血管活性腸肽對(duì)自身免疫性腦脊髓炎大鼠神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制

楊元，袁正洲，呂志宇，張淑江，李曉紅，李作孝

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州646000)

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血管活性腸肽對(duì)自身免疫性腦脊髓炎大鼠神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制

楊元，袁正洲，呂志宇，張淑江，李曉紅，李作孝

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州646000)

目的 探討血管活性腸肽(VIP)對(duì)自身免疫性腦脊髓炎(EAE)大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及其相關(guān)作用機(jī)制。方法 將60只健康雌性Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、VIP低劑量組和VIP高劑量組，每組15只。另取10只豚鼠，斷頸處死，迅速分離脊髓，研磨勻漿，加入完全弗氏佐劑制備抗原，除正常對(duì)照組外均誘導(dǎo)建立EAE模型。自造模當(dāng)日起，每隔一日VIP低、高劑量組分別腹腔注射VIP 4、16 nmol/kg，正常對(duì)照組及模型對(duì)照組同期分別腹腔注射0.8 mL生理鹽水，連續(xù)5次。自造模當(dāng)日起，記錄各組精神、行動(dòng)等一般情況，EAE潛伏期和進(jìn)展期，于發(fā)病高峰期行神經(jīng)病殘疾評(píng)分(NDS)。于發(fā)病高峰期處死大鼠，未發(fā)病大鼠飼養(yǎng)8周處死，取腦組織。采用ELISA法檢測(cè)腦組織勻漿IL-17A表達(dá)，采用免疫組化SP法檢測(cè)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值(以此作為GFAP表達(dá))。結(jié)果 正常對(duì)照組均未發(fā)病，模型對(duì)照組及VIP低、高劑量組均出現(xiàn)不同程度食量下降、精神萎靡、后肢無(wú)力、尾部拖地，且模型對(duì)照組癥狀最重，VIP高劑量組癥狀最輕。模型對(duì)照組及VIP低、高劑量組EAE潛伏期逐漸延長(zhǎng)，進(jìn)展期逐漸縮短；組間兩兩比較P<0.05或<0.01。模型對(duì)照組、VIP低劑量組高峰期NDS均高于VIP高劑量組(P均<0.01)。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組及VIP低、高劑量組腦組織IL-17A及GFAP表達(dá)均升高(P均<0.05)。模型對(duì)照組及VIP低、高劑量組腦組織IL-17A及GFAP表達(dá)均依次降低，組間兩兩比較P均<0.05。結(jié)論 VIP對(duì)EAE大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用，并呈一定濃度依賴(lài)性；降低腦組織IL-17A表達(dá)、抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化可能是其作用機(jī)制之一。

自身免疫性腦脊髓炎；血管活性腸肽；白細(xì)胞介素17A；星形膠質(zhì)細(xì)胞；大鼠

多發(fā)性硬化(MS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)自身免疫性疾病，其基礎(chǔ)研究多采用自身免疫性腦脊髓炎(EAE)動(dòng)物模型。MS患者Th1/Th2細(xì)胞免疫平衡被破壞，最終發(fā)生炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、白質(zhì)脫髓鞘、軸突變性等病理改變[1]。隨著對(duì)自身免疫性疾病的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，由Th17細(xì)胞產(chǎn)生的IL-17A可通過(guò)與其受體結(jié)合加速中樞炎癥反應(yīng)，可能與EAE的發(fā)生有關(guān)[2，3]。研究表明，血管活性腸肽(VIP)可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞增殖、分化及遷移，抑制炎性因子(IL-17A、IFN-γ、NO等)的合成及分泌，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[4]。VIP治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的效果較好[5]，但其對(duì)MS的治療作用及其相關(guān)機(jī)制報(bào)道較少。為此，我們于2014年6月～2015年1月進(jìn)行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 動(dòng)物：健康雌性Wistar大鼠60只，6～8周齡，體質(zhì)量200～250 g；健康豚鼠10只，雌雄不限，6～8周齡，體質(zhì)量250～300 g；均購(gòu)于瀘州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。試劑：VIP(0.5 mg/支)購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；完全弗氏佐劑(CFA)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，IL-17A ELISA試劑盒購(gòu)于廣州雅怡生物科技有限公司；兔抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)多克隆抗體(1∶160)購(gòu)于上海雅吉生物科技有限公司；免疫組化試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 免疫抗原制備 斷頸處死10只豚鼠，無(wú)菌條件下迅速分離脊髓，去脊膜。稱(chēng)質(zhì)量后移入玻璃勻漿器，與等量生理鹽水混合，研磨成50%的全脊髓勻漿(WSCH)。將CFA與WSCH等體積混合，采用玻璃注射器抽打至油包水乳狀，以滴在水面不散確定為合格抗原。

