用50 μL Binding Buffer重懸；加入1.5 μL Annexin V，室溫孵育15 min；再加入100 μL Binding Buffer以及0.1 mg/L的PI 1 μL,上CantoⅡ型流式細(xì)胞儀檢測。其中Annexin V陽性細(xì)胞為凋亡細(xì)胞，Annexin V陰性細(xì)胞為活細(xì)胞，計算細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、p53基因檢測 采用實(shí)時熒光定量PCR法。取體外培養(yǎng)4 h的細(xì)胞，細(xì)胞總RNA提取方法參考Qiagen RNeasy Mini Kit說明書，按照Invitrogen公司MML-V逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)品說明書推薦方法逆轉(zhuǎn)錄，使用ABI-Prism Step One儀器進(jìn)行實(shí)時定量PCR。Bcl-2引物序列上游5′-CTG-CAAATGCTGGACTGAAA-3′，下游5′-TCAGGAGGG-TTTCCAGATTG-3′；p53引物序列上游5′-GCTTCTCCGAAGACTGGATG-3′，下游5′-CTTCACTTGGGCCTTCAAAA-3′；GAPDH引物序列上游5′-CACTTGAAGGGTGGAGC-3′，下游5′-GGGCTAAGCAGTTGGTG-3′；引物均由北京六合華大基因科技股份有限公司合成；反應(yīng)體系：cDNA 1 μL、2×SYBR Premix Ex Taq 18 μL、引物Mix 0.8 μL(上下游引物的終濃度均為10 μmol/L),用雙蒸水補(bǔ)足體系至20 μL；反應(yīng)條件:95 ℃、10 min；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，共計40個循環(huán)(生成擴(kuò)增曲線)；最后95 ℃、15 s，60 ℃、15 s，95 ℃、15 s。記錄每個反應(yīng)管中的熒光信號到達(dá)所設(shè)定域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，即Ct值。利用管家基因?qū)δ康幕蜻M(jìn)行校正，計算各樣品ΔCt值。設(shè)定校正樣品ΔCt值為標(biāo)本對應(yīng)基因的平均ΔCt值，計算ΔΔCt，目的基因的相對表達(dá)量以2-ΔΔCt表示。

1.2.5 細(xì)胞周期檢測 取SPM和LPM各7×104個，加入75%乙醇4 ℃固定24 h；3 000 r/min離心5 min，PBS洗1遍后50 μL PBS重懸；加入10 mg/mL的RNA酶3 μL，室溫孵育15 min；再加入50 μg/μL的PI，避光孵育10 min；利用BD CantⅡ型流式細(xì)胞儀檢測，計算G0/G1期和G2/S/M期細(xì)胞比例。

1.2.6 細(xì)胞吞噬功能觀察 取SPM和LPM各7×104個，用Latex Beads稀釋液100 μL(94 μL培養(yǎng)基+6 μL綠色熒光蛋白(GFP)+ Latex Beads)重懸，37 ℃孵育15 min；PBS洗2遍后用250 μL PBS重懸，利用BD CantⅡ型流式細(xì)胞儀檢測GFP陽性細(xì)胞，以平均熒光強(qiáng)度(MFI)表示細(xì)胞吞噬功能。

2 結(jié)果

2.1 SPM和LPM的細(xì)胞數(shù)量比較 腹腔內(nèi)巨噬細(xì)胞中SPM細(xì)胞絕對數(shù)為(6.05±1.56)×104/mL，占F4/80+細(xì)胞比例為13.4%±1.63%，LPM分別為(25.5±2.56)×104/mL、57.5%±2.25%；兩組比較，P均﹤0.01。

2.2 SPM和LPM的細(xì)胞形態(tài)比較 LPM細(xì)胞直徑為(10.87±0.60)μm，明顯大于SPM的(9.41±0.43)μm(P﹤0.01)。SPM呈圓形，且大小比較均一；LPM呈卵圓形，大小不均。而且，LPM核出現(xiàn)折疊和凹陷，比SPM胞核分化更成熟。見圖1。

圖1 腹腔巨噬細(xì)胞中SPM和LPM的細(xì)胞形態(tài)

2.3 SPM和LPM細(xì)胞凋亡率比較 見表1。

表1 SPM和LPM細(xì)胞凋亡率比較

注：與SPM比較，*P﹤0.01。

2.4 SPM和LPM中Bcl-2、p53基因相對表達(dá)量比較 SPM、LPM中Bcl-2基因相對表達(dá)量分別為1.06±0.25、0.69±0.10，兩組比較，P>0.05；SPM、LPM中p53基因相對表達(dá)量分別為1.00±0.76、0.41±0.02，兩組比較，P<0.05。

2.5 SPM和LPM的細(xì)胞周期比較 SPM處于G0/G1期和G2/S/M期細(xì)胞比例分別為95.8%±1.56%、4.87%±0.98%，LPM分別為97.9%±0.17%、2.76%±1.25%，兩組比較，P均﹥0.05。

2.6 SPM和LPM的吞噬功能比較 SPM和LPM中GFP的MFI分別為1 495.33±427.21、2 837.00±450.83，兩組比較，P﹤0.05。

3 討論

巨噬細(xì)胞被稱作機(jī)體免疫防御的“哨兵”，在組織損傷、病原體感染過程中發(fā)揮天然固有免疫，同時參與免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)，并且對維持機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用[8]。巨噬細(xì)胞存在于不同的器官和組織，呈現(xiàn)出組織特異性的表型，發(fā)揮不同的生物學(xué)功能[9～11]。不同組織為巨噬細(xì)胞提供不同的微環(huán)境，巨噬細(xì)胞發(fā)揮微環(huán)境特異性功能。如直腸癌微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞可以增強(qiáng)腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移能力，而膽囊癌微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞可以抑制腫瘤進(jìn)展。在同一微環(huán)境下，某些組織和漿膜腔如肺、脾臟和腹腔存在著不同駐留型巨噬細(xì)胞的亞群[3]。在脾臟中至少發(fā)現(xiàn)紅髓、嗜金屬、套區(qū)三類巨噬細(xì)胞的亞群[9,12]，同樣腹腔內(nèi)發(fā)現(xiàn)兩類不同的巨噬細(xì)胞分別為SPM和LPM，這兩群細(xì)胞參與抗腹腔內(nèi)感染和抵御炎癥相關(guān)的病原體，維持腹腔內(nèi)穩(wěn)態(tài)[7]。

