IL-33對克羅恩病小鼠腸組織細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子的影響

孫科明，孫華文，曾放，劉順，楊厚淶，吳紅學(xué)

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院，武漢430060)

?

·基礎(chǔ)研究·

IL-33對克羅恩病小鼠腸組織細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子的影響

孫科明，孫華文，曾放，劉順，楊厚淶，吳紅學(xué)

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院，武漢430060)

目的 探討IL-33對克羅恩病(CD)小鼠腸組織細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β)及轉(zhuǎn)錄因子(T-bet、GATA-3、FOXP3)的影響。方法 選擇雌性BALB/c小鼠45只，隨機(jī)分為對照組、TNBS組、IL-33組，每組15只。TNBS組、IL-33組給予TNBS/50%乙醇混合溶液灌腸建立CD模型，對照組僅予生理鹽水灌腸。灌腸后TNBS組腹腔注射PBS，IL-33組腹腔注射重組鼠IL-33(rIL-33)，對照組腹腔注射PBS。各組于腹腔注射第5天處死，取腸組織行HE染色，觀察腸組織病理變化；采用ELISA法檢測腸組織上清液IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β,Western blotting法檢測腸組織T-bet、GATA-3、FOXP3蛋白表達(dá)。結(jié)果 與對照組比較，TNBS組腸組織炎癥明顯；腸組織IFN-γ水平升高，IL-4、IL-10、TGF-β水平降低(P均<0.05)；T-bet蛋白表達(dá)升高，GATA-3、FOXP3蛋白表達(dá)降低(P均<0.05)。與TNBS組比較，IL-33組腸組織炎癥相對較輕；IFN-γ水平降低，IL-4、IL-10、TGF-β表達(dá)升高(P均<0.05)，T-bet蛋白表達(dá)降低，GATA-3、FOXP3蛋白表達(dá)升高(P均<0.05)。結(jié)論 IL-33能緩解CD小鼠病情，其機(jī)制與抑制Th1細(xì)胞分化、誘導(dǎo)Th2和Treg細(xì)胞產(chǎn)生有關(guān)。

克羅恩病；白細(xì)胞介素33；細(xì)胞因子；轉(zhuǎn)錄因子

克羅恩病(CD)是炎癥性腸病(IBD)的一種，其發(fā)病機(jī)制至今尚不完全清楚，免疫功能紊亂和Th1細(xì)胞異?；罨赡苁菍?dǎo)致CD的重要因素[1～3]。Th1細(xì)胞主要通過分泌IFN-γ等細(xì)胞因子發(fā)揮致炎作用，而Th2細(xì)胞分泌的IL-4及Treg細(xì)胞分泌的IL-10、TGF-β等細(xì)胞因子可抑制Th0向Th1細(xì)胞分化，起到緩解炎癥的作用。IL-33是最新發(fā)現(xiàn)的IL-1家族成員，其受體是ST2，二者結(jié)合后通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑引起機(jī)體免疫應(yīng)答的改變，還可誘導(dǎo)IL-4、IL-10、TGF-β等細(xì)胞因子的分泌[4]，繼而影響Th1、Th2、Treg等細(xì)胞，起到免疫調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，IL-33在不同疾病中發(fā)揮的作用不盡相同，如加重哮喘、關(guān)節(jié)炎等病情[5，6]，緩解動脈粥樣硬化、肝炎等病情[7，8]。2015年5～10月，我們觀察了重組鼠IL-33(rIL-33)對CD小鼠免疫相關(guān)細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β)及轉(zhuǎn)錄因子(T-bet、GATA-3、FOXP3)表達(dá)的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雌性BALB/c小鼠45只，SPF級，6～8周齡，體質(zhì)量14～20 g，由武漢大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，動物許可證號：w20150467。2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)，美國Sigma公司；4%中性甲醛溶液，武漢谷歌生物科技有限公司；TRIzol，美國Invitrogen公司；rIL-33，美國RD公司；IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β ELISA試劑盒，美國R&D公司；GAPDH抗體，杭州賢至生物科技有限公司；FOXP3、GATA-3抗體，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；T-bet抗體，美國Santa公司；HRP標(biāo)記的羊抗小鼠二抗，武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 動物模型制備及處理 所有小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7天，隨機(jī)分為對照組、TNBS組、IL-33組，每組15只。TNBS組、IL-33組參照Kim等[9]的方法建立CD模型[按TNBS水溶液∶50%乙醇(1∶1)混合，取100 μL肛門灌注一次]，造模前禁食24 h、不禁水。對照組肛門灌注100 μL生理鹽水。液體緩慢灌注完畢，拔出導(dǎo)管，保持小鼠倒立姿勢60 s，灌腸后正常飼養(yǎng)。灌腸后對照組腹腔注射PBS 100 μL/次，1次/d；TNBS組腹腔注射PBS 100 μL/次，1次/d；IL-33組腹腔注射含2 μg rIL-33[10]的PBS 100 μL/次，1次/d。各組均連續(xù)注射4天。第5天頸椎脫臼法處死，取肛門至回盲部腸管。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1 腸組織病理形態(tài)觀察 取各組腸組織，4%中性甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚切片。切片經(jīng)60 ℃烤箱烤片后，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫苯，蒸餾水沖洗；蘇木精染色，自來水沖洗；1%鹽酸鏡檢分化，自來水沖洗至切片顏色變藍(lán)；梯度乙醇脫水，0.5%伊紅乙醇溶液對比染色，二甲苯透明，中性樹脂封片。顯微鏡下觀察各組腸組織病理形態(tài)變化。