1.3 動(dòng)物分組及EAE模型制備 將60只Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、VIP低劑量組、VIP高劑量組，每組15只。取1.2中制備好的免疫抗原，以0.2 mL/100 g注入模型對(duì)照組及VIP低、高劑量組雙側(cè)后肢足掌皮下，正常對(duì)照組注射等量生理鹽水和CFA混合液。自造模當(dāng)日起，VIP低劑量組每隔一日腹腔注射VIP 4 nmol/kg(約0.2 mL)，VIP高劑量組腹腔注射VIP 16 nmol/kg(約0.8 mL)，正常對(duì)照組及模型對(duì)照組同期腹腔注射0.8 mL生理鹽水，共5次。

1.4 相關(guān)指標(biāo)觀(guān)察

1.4.1 發(fā)病情況 自造模當(dāng)日起，記錄各組精神、行動(dòng)等一般情況，EAE潛伏期(從大鼠正常飲食、活動(dòng)到出現(xiàn)食量下降、活動(dòng)能力降低的時(shí)間)和進(jìn)展期(從大鼠活動(dòng)能力降低到出現(xiàn)自傷后肢、精神極度衰弱、癱瘓、抽搐的時(shí)間)。大鼠出現(xiàn)爬行困難、自傷后肢、精神極度衰弱、癱瘓(單肢體、雙肢體、四肢)、抽搐、瀕死或死亡為發(fā)病高峰期，由同一觀(guān)察者于發(fā)病高峰期采用Kono′s評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)行神經(jīng)病殘疾評(píng)分(NDS)。

1.4.2 腦組織IL-17A表達(dá) 于發(fā)病高峰期處死大鼠，未發(fā)病大鼠飼養(yǎng)8周處死。無(wú)菌條件下采用組織剪剖開(kāi)頂、枕、頸部皮膚及皮下組織，用鑷子沿枕骨大孔向上打開(kāi)顱骨；向下分離頸椎棘突，充分暴露腦組織；剪開(kāi)側(cè)腦室，PBS反復(fù)沖洗后取出腦組織。將腦組織與生理鹽水制成體積分?jǐn)?shù)為10%的腦組織勻漿，3 500 r/min離心10 min。取上清液，于-20 ℃冰箱保存。采用ELISA法檢測(cè)腦組織勻漿上清液IL-17A表達(dá)。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4.3 腦組織星形膠質(zhì)細(xì)胞活化情況 采用免疫組化SP法。將大鼠腦組織制成石蠟切片，常規(guī)脫蠟、水化、清除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性、封閉組織蛋白，逐次滴加兔抗GFAP多克隆抗體一抗(以1∶160 稀釋)、生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗、辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素。常規(guī)DAB顯色，復(fù)染，脫水，透明，封片。于400倍光鏡下觀(guān)察大鼠腦組織GFAP表達(dá)情況，以細(xì)胞質(zhì)染成棕黃色判定為陽(yáng)性細(xì)胞。采用ImagePro Plus軟件對(duì)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度(IOD)值進(jìn)行半定量分析，以此反映腦組織星形膠質(zhì)細(xì)胞活化情況。

2 結(jié)果

2.1 各組發(fā)病情況 正常對(duì)照組均未發(fā)病，模型對(duì)照組及VIP低、高劑量組均出現(xiàn)不同程度食量下降、精神萎靡、后肢無(wú)力、尾部拖地，造模第14～17天癥狀最典型，表現(xiàn)為雙側(cè)后肢無(wú)力拖地、行走畫(huà)圈、爬行困難、自傷后肢、精神極度衰弱、癱瘓、抽搐。模型對(duì)照組癥狀最重，VIP高劑量組癥狀最輕。各組均未出現(xiàn)死亡。模型對(duì)照組及VIP低、高劑量組EAE潛伏期逐漸延長(zhǎng)，進(jìn)展期逐漸縮短；組間兩兩比較P<0.05或<0.01。模型對(duì)照組及VIP低劑量組高峰期NDS均高于VIP高劑量組(P均<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 模型對(duì)照組及VIP低、高劑量組EAE潛伏期、進(jìn)展期及NDS比較

注：與模型對(duì)照組比較，#P<0.05，*P<0.01；與VIP低劑量組比較，△P<0.05，▲P<0.01。

2.2 各組腦組織IL-17A及GFAP表達(dá)比較 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組及VIP低、高劑量組腦組織IL-17A及GFAP表達(dá)均升高(P均<0.05)。模型對(duì)照組及VIP低、高劑量組腦組織IL-17A及GFAP表達(dá)均依次降低，組間兩兩比較P均<0.05。見(jiàn)表2。