腹腔內(nèi)的細(xì)胞有LPM、SPM、B細(xì)胞、T細(xì)胞、粒細(xì)胞和NK細(xì)胞，其中巨噬細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的30%～35%。本研究結(jié)果顯示，穩(wěn)態(tài)下腹腔巨噬細(xì)胞是以LPM為主，SPM比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于LPM，細(xì)胞總數(shù)也低于LPM，故LPM在維持腹腔內(nèi)穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要的作用。另外，發(fā)現(xiàn)LPM和SPM在形態(tài)學(xué)上存在較大差異，LPM直徑大于SPM；同時根據(jù)細(xì)胞核的凹陷程度和核折疊情況，LPM分化較SPM更加成熟。LPM和SPM形態(tài)學(xué)和分化程度的差異可能與其來源不同有關(guān)。有研究表明，LPM可進(jìn)行自我更新，并獨(dú)立于造血過程；而SPM起源于血液循環(huán)的單核細(xì)胞[5]。

細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示，SPM數(shù)目明顯減少，而LPM數(shù)目沒有顯著變化，說明體外培養(yǎng)LPM不易發(fā)生凋亡，而SPM卻相反。同時實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果表明，兩群細(xì)胞凋亡抑制相關(guān)基因Bcl-2表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異，而SPM的促凋亡基因p53表達(dá)水平顯著高于LPM。這證明穩(wěn)態(tài)下腹腔巨噬細(xì)胞發(fā)揮作用的是LPM，其存活時間較長；而SPM穩(wěn)態(tài)下極易發(fā)生凋亡，且處于分裂期的細(xì)胞較少。相關(guān)的研究[12]結(jié)果表明，SPM主要靠血液單核細(xì)胞來補(bǔ)充。

細(xì)胞周期檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SPM和LPM絕大多數(shù)都處于G0/G1期，處于G2/M/S期的細(xì)胞極少，即處于DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂的細(xì)胞比例極低，這與二者均屬于終末分化成熟的細(xì)胞有關(guān)。 比較SPM和LPM的吞噬功能，我們發(fā)現(xiàn)SPM吞噬GFP陽性微球的MFI顯著低于LPM，表明SPM吞噬功能顯著低于LPM。因此，我們認(rèn)為穩(wěn)態(tài)條件下發(fā)揮吞噬功能的主要是LPM，同時LPM數(shù)目明顯多于SPM，與文獻(xiàn)報道的維持穩(wěn)態(tài)的腹腔巨噬細(xì)胞主要是LPM一致[4,7]。但是，對于LPM是否存在微環(huán)境特異性功能以及如何發(fā)揮作用，需要我們進(jìn)一步探討。

[1] Mills CD, Kincaid K, Alt JM, et al. M-1/M-2 macrophages and the Th1/Th2 paradigm[J]. J Immunol, 2000,164(12):6166-6173.

[2] Mantovani A, Sica A, Sozzani S, et al. The chemokine system in diverse forms of macrophage activation and polarization[J]. Trends Immunol, 2004,25(12):677-686.

[3] Gordon S, Taylor PR. Monocyte and macrophage heterogeneity[J]. Nat Rev Immunol, 2005,5(12):953-964.

[4] Cassado Ados A, Lima MR, Bortoluci KR. Revisiting mouse peritoneal macrophages: heterogeneity, development, and function[J]. Front Immunol, 2015,6:225.

[5] Geissmann F, Jung S, Littman DR. Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties[J]. Immunity, 2003,19(1):71-82.

[6] Collison JL, Carlin LM, Eichmann M, et al. Heterogeneity in the locomotory behavior of human monocyte subsets over human vascular endothelium in vitro[J]. J Immunol, 2015,195(3):1162-1170.

[7] Ghosn EE, Cassado AA, Govoni GR, et al. Two physically, functionally, and developmentally distinct peritoneal macrophage subsets[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2010,107(6):2568-2573.

[8] Yang Y, Liu F, Tang M, et al. Macrophage polarization in experimental and clinical choroidal neovascularization[J]. Sci Rep, 2016,6:30933.

[9] Taylor PR, Martinez-Pomares L, Stacey M, et al. Macrophage receptors and immune recognition[J]. Annu Rev Immunol, 2005,23:901-944.

[10] Gordon S. The macrophage: past, present and future[J]. Eur J Immunol, 2007,37(1):9-17.

[11] Wynn TA, Chawla A, Pollard JW. Macrophage biology in development, homeostasis and disease[J]. Nature,2013,496(7446):445-455.

[12] Taylor PR, Gordon S. Monocyte heterogeneity and innate immunity[J]. Immunity, 2003,19(1):2-4.

國家自然科學(xué)基金資助項目(81570153)。

鄭國光(E-mail： zhengggtjchn@aliyun.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.42.012

R392.12

A

1002-266X(2016)42-0040-03

2016-08-25)