1.3.2 腸組織上清液IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β檢測 取10 mg腸組織加入1 mL PBS混合液(pH=6.0，內(nèi)含1 μg抑肽酶、亮肽素、胃蛋白酶抑素A)，剪碎勻漿，4 ℃ 12 000 g/min離心20 min，取上清液，保存?zhèn)錂z。采用ELISA法檢測IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β。

1.3.3 腸組織T-bet、GATA-3、FOXP3蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。剩余腸組織用RIPA裂解液提取蛋白，測定蛋白的濃度和純度后，取50 μg總蛋白上樣電泳，根據(jù)蛋白分子量配置10% PAGE凝膠電泳，直至溴酚藍(lán)前沿跑出膠后停止電泳；轉(zhuǎn)膜(濕轉(zhuǎn)法)，取出凝膠根據(jù)Marker切取目的條帶，用蒸餾水沖洗，剪取與PAGE凝膠相同大小的PVDF膜和濾紙，PVDF膜用甲醇浸泡數(shù)秒后和濾紙一同浸泡于電轉(zhuǎn)緩沖液中，按照黑色板→纖維墊→濾紙→凝膠→PVDF膜→濾紙→纖維墊→白色板依次放好，夾緊板后放入轉(zhuǎn)膜儀內(nèi)，黑色板的一面對黑色負(fù)極。轉(zhuǎn)膜條件：200 mA，120 min；封閉：用含5%脫脂奶粉的TBST(封閉液)浸泡PVDF膜，室溫?fù)u床封閉2 h；一抗：用封閉液稀釋相應(yīng)的一抗，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4 ℃孵育過夜，抗體T-bet 1∶100稀釋、GATA-3 1∶500稀釋、FOXP3 1∶1 000稀釋；二抗：TBST充分洗滌PVDF膜5～6次，5 min/次，用封閉液稀釋HRP標(biāo)記的羊抗小鼠二抗(1∶50 000稀釋)，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，室溫?fù)u床孵育2 h；顯色曝光：TBST充分洗滌PVDF膜5～6次，5 min/次。每張膜滴加適量的ECL化學(xué)發(fā)光底物，孵育數(shù)分鐘，待熒光帶明顯后，用濾紙吸去多余的化學(xué)發(fā)光底物，覆上保鮮膜，X光膠片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影。采用Gel-Pro Analyzer分析處理?xiàng)l帶，計(jì)算灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組腸組織病理改變 對照組腸黏膜完整，腺體排列規(guī)則，無炎性細(xì)胞浸潤；TNBS組腸固有層明顯受損，部分區(qū)域腺體消失，大量炎細(xì)胞浸潤；IL-33組腸黏膜相對完整，腺體排列較為有序，少量炎細(xì)胞浸潤，小面積潰瘍。見插頁Ⅱ圖5。

2.2 各組腸組織上清液IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β水平比較 見表1。

表1 各組腸組織上清液IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與TNBS組比較，#P<0.05，##P<0.01。