表2 各組腦組織IL-17A及GFAP表達(dá)比較

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.01；與模型對(duì)照組比較，#P<0.05，△P<0.01；與VIP低劑量組比較，▲P<0.01。

2.3 NDS與腦組織IL-17A及GFAP表達(dá)的關(guān)系 模型對(duì)照組NDS與腦組織IL-17A、GFAP表達(dá)均呈正相關(guān)(r分別為0.798、0.825，P均<0.05)。

3 討論

VIP是一種非膽堿能非腎上腺能神經(jīng)遞質(zhì)，由28個(gè)氨基酸殘基組成，屬于胰高血糖素-胰泌素家族。VIP通過(guò)與其受體結(jié)合，具有調(diào)節(jié)神經(jīng)血管、腦血流、皮層能量代謝、下丘腦和垂體間功能、擴(kuò)張血管作用。腦內(nèi)注射VIP可明顯減小腦缺血后梗死體積，說(shuō)明其具有神經(jīng)保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，造模后模型對(duì)照組及VIP低、高劑量組均出現(xiàn)不同程度食量下降、精神萎靡、后肢無(wú)力、尾部拖地等EAE樣表現(xiàn)，但模型對(duì)照組癥狀最重，VIP高劑量組癥狀最輕；且模型對(duì)照組及VIP低、高劑量組EAE潛伏期逐漸延長(zhǎng)，進(jìn)展期逐漸縮短；說(shuō)明VIP可減緩EAE的發(fā)病進(jìn)程。本研究模型對(duì)照組、VIP低劑量組NDS均明顯高于VIP高劑量組，說(shuō)明VIP對(duì)EAE大鼠具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用，且高劑量時(shí)效果更明顯。

IL-17A是一種具有強(qiáng)烈促炎作用的細(xì)胞因子，其主要作用包括：①調(diào)節(jié)固有免疫癥[6，7]：IL-17A作為炎癥介質(zhì)，參與自身免疫性炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展，通過(guò)作用于基因靶點(diǎn)產(chǎn)生急性期反應(yīng)蛋白、炎癥趨化因子等物質(zhì)；同時(shí)上調(diào)組織相容性復(fù)合體-Ⅱ抗原、集落共刺激因子、T細(xì)胞刺激因子表達(dá)，促使T細(xì)胞活化，導(dǎo)致免疫失衡。②信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用[8，9]：IL-17A作為細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間信使，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，可促進(jìn)多種炎性蛋白的轉(zhuǎn)錄及合成，加速免疫紊亂。星形膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種非特異性抗原提呈細(xì)胞，參與復(fù)雜的免疫病理過(guò)程[10]。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組及VIP低、高劑量組腦組織IL-17A及GFAP表達(dá)均升高，模型對(duì)照組及VIP低、高劑量組腦組織IL-17A及GFAP表達(dá)均依次降低。說(shuō)明VIP對(duì)EAE大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用可能與其降低腦組織IL-17A表達(dá)、抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化有關(guān)，并呈一定的濃度依賴(lài)性。EAE大鼠腦組織IL-17A表達(dá)升高，可能通過(guò)Act1轉(zhuǎn)錄因子激活星形膠質(zhì)細(xì)胞，從而促進(jìn)炎癥因子釋放，加速髓鞘脫失的發(fā)生、發(fā)展[11，12]，同時(shí)活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)上調(diào)GFAP表達(dá)，形成活化的膠質(zhì)斑塊[13]；而VIP可減輕上述反應(yīng)，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[14]。

Abad等[15]在體外抗原激發(fā)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，VIP基因剔除 (VIP KO) 的EAE小鼠在免疫效應(yīng)期未受到損害，而將髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白35-55多肽誘導(dǎo)的EAE小鼠VIP基因剔除后，從其體內(nèi)分離出的淋巴細(xì)胞能將EAE疾病過(guò)繼轉(zhuǎn)移給野生型小鼠。VIP基因剔除的小鼠對(duì)EAE耐受的機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明，但在腦脊膜和脊髓內(nèi)有CD4+T細(xì)胞、Th17細(xì)胞的入侵，而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)實(shí)質(zhì)卻沒(méi)有免疫細(xì)胞的侵入。因此認(rèn)為其可能存在淋巴細(xì)胞遷徙的免疫缺陷。

綜上所述，VIP對(duì)EAE大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用，并呈一定濃度依賴(lài)性；降低腦組織IL-17A表達(dá)、抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化可能是其作用機(jī)制之一。

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瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院青年基金資助項(xiàng)目(14036)。

李作孝(E-mail： lzx3235@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.40.012

R744.5

A

1002-266X(2016)40-0040-03

2016-01-05)