胃癌組織核受體輔激活蛋白5的表達(dá)變化及其臨床意義

劉松杰，閆東紅，徐兵

(新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院，河南新鄉(xiāng)453000)

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胃癌組織核受體輔激活蛋白5的表達(dá)變化及其臨床意義

劉松杰，閆東紅，徐兵

(新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院，河南新鄉(xiāng)453000)

目的 探討核受體輔激活蛋白5(NCOA5)在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。方法 選擇胃癌患者72例，取其手術(shù)切除的胃癌組織及其配對的癌旁正常組織，采用FQ-PCR、Western blotting法檢測NCOA5 mRNA和蛋白表達(dá)，分析NCOA5表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果 胃癌組織及癌旁正常組織NCOA5 mRNA表達(dá)下調(diào)率分別為80.6%(58/72)、16.7%(12/72)；NCOA5蛋白表達(dá)缺失率分別為75.0%(54/72)、13.9%(10/72)，二者比較P均<0.05。胃癌組織NCOA5 mRNA表達(dá)下調(diào)及NCOA5蛋白表達(dá)缺失與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均無關(guān)(P均>0.05)，與腫瘤組織分化程度、TNM分期均有關(guān)(P均<0.05)；胃癌組織NCOA5 mRNA表達(dá)下調(diào)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，而NCOA5蛋白表達(dá)缺失與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05)。結(jié)論 NCOA5低表達(dá)可能促進(jìn)胃癌的發(fā)生、發(fā)展。

胃癌；核受體輔激活蛋白5；臨床病理參數(shù)

胃癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素、多階段逐步演化的過程，涉及多種抑癌基因的失活和原癌基因的激活[1，2]。核受體輔激活蛋白5(NCOA5)是新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，是由579個氨基酸組成的核受體輔助調(diào)節(jié)因子。最新研究表明，NCOA5基因缺失與肝癌的發(fā)生有關(guān)[3，4]；但NCOA5與胃癌的關(guān)系鮮見報(bào)道。為此，我們進(jìn)行了如下研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 研究對象為2010年1月～2016年1月我院收治的72例胃癌患者，男46例、女26例，年齡(58.2±4.5)歲(<60歲40例、≥60歲32例)。72例患者均行手術(shù)治療，術(shù)前未接受放療、化療或其他抗癌治療。腫瘤位于胃食管連接部(發(fā)生于胃食管連接部近端5 cm和遠(yuǎn)端5 cm之間)28例，胃部[5]44例；腫瘤直徑(3.6±0.3)cm(<3 cm 20例、≥3 cm 52例)；組織分化程度：高、中分化30例，低、未分化42例；TNM分期(采用2010年國際抗癌聯(lián)盟/美國癌癥聯(lián)合委員會分期標(biāo)準(zhǔn)[6])：Ⅰ、Ⅱ期29例，Ⅲ、Ⅳ期43例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移12例。

1.2 胃癌組織及癌旁正常組織NCOA5表達(dá)檢測 取手術(shù)切除的胃癌組織及其配對的癌旁正常組織(距癌組織≥2 cm)，離體后立即置于滅活RNA酶的凍存管中液氮冷凍，-80 ℃低溫冰箱凍存。①NCOA5 mRNA表達(dá)檢測：采用FQ-PCR技術(shù)。取胃癌組織及癌旁正常組織各50～100 mg，采用TRIzol法提取總RNA。取總RNA 2 μg，按RT Easy TM Ⅰ試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)Real Time PCR Easy TM-SYBR Green Ⅰ試劑盒說明書配備反應(yīng)體系，以β-actin作為內(nèi)參，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火/延伸30 s，共40個循環(huán)。以2-ΔΔCT法計(jì)算NCOA5 mRNA相對表達(dá)量。NCOA5 mRNA相對表達(dá)量≥1為表達(dá)上調(diào)，<1為表達(dá)下調(diào)[7]。②NCOA5蛋白表達(dá)檢測：采用Western blotting法。取胃癌組織及癌旁正常組織各50 mg，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BSA法繪制蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定提取的蛋白濃度，并將提取的蛋白與SDS上樣緩沖液混合，100 ℃煮沸5 min。配制10% SDS-聚丙烯酰胺分離膠和5% SDS-聚丙烯酰胺濃縮膠，電泳槽中加入Tris-甘氨酸電泳緩沖液，每個泳道加入20 μg蛋白。電泳2 h，以濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印于聚偏氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉封閉抗原，加入NCOA5山羊抗人多克隆抗體(1∶1 000稀釋)4 ℃過夜。次日洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗山羊IgG二抗(1∶3 000稀釋)，室溫?fù)u床上孵育1 h，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑孵育5 min，曝光成像，采用Adobe Photoshop CS5分析其圖像灰度值。NCOA5蛋白的表達(dá)用β-actin蛋白的表達(dá)量來校正。以NCOA5基因的灰度值與β-actin基因的灰度值之比為相互比較的參數(shù)，以癌旁正常組織的平均值為標(biāo)準(zhǔn)，大于及在此范圍內(nèi)為蛋白表達(dá)，未出現(xiàn)條帶及低于正常范圍為蛋白表達(dá)缺失[8]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以百分率表示，結(jié)果比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織及癌旁正常組織NCOA5 mRNA和蛋白表達(dá)比較 胃癌組織NCOA5 mRNA表達(dá)下調(diào)率為80.6%(58/72)，癌旁正常組織為16.7%(12/72)，二者比較P<0.05。胃癌組織NCOA5蛋白表達(dá)缺失率為75.0%(54/72)，癌旁正常組織為13.9%(10/72)，二者比較P<0.05。

