納豆芽孢桿菌NT-6固態(tài)發(fā)酵羅非魚(yú)下腳料條件優(yōu)化及產(chǎn)脂肽組分分析

張 寧，孫力軍,*，王雅玲,*，廖建萌，鄧 旗，劉 穎，徐德峰

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088；2.湛江市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 湛江 524000）

納豆芽孢桿菌NT-6固態(tài)發(fā)酵羅非魚(yú)下腳料條件優(yōu)化及產(chǎn)脂肽組分分析

張 寧1，孫力軍1,*，王雅玲1,*，廖建萌2，鄧 旗1，劉 穎1，徐德峰1

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088；2.湛江市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 湛江 524000）

利用納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）NT-6，以羅非魚(yú)下腳料為主要基質(zhì)，進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)抗菌營(yíng)養(yǎng)復(fù)合型活性肽，以提高抗菌脂肽產(chǎn)量為目的，對(duì)培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。在對(duì)產(chǎn)生的脂肽組分進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，采用高效液相色譜-質(zhì)譜定量檢測(cè)法，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵工藝條件。結(jié)果表明：利用羅非魚(yú)下腳料為主要基質(zhì)固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的抗菌脂肽組分主要包括表面活性素（m/z分別為995.20、1 008.20、1 058.20）、伊枯草菌素（m/z分別為1 044.30、1 071.20）。優(yōu)化后的最佳工藝參數(shù)為羅非魚(yú)下腳料與麩皮配比3.48∶1（m/m）、初始基質(zhì)水分含量69.34%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、發(fā)酵時(shí)間61.69 h、發(fā)酵溫度28.97 ℃、甘蔗渣添加量6%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、接種量5 mL/100 g，此條件下抗菌脂肽產(chǎn)量達(dá)7.32 g/kg，實(shí)際驗(yàn)證結(jié)果為7.29 g/kg，相對(duì)于優(yōu)化前提升了7.5 倍，產(chǎn)生的脂肽含有多種脂肽組分。

納豆芽孢桿菌；羅非魚(yú)下腳料；固態(tài)發(fā)酵；響應(yīng)面設(shè)計(jì)；抗菌脂肽；高效液相色譜-質(zhì)譜

羅非魚(yú)（Tilapia）又名非洲鯽魚(yú)，是目前在發(fā)達(dá)和發(fā)展中國(guó)家最普遍養(yǎng)殖的魚(yú)類(lèi)物種之一，已得到消費(fèi)者的普遍認(rèn)可。中國(guó)是迄今為止最大的羅非魚(yú)生產(chǎn)和出口國(guó)。在羅非魚(yú)生產(chǎn)加工過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的下腳料，約占總質(zhì)量的50%[1-2]。在實(shí)際生產(chǎn)中，這些下腳料或被丟棄，或以低價(jià)賣(mài)給了飼料廠作原料，附加值較低[3]。據(jù)報(bào)道每年有超過(guò)50%的魚(yú)類(lèi)副產(chǎn)品作為不可利用的副產(chǎn)品被丟棄，這樣不僅浪費(fèi)資源，處理不當(dāng)還會(huì)引起環(huán)境污染。因此，迫切需要尋找到羅非魚(yú)下腳料的高值化利用途徑，達(dá)到其被充分利用的目的。

納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）是在中國(guó)和日本的傳統(tǒng)發(fā)酵食品細(xì)菌性豆豉和納豆中被發(fā)現(xiàn)并分離出的主要發(fā)酵菌株，也可作為益生菌用于動(dòng)物飼料的微生物添加劑[4]，納豆芽孢桿菌還具有溶血栓、促生長(zhǎng)、改變腸道組織和免疫調(diào)節(jié)等多種保健功能[5-6]。更重要的是，納豆芽孢桿菌用于發(fā)酵時(shí)可以產(chǎn)生多種生物活性肽，尤其以抗菌脂肽為主，主要包括表面活性素（surfactin）、伊枯草菌素（iturin）和芬薺素（fengycin）等[7-8]?？咕淖鳛橐环N天然的防腐劑，具有低毒、易降解、抗癌和抗病毒等許多優(yōu)良特性[9-11]，使其在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品、化妝品、生防控制、石油開(kāi)采和環(huán)境治理等領(lǐng)域顯示出重要的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景，已引起廣泛的關(guān)注[12-15]。

目前，利用納豆芽孢桿菌生產(chǎn)抗菌脂肽多為液態(tài)發(fā)酵，方傳記等[16]利用淀粉液化芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)脂肽類(lèi)抗菌物，Thompson等[17]利用馬鈴薯廢液發(fā)酵生產(chǎn)得到抗菌脂肽。但是抗菌脂肽作為一種表面活性劑，在液態(tài)發(fā)酵情況下極易產(chǎn)生泡沫，造成“跑液”，進(jìn)而影響抗菌脂肽的產(chǎn)量和產(chǎn)率。近年來(lái)，固態(tài)發(fā)酵因其工藝簡(jiǎn)單、低成本和高產(chǎn)量等優(yōu)點(diǎn)，已逐漸在抗菌脂肽的發(fā)酵生產(chǎn)中得到重視。如豆粕、稻草[18]和啤酒糟[19]等已被用作生產(chǎn)抗菌脂肽的發(fā)酵基質(zhì)。但是，鮮見(jiàn)利用羅非魚(yú)下腳料作為脂肽生產(chǎn)的主要發(fā)酵基質(zhì)的報(bào)道。與其他水產(chǎn)品下腳料相比，羅非魚(yú)下腳料含有較高的蛋白質(zhì)、氨基酸和各種活性礦物質(zhì)[3,20]，可以作為菌體生長(zhǎng)代謝的良好基質(zhì)，同時(shí)微生物代謝過(guò)程中所產(chǎn)內(nèi)源酶可促進(jìn)下腳料中蛋白質(zhì)酶解生成小肽。小肽既具有很好的動(dòng)物促生長(zhǎng)能力，又能較大幅度提高動(dòng)物的防病抗病能力，且能改善產(chǎn)品品質(zhì)、提高經(jīng)濟(jì)效益[21]。若能將抗菌脂肽發(fā)酵生產(chǎn)和營(yíng)養(yǎng)小肽的酶解工藝相結(jié)合，不僅可以得到高濃度的抗菌肽產(chǎn)品，還可以解決營(yíng)養(yǎng)小肽生產(chǎn)中蛋白質(zhì)酶解所需的生物酶源問(wèn)題，生產(chǎn)出的產(chǎn)品既具有抗菌