白花丹參提取物對阿爾茨海默病小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及機制

王璐，趙傳怡，孫利利，王浩，劉超，王惠

(1青島市商業(yè)職工醫(yī)院,山東青島266011；2泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院；3青島大學(xué)附屬醫(yī)院)

?

白花丹參提取物對阿爾茨海默病小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及機制

王璐1，趙傳怡2，孫利利2，王浩2，劉超3，王惠3

(1青島市商業(yè)職工醫(yī)院,山東青島266011；2泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院；3青島大學(xué)附屬醫(yī)院)

目的 觀察白花丹參醇提物和水提物對阿爾茨海默病(AD)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，并初步探討其機制。方法 將90只小鼠隨機分為6組各15只，A、B組分別給予白花丹參水提物20、40 g/kg灌胃，C、D組分別給予白花丹參醇提物10、20 g/kg灌胃，E、F組均給予等容量生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)灌胃14 d。給藥7 d后，F(xiàn)組側(cè)腦注射生理鹽水溶液，其余各組均側(cè)腦注射β淀粉樣蛋白溶液制作AD模型。造模1周后以Y型迷宮觀察小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，采用化學(xué)熒光法檢測腦組織活性氧(ROS)及總超氧化物歧化酶(T-SOD)。結(jié)果 E組較F組學(xué)習(xí)和記憶的錯誤次數(shù)均增多，腦組織勻漿中ROS升高、T-SOD降低(P均<0.01)；A～D組較E組學(xué)習(xí)和記憶的錯誤次數(shù)減少，腦組織勻漿中ROS降低、T-SOD升高(P均<0.05)；A、B、C、D組兩兩比較，P均>0.05。結(jié)論 白花丹參提取物可明顯改善AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其機制可能與抗氧化有關(guān)。

阿爾茨海默?。话谆ǖ?；β淀粉樣蛋白；學(xué)習(xí)記憶；活性氧；超氧化物歧化酶;小鼠

阿爾茨海默病(AD)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1～4]，但目前尚無有效的治療方法。因此，尋找有效防治AD的藥物至關(guān)重要。丹參具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩之功效，有研究發(fā)現(xiàn)其能明顯改善AD癥狀[5]。本課題組前期研究[6，7]發(fā)現(xiàn)，白花丹參提取物具有明顯的益智作用，但對于AD是否有防治作用，尚不明確。2014年5月～2015年5月，我們觀察了白花丹參醇提物和水提物對AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，并對其機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料 昆明種小鼠120只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，由泰山醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，選擇活躍且對電擊反應(yīng)較敏感的90只進入實驗；白花丹參秋季采自泰山東麓，并經(jīng)泰山醫(yī)學(xué)院中藥研究所鑒定，按文獻獲得其水提物和醇提物[8，9]；β淀粉樣蛋白(Aβ)購于Sigma公司，活性氧(ROS)測定試劑盒購于南京凱基生物有限公司，總超氧化物歧化酶(T-SOD)測試盒購于南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與給藥處理 將90只小鼠隨機分為6組各15只，A、B組分別給予白花丹參水提物20、40 g/kg灌胃，C、D組分別給予白花丹參醇提物10、20 g/kg灌胃，E、F組均給予等容量生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)灌胃14 d。給藥7 d后，F(xiàn)組側(cè)腦注射生理鹽水溶液，其余各組均側(cè)腦注射Aβ溶液制作AD模型[10]。

1.2.2 小鼠學(xué)習(xí)記憶能力觀察[11]造模7 d后，小鼠末次給藥24 h后進行Y型迷宮測試。實驗在三等分的Y型迷宮進行，工作電壓30～80 V，迷宮3個末端小區(qū)可按Ⅰ→Ⅱ→Ⅲ→Ⅰ的輪換順序分別作為起步區(qū)或安全區(qū)。小鼠受到電擊后，直接由起步區(qū)逃至安全區(qū)為正確反應(yīng)，否則均屬錯誤反應(yīng)。先將老鼠放入Y型迷宮適應(yīng)3 min，以1個實驗日內(nèi)完成30次反應(yīng)中的錯誤次數(shù)為學(xué)習(xí)成績；24 h后重復(fù)測驗，錯誤次數(shù)為記憶成績。

1.2.3 小鼠腦組織ROS檢測 采用化學(xué)熒光法。Y型迷宮測試結(jié)束后，頸椎脫臼處死小鼠，取出腦組織；制備勻漿，離心取上清。將上清液加于96孔板中，再加入1 mmol/L的DCFH-DA溶液，置于酶標(biāo)儀中。37 ℃保溫，30 min后于激發(fā)波長為485 nm下檢測熒光強度。

1.2.4 小鼠腦組織T-SOD檢測 采用羥胺法。取小鼠腦組織制備1%勻漿，按T-SOD檢測試劑盒說明書操作。

2 結(jié)果

2.1 白花丹參提取物對AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 見表1。

表1 各組小鼠學(xué)習(xí)記憶的錯誤次數(shù)比較(次，±s)