2.3 各組腸組織T-bet、GATA-3、FOXP3蛋白表達(dá)比較 見表2。

表2 各組腸組織T-bet、GATA-3、Foxp3蛋白相對表達(dá)量比較±s)

注：與對照組比較，*P<0.05；與TNBS組比較，#P<0.05。

3 討論

CD是一種可發(fā)生于胃腸道任何部位的慢性、反復(fù)發(fā)作的非特異性全腸壁炎，至今尚無特異性的治療手段。目前普遍認(rèn)為，免疫功能異常是CD發(fā)病的主要原因之一，尤其是Th1細(xì)胞的過度活化被認(rèn)為是CD的主要發(fā)病機(jī)制。

IL-33是IL-1家族中的一種新型細(xì)胞因子，其基因定位于人類9號染色體上，編碼含270個(gè)氨基酸的IL-33前體蛋白，分子質(zhì)量約30 kDa，主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等[11]。IL-33的受體是ST2[12]，二者結(jié)合后，對免疫系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)控，如IL-33可誘導(dǎo)IL-4、IL-10、TGF-β等細(xì)胞因子的分泌。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-33可能是一種共刺激因子，既能促Th1型適應(yīng)性免疫應(yīng)答也能促Th2型適應(yīng)性免疫應(yīng)答[13]。目前對IL-33在IBD發(fā)病過程中的作用研究結(jié)論不一。有研究認(rèn)為，IL-33可能在IBD發(fā)病過程中具有雙重作用[14,15]；也有研究認(rèn)為，IL-33對IBD患者可能具有保護(hù)作用[16]。Seidelin等[17]研究發(fā)現(xiàn)，潰瘍性結(jié)腸炎患者腸黏膜組織IL-33 mRNA水平明顯高于正常腸黏膜組織，且其表達(dá)與潰瘍性結(jié)腸炎疾病活動度、活動指數(shù)、內(nèi)鏡下評分明顯相關(guān)。Kobori等[18]研究發(fā)現(xiàn)，活動性潰瘍性結(jié)腸炎患者腸黏膜IL-33 mRNA表達(dá)特異性升高，而非活動性潰瘍性結(jié)腸炎患者和CD患者并未升高。由于該研究對CD患者樣本的采集量較少，其結(jié)果的可信度不大。Duan等[10]研究發(fā)現(xiàn)，IL-33在通過化學(xué)方法誘導(dǎo)出的IBD中具有保護(hù)作用。以上研究說明，IL-33與IBD的發(fā)病有關(guān)。

本研究首先建立了小鼠CD模型，然后用rIL-33、PBS進(jìn)行干預(yù)，處死小鼠，取腸組織行HE染色，發(fā)現(xiàn)TNBS組腸組織炎癥明顯，說明CD模型制備成功。而IL-33組腸組織炎癥明顯較TNBS組輕，說明IL-33能緩解CD的發(fā)病進(jìn)程。本研究還發(fā)現(xiàn)，IL-33組腸組織上清液IFN-γ水平較TNBS組明顯降低，IL-4、IL-10和TGF-β水平明顯高于TNBS組。說明IL-33可抑制Th1分化，促進(jìn)Th2和Treg的分化。大量研究證實(shí)，Th1細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet、Th2細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA-3、Treg細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子FOXP3對其相應(yīng)細(xì)胞的生長和功能具有重要作用[19～22]。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-33組T-bet蛋白相對表達(dá)量明顯低于TNBS組，而GATA-3、FOXP3蛋白相對表達(dá)量明顯高于TNBS組。進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)論。

綜上所述，IL-33能緩解CD小鼠病情，其機(jī)制可能與抑制Th1細(xì)胞分化、誘導(dǎo)Th2和Treg細(xì)胞的產(chǎn)生有關(guān)。

[1] Bouma G, Strober W. The immunological and genetic basis of inflammatory bowel disease[J]. Nat Rev Immunol, 2003,3(7):521-533.

[2] Doganci A, Eigenbrod T, Krug N, et al. The IL-6R alpha chain controls lung CD4+CD25+Treg development and function during allergic airway inflammation in vivo[J]. J Clin Invest, 2005,115(2):313-325.

[3] Warnaar N, Hofker HS, Maathuis MH, et al. Matrix metalloproteinases as profibrotic factors in terminal ileum in Crohn′s disease[J]. Inflamm Bowel Dis, 2006,12(9):863-869.

