液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定茜草中蘆西丁含量

浦益瓊，丁越，王冰，張若曦，張彤

上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203

液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定茜草中蘆西丁含量

浦益瓊，丁越，王冰，張若曦，張彤

上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203

目的運(yùn)用液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定茜草藥材中蘆西丁的含量。方法采用Agilent 1290HPLC-G6460三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，在ESI-離子模式下選擇離子監(jiān)測(cè)，色譜分離采用Agilent Eclipse Plus C18RRHD色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），以0.1%甲酸-乙腈（70∶30）為流動(dòng)相，柱溫30 ℃，流速0.4 mL/min，進(jìn)樣量2 μL。結(jié)果蘆西丁在0.005 2～2.64 ng范圍內(nèi)呈良好線(xiàn)性關(guān)系（r＝0.999 9），80%、100%、120%濃度水平的加樣回收率為94.80%～100.94%（平均97.17%，RSD＝6.16%），方法重復(fù)性及精密度均良好。結(jié)論本研究建立的方法靈敏、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，適用于茜草中蘆西丁的含量測(cè)定，可用于茜草藥材中該成分的限度檢查。

茜草；蘆西?。灰合嗌V-質(zhì)譜聯(lián)用

茜草為茜草科植物茜草Rubia cordifolia L.的干燥根及根莖，主產(chǎn)于我國(guó)東北、華北、西北和四川及西藏等地，春、秋二季采挖，除去泥沙，干燥。其性寒，味苦，歸肝經(jīng)，常用于吐血、衄血、崩漏、外傷出血、瘀阻經(jīng)閉、關(guān)節(jié)痹痛、跌仆腫痛。茜草的主要成分為蒽醌及其苷類(lèi)化合物，還含有萘醌類(lèi)、萜類(lèi)、己肽類(lèi)、多糖類(lèi)等其他化學(xué)成分，其藥理作用主要包括止血、抗血小板聚集、升白細(xì)胞、鎮(zhèn)咳祛痰、抗菌、抗癌等。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，茜草科Rubiaceae茜草屬Rubia植物廣泛分布于歐洲、亞洲、美洲和南美洲的熱帶及溫帶地區(qū)，全球約有70種，我國(guó)有其中的12種以上[1]。其中，除了被現(xiàn)行《中華人民共和國(guó)藥典》收錄的茜草Rubia cordifolia L.外，另一品種歐茜草R. tinctorum L.亦在我國(guó)可見(jiàn)[2]，分布于新疆及喜馬拉雅地區(qū)，在國(guó)內(nèi)被稱(chēng)為新疆茜草，以根作為茜草收購(gòu)使用。在現(xiàn)代醫(yī)藥應(yīng)用中，歐茜草常被作為通便劑或一種溫和的鎮(zhèn)靜劑，用于治療腎結(jié)石和膀胱結(jié)石，以及月經(jīng)不調(diào)或泌尿系統(tǒng)紊亂等癥[3-7]，是用于治療腎結(jié)石的藥物“消石素”（德國(guó)產(chǎn)）處方中的主藥，但由于歐茜草中含有蘆西丁，有較強(qiáng)的致基因突變、細(xì)胞轉(zhuǎn)化及DNA結(jié)合作用，因此美國(guó)FDA已明確將其列為禁用藥物。

目前，針對(duì)茜草中相關(guān)有害成分的研究報(bào)道較少，2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》一部“茜草”項(xiàng)下的含量測(cè)定中只規(guī)定了大葉茜草素和羥基茜草素的含量測(cè)定方法，未涉及其他物質(zhì)的定量分析內(nèi)容。本研究采用液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS），以蘆西丁作為指標(biāo)成分，對(duì)茜草Rubia cordifolia L.進(jìn)行測(cè)定，探索完善該藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，提高用藥安全性和有效性，提高茜草制劑的質(zhì)量。

1　儀器與試藥

Agilent 1290高效液相色譜儀，Agilent公司；G6460三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，Agilent公司；Eclipse Plus C18RRHD色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），Agilent公司；SK5200H高頻超聲波清洗器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；FA1004N電子天平，上海精宏科學(xué)儀器有限公司。

蘆西丁對(duì)照品（純度≥98%），德國(guó)Phytolab公司；色譜純乙腈，Merck公司；其他試劑均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。15批茜草飲片均購(gòu)于飲片公司，產(chǎn)地分別為陜西、安徽、山西、河南，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心中藥鑒定實(shí)驗(yàn)室鑒定為茜草科植物茜草Rubia cordifolia L.的干燥根和根莖。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性