注：與E組比較，*P<0.01；與F組比較，#P<0.05。

2.2 白花丹參提取物對AD小鼠腦組織勻漿中ROS、T-SOD水平的影響 見表2。

表2 各組小鼠腦組織勻漿中ROS、T-SOD水平比較

注：與E組比較，*P<0.01；與F組比較，#P<0.05。

3 討論

AD是一種與衰老相關(guān)、以認(rèn)知功能下降為特征的漸進性腦退行性疾病。AD患者大腦皮質(zhì)彌散性萎縮、神經(jīng)元丟失、突觸減少，細(xì)胞外Aβ沉積形成老年斑是其特征性病理變化。Aβ聚集后具有神經(jīng)毒性，誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，被認(rèn)為是AD發(fā)生的關(guān)鍵分子[12]。因此，本文選用Aβ誘導(dǎo)AD模型。白花丹參味苦，微寒，歸心、肝經(jīng)，有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩的功能[13]。研究表明[14，15]，丹參及復(fù)方丹參注射液能明顯提高實驗動物的學(xué)習(xí)記憶能力，而丹參酮能改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙。本實驗通過Aβ所致學(xué)習(xí)、記憶障礙AD模型，觀察白花丹參提取物對小鼠學(xué)習(xí)、記憶能力的影響。實驗結(jié)果顯示，白花丹參水提物及醇提物均能明顯減少學(xué)習(xí)時的錯誤次數(shù)，增強小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，說明白花丹參提取物具有改善AD的作用。

Aβ可誘導(dǎo)氧化損傷，在Aβ沉積形成淀粉樣斑塊時會產(chǎn)生H2O2；具有氧化還原活性的鐵在神經(jīng)纖維纏結(jié)和Aβ沉積斑中增多，又會催化H2O2生成羥基，引起細(xì)胞氧化應(yīng)激性損傷，從而損傷神經(jīng)細(xì)胞。AD患者大腦特別是海馬區(qū)代謝活躍，需氧量大，極易產(chǎn)生自由基。線粒體作為細(xì)胞有氧呼吸的主要場所，也是產(chǎn)生和清除自由基的主要場所。Aβ可使線粒體功能受到損害，自由基不能及時清除而在細(xì)胞內(nèi)堆積，從而對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。本實驗結(jié)果表明，Aβ可致腦組織ROS升高、T-SOD下降，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷，而白花丹參提取物能明顯地抑制Aβ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。說明白花丹參對Aβ誘導(dǎo)AD小鼠學(xué)習(xí)記憶的保護作用與其抗氧化有關(guān)。

綜上所述，白花丹參水提物與醇提物均能夠顯著提高AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，該作用可能與抗氧化有關(guān)。因此，白花丹參在AD防治中具有一定開發(fā)應(yīng)用前景。

[1] Selkoe DJ, Hardy J. The amyloid hypothesis of Alzheimer′s disease at 25years[J]. Embo Mol Med, 2016,8(6):595-608.

[2] Aso E, Lomoio S, López-González I, et al. Amyloid Generation and dysfunctional immunoproteasome activation with disease progression in animal model of familial Alzheimer′s disease[J]. Brain Pathol, 2012,22(5):636-653.

[3] Small DH, Mclean CA. Alzheimer′s disease and the amyloid beta protein: what is the role of amyloid[J]. J Neurochemistry, 1999,73(73):443-449.

[4] Halliday G, Robinson SR, Shepherd C, et al. Alzheimer′s disease and inflammation: a review of cellular and therapeutic mechanisms[J]. Clin Exp Pharmacology Physiology, 2003,27(1-2):1-8.

[5] 司金超,李蔚,喬鵬,等.白花丹參根制劑對AD大鼠學(xué)習(xí)記憶和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡的影響[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志,2014,30(6):671-676.

[6] 王浩,高允生,張慶樂,等.白花丹參水提物促進小鼠學(xué)習(xí)記憶作用研究[J].醫(yī)藥導(dǎo)報,2009,28(2):173-175.

[7] 李聚倉,鄭輝,王德才,等.白花丹參水提物對衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2011,29(4):884-885.

[8] 黃元紅,衛(wèi)天喜,張發(fā)生,等.星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)選丹參提取工藝[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2010,16(17):28-31.

[9] 董美虹,王錦玉,仝燕,等.白花丹參提取工藝優(yōu)選[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2012,18(13):18-21.

[10] 張季,嚴(yán)春臨,張丹參,等.蒺藜皂苷對β-淀粉樣肽(25-35)所致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用及機制[J].中國老年學(xué)雜志,2010,30(24):3747-3749.

[11] 張東明.Y型迷宮實驗和Morris水迷宮實驗的比較[J].中國醫(yī)藥科學(xué),2011,1(20):26-27.

[12] Aso E, Lomoio S, López-González I, et al. Amyloid generation and dysfunctional immunoproteasome activation with disease progression in animal model of familial Alzheimer′s disease[J]. Brain Pathology, 2012,22(5):636-653.

[13] 馬丙祥,董寵凱.丹參的藥理作用研究新進展[J].中國藥房,2014,25(7):663-665.

[14] 李林,陳姿亦,茹立強.丹參酮對D-半乳糖-Aβ_(1-40)復(fù)合癡呆模型大鼠的作用機制[J].蘭州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2010,36(2):12-16.

[15] 仇淑君,王忠良,李廣意,等.丹參對AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶及腦內(nèi)和血清內(nèi)乙酰膽堿酯酶含量的影響[J]. 長沙醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2014,31(4):17-20.

山東省泰安市科技發(fā)展引導(dǎo)計劃項目(20132107)。

王浩(E-mail: tywanghao_2005@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.42.010

R749.16；R969

A

1002-266X(2016)42-0035-02

2016-05-25)