2.2 胃癌組織NCOA5表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 胃癌組織及癌旁正常組織NCOA5 mRNA和蛋白表達(dá)具有一致性，即胃癌組織NCOA5呈低表達(dá)，其與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)(P均>0.05)，而與腫瘤組織分化程度及TNM分期均有關(guān)(P均<0.05)。見表1。

表1 胃癌組織NCOA5表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

腫瘤標(biāo)志物可反映腫瘤的生物學(xué)特征，對腫瘤的診斷、治療及預(yù)后具有重要意義。如胃癌的腫瘤標(biāo)志物——AFP、CEA、CA19-9等已成為近年來研究的熱點(diǎn)[9，10]。

NCOA5是由579個氨基酸組成的核受體輔助調(diào)節(jié)因子，位于人染色體20q13.12，也是雌激素α、β受體和孤核激素受體BD73的輔激活蛋白[3，11]。有研究發(fā)現(xiàn)，NCOA5基因缺陷可誘發(fā)雄性小鼠原發(fā)性肝癌，又能導(dǎo)致小鼠糖耐量減低。炎癥是2型糖尿病和肝細(xì)胞癌的共同致病基礎(chǔ)，其中IL-6是較為常見的致病因子，盡管IL-6在胰島素抵抗中的作用已被發(fā)現(xiàn)，但一些研究表明，IL-6表達(dá)增加對胰島素作用的影響具有高度組織特異性并依賴其生理狀態(tài)，如小鼠處于運(yùn)動狀態(tài)時骨骼肌釋放的IL-6能改善胰島素的敏感性，而IL-6的表達(dá)缺失可增加胰島素抵抗。此外，肝臟中IL-6的表達(dá)增加能引起慢性炎癥，導(dǎo)致胰島素抵抗和肝細(xì)胞癌的發(fā)生，同時阻止IL-6的過表達(dá)可限制部分原發(fā)性肝癌的發(fā)生、發(fā)展，尤其在胰島素抵抗的早期、肝臟脂肪變性和結(jié)構(gòu)異常時；IL-6-STAT3信號通路的異常激活可能是導(dǎo)致小鼠和人肝細(xì)胞癌發(fā)生的重要因素[3，12,13]。有研究表明，雌激素信號是2型糖尿病和肝細(xì)胞癌發(fā)生的另一條重要調(diào)節(jié)通路，雌激素和雌激素α受體(ERα)能夠調(diào)節(jié)炎癥因子表達(dá)、葡萄糖和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)及胰島β細(xì)胞生存，故能對2型糖尿病和肝細(xì)胞癌提供保護(hù)作用，ERα亦能像其他轉(zhuǎn)錄因子一樣通過輔激活因子和輔阻遏因子調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。研究還發(fā)現(xiàn)，NCOA5可能與TNF-α、NF-κB有關(guān)，如TNF-α在NCOA5基因缺陷的動物組織中表達(dá)顯著升高，但這種基因缺陷能否被逆轉(zhuǎn)及其在人體中的具體作用機(jī)制尚不十分清楚[14～17]。

本研究結(jié)果顯示，胃癌組織NCOA5 mRNA表達(dá)下調(diào)率、NCOA5蛋白表達(dá)缺失率均高于癌旁正常組織。說明在胃癌組織中NCOA5呈低表達(dá)，在癌旁正常組織中呈高表達(dá)，故認(rèn)為NCOA5可能是胃癌的一種抑癌基因。本研究還發(fā)現(xiàn)，胃癌組織NCOA5 mRNA表達(dá)下調(diào)及NCOA5蛋白表達(dá)缺失與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均無關(guān)，與腫瘤組織分化程度、TNM分期均有關(guān)；胃癌組織NCOA5 mRNA表達(dá)下調(diào)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而NCOA5蛋白表達(dá)缺失與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。提示NCOA5低表達(dá)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、分化，而上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (EMT) 通常被認(rèn)為是腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的前提，因此推測NCOA5可能參與了EMT過程，進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

總之，我們認(rèn)為NCOA5低表達(dá)可能促進(jìn)胃癌的發(fā)生及發(fā)展。

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