[4] Schmitz J, Owyang A, Oldham E, et al. IL-33, an interleukin-1-like cytokine that signals via the IL-1 receptor-related protein ST2 and induces T helper type 2-associated cytokines[J]. Immunity, 2005,23(5):479-490.

[5] Hayakawa H, Hayakawa M, Kume A, et al. Soluble ST2 blocks interleukin-33 signaling in allergic airway inflammation[J]. J Biol Chem, 2007,282(36):26369-26380.

[6] Xu D, Jiang HR, Kewin P, et al. IL-33 exacerbates antigen-induced arthritis by activating mast cells[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008,105(31):10913-10918.

[7] Miller AM, Xu D, Asquith DL, et al. IL-33 reduces the development of atherosclerosis[J]. J Exp Med, 2008,205(2):339-346.

[8] Volarevic V, Mitrovic M, Milovanovic M, et al. Protective role of IL-33/ST2 axis in Con A-induced hepatitis[J]. J Hepatol, 2012,56(1):26-33.

[9] Kim SH, Bianco NR, Shufesky WJ, et al. Effective treatment of inflammatory disease models with exosomes derived from dendritic cells genetically modified to express IL-4[J]. J Immunol, 2007,179(4):2242-2249.

[10] Duan L, Chen J, Zhang H, et al. Interleukin-33 ameliorates experimental colitis through promoting Th2/Foxp3(+) regulatory T-cell responses in mice[J]. Mol Med, 2012(18):753-761.

[11] Pastorelli L, De Salvo C, Cominelli MA, et al. Novel cytokine signaling pathways in inflammatory bowel disease: insight into the dichotomous functions of IL-33 during chronic intestinal inflammation[J]. Therap Adv Gastroenterol, 2011,4(5):311-323.

[12] Oboki K, Ohno T, Kajiwara N, et al. IL-33 and IL-33 receptors in host defense and diseases[J]. Allergol Int, 2010,59(2):143-160.

[13] Komai-Koma M, Xu D, Li Y, et al. IL-33 is a chemoattractant for human Th2 cells[J]. Eur J Immunol, 2007,37(10):2779-2786.

[14] Sponheim J, Pollheimer J, Olsen T, et al. Inflammatory bowel disease-associated interleukin-33 is preferentially expressed in ulceration-associated myofibroblasts[J]. Am J Pathol, 2010,177(6):2804-2815.

[15] Bamias G, Corridoni D, Pizarro TT, et al. New insights into the dichotomous role of innate cytokines in gut homeostasis and inflammation[J]. Cytokine, 2012,59(3):451-459.

[16] Grob P, Doser K, Falk W, et al. IL-33 attenuates development and perpetuation of chronic intestinal inflammation[J]. Inflamm Bowel Dis, 2012,18(10):1900-1909.

[17] Seidelin JB, Bjerrum JT, Coskun M, et al. IL-33 is upregulated in colonocytes of ulcerative colitis[J]. Immunol Lett, 2010,128(1):80-85.

[18] Kobori A, Yagi Y, Imaeda H, et al. Interleukin-33 expression is specifically enhanced in inflamed mucosa of ulcerative colitis[J]. J Gastroenterol, 2010,45(10):999-1007.

[19] 孫明芳，吳昌平，蔣敬庭.T-bet和Eomes對細(xì)胞免疫功能的調(diào)控作用[J].現(xiàn)代免疫學(xué)，2015，35(3)：237-240.

[20] 徐勝.轉(zhuǎn)錄因子T-bet在記憶性T細(xì)胞分化中的作用[J].中國腫瘤生物治療雜志，2007，14(7)：556.

[21] 徐萌，范恒.干細(xì)胞治療潰瘍性結(jié)腸炎的研究進(jìn)展[J].世界華人消化雜志，2015，23(2)：214-220.

[22] 曾放，孫華文，劉順，等.IL-17和Foxp3在小鼠克羅恩病模型中的表達(dá)及其意義[J].醫(yī)學(xué)綜述，2016，22(9)：1751-1753.

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81170368)。

孫華文(E-mail： sunhuawen888@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.40.008

R574.4

A

1002-266X(2016)40-0029-03

2015-11-10)