2.1.1液相色譜條件Agilent Eclipse Plus C18RRHD色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸-乙腈（70∶30），柱溫30 ℃，流速0.4 mL/min，進(jìn)樣量2 μL。

2.1.2質(zhì)譜條件離子源：ESI；MS1/MS2加熱器溫度：100 ℃；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流量：10.0 L/min；霧化氣壓力：40.0 psi；毛細(xì)管電壓：3500 V；監(jiān)測(cè)離子通道：251.1/223.3；駐留時(shí)間：200 ms；Fragmentor電壓：90 V；碰撞能量：15 V；極性：Negative。

2.1.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn)在上述檢測(cè)條件下，蘆西丁對(duì)照品及茜草飲片供試品溶液多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖見(jiàn)圖1、圖2。

2.2線(xiàn)性關(guān)系考察

取濃度為1.32 μg/mL的蘆西丁對(duì)照品溶液作為母液，依次適當(dāng)倍數(shù)稀釋?zhuān)玫?.002 6～1.32 μg/mL一系列對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下檢測(cè)條件，測(cè)定MS的響應(yīng)值（子離子峰面積），結(jié)果顯示，以碎片離子峰（m/z＝251.1）積分面積為縱坐標(biāo)，蘆西丁對(duì)照品的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程Y＝33 236X＋64.344，r＝0.999 9。結(jié)果表明，蘆西丁在0.005 2～2.64 ng范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.3精密度試驗(yàn)

取不同濃度的蘆西丁對(duì)照品溶液3份，其濃度分別為0.165、0.020 63、0.002 58 μg/mL，按“2.1”項(xiàng)下檢測(cè)條件進(jìn)行測(cè)定，分別連續(xù)測(cè)定5次，記錄所得子離子峰的峰面積。結(jié)果顯示，該3個(gè)濃度樣品的峰面積分別為5315.4、678.4、80.8，RSD分別為3.06%、4.45%、4.83%，精密度良好。

圖1　蘆西丁對(duì)照品LC-MS圖

圖2　茜草飲片供試品LC-MS圖

2.4供試品溶液的溶劑選擇

分別取茜草飲片粉末（批號(hào)110903，過(guò)四號(hào)篩）約0.2 g，平行6份，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入80%乙醇10 mL（3份）和甲醇溶液10 mL（3份），密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，放置過(guò)夜后，超聲處理（頻率53 kHz，功率200 W）30 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用80%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液。

按“2.1”項(xiàng)下檢測(cè)條件進(jìn)行測(cè)定，用外標(biāo)法將所得響應(yīng)值與對(duì)照品對(duì)照，計(jì)算藥材粉末中蘆西丁的含量。結(jié)果顯示，以80%乙醇、甲醇為提取溶劑制備的樣品中蘆西丁含量分別為0.004 06%、0.004 60%，RSD分別為2.85%、4.62%，因此選擇甲醇作為超聲溶劑。

2.5重復(fù)性試驗(yàn)

取茜草飲片粉末（批號(hào)110903）約0.2 g，精密稱(chēng)定，以甲醇為溶劑，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下檢測(cè)條件進(jìn)行測(cè)定，平行5份，用外標(biāo)法將所得響應(yīng)值與對(duì)照品對(duì)照，計(jì)算藥材粉末中蘆西丁的含量。結(jié)果顯示，該5份樣品的蘆西丁平均含量為0.004 52%，RSD＝4.18%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.6加樣回收率試驗(yàn)

取茜草飲片粉末（批號(hào)110903）約0.1 g，共9份，精密稱(chēng)定，每份樣品粉末中加入蘆西丁對(duì)照品適量，再按“2.4”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下檢測(cè)條件進(jìn)行測(cè)定，用外標(biāo)法將所得響應(yīng)值與對(duì)照品對(duì)照，分別計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　茜草中蘆西丁加樣回收率試驗(yàn)

2.7檢測(cè)限與定量限

采用信噪比法確定檢測(cè)限與定量限，用LC-MS測(cè)定茜草中蘆西丁時(shí)，定量限為1.73 ng/mL（S/N＝10），檢測(cè)限為0.52 ng/mL（S/N＝3）。

2.8樣品含量測(cè)定

分別取茜草飲片粉末約0.2 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇溶液10 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，放置過(guò)夜，超聲處理30 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下檢測(cè)條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　樣品含量測(cè)定結(jié)果

3　討論

本研究最初嘗試用HPLC-UV法測(cè)定茜草飲片中蘆西丁的含量，結(jié)果顯示，該法的定量限為8 μg/mL，高于實(shí)際藥材供試品溶液中蘆西丁含量，因此無(wú)法作為該成分的定量檢測(cè)手段。此后采用LC-MS法，該法的定量限為1.73 ng/mL，檢測(cè)靈敏度大大提高，經(jīng)方法學(xué)考察確認(rèn)，可作為茜草藥材中蘆西丁含量測(cè)定方法的專(zhuān)屬手段。

不同基原中藥的化學(xué)成分有時(shí)品種差異不大，國(guó)外對(duì)某些藥材品種的有毒成分的研究值得引起藥學(xué)工作者的重視，檢測(cè)毒性成分是否同樣存在于同類(lèi)中藥材中并將其定量，對(duì)于中藥的安全用藥及擴(kuò)大中藥材的應(yīng)用范圍具有重要的指導(dǎo)意義。

[1] 王升啟,馬立人.茜草屬藥用植物的化學(xué)成分及生物活性[J].軍事醫(yī)學(xué),1991(4)：254-259.

[2] 陳四保,馮瑞芝,陳碧珠,等.茜草屬藥用植物的研究Ⅰ.中藥茜草的原植物與國(guó)內(nèi)資源[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),1991,3(4)：7-15.

[3] WESTENDORF J, POGINSKY B, MARQUARDT H, et al. The genotoxicity of lucidin, a natural component of Rubia tinctorum L., and lucidinethylether, a component of ethanolic Rubia extracts[J]. Cell Biol Toxicol,1988,4：225-239.

[4] KAWASAKI Y, GODA Y, YOSHIHIRA K, et al. The mutagenic constituents of Rubia tinctorum[J]. Chem Pharm Bull,1992,40(6)：1504-1509.

[5] YASUI Y, TAKEDA N. Identification of a mutagenic substance in Rubia tinctorum L.(madder) root, as lucidin[J]. Muta Res,1983, 121：185-190.

[6] FRANTISEK M, IVANA K, ALEXANDER J. Mutagenicity of natural anthraquinones from Rubia tinctorum in the drosophila wing spot test[J]. Planta Med,2001,67：127.

[7] WESTENDORF J, PFAU W, SCHULTE A. Carcinogenicity and DNA adduct formation observed in ACI rats after long-term treatment with madder root, Rubia tinctorum L.[J]. Carcinogenesis,1998,19：2163-2168.

Content Determination of Lucidin in Rubiae Radix et Rhizoma by LC-MS

PU Yi-qiong,DING Yue, WANG Bing, ZHANG Ruo-xi, ZHANG Tong
(Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China)

Objective To develop a LC-MS method for the content determination of lucidin in Rubiae Radix et Rhizoma. Methods Agilent 1290 HPLC and G6460 Mass were used for quantification in MRM mode under ESI-. chromatography was performed on a Agilent Eclipse Plus C18RRHD column (2.1 mm × 50 mm, 1.8 μm) at 30 ℃using acetonitrile-0.1% formic acid in water at the flow rate of 0.4 mL/min. The injection volume was 2 μL. Results Good linearity was obtained from concentration of lucidin among the range of 0.005 2–2.64 ng (r= 0.999 9). Recoveries at different concentrations (80%, 100%, 120%) were between 94.80% and 100.94% (AVE=97.17%, RSD=6.16%). Good reproducibility and precision were also achieved. Conclusion The new developed LC-MS method is sensitive, accurate and with good repeatability, which is suitable for the content determination of lucidin in Rubiae Radix et Rhizoma. It can be used in the limit detection of lucidin in Rubiae Radix et Rhizoma.

Rubiae Radix et Rhizoma; lucidin; LC-MS

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.12.023

R284.1

A

1005-5304(2016)12-0096-03

上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)科研計(jì)劃項(xiàng)目（11DZ1971500）；上海市衛(wèi)生局青年科研項(xiàng)目（20124Y002）

張彤，E-mail：zhangtdmj@hotmail.com

（2015-12-28）

（2016-01-20；編輯：陳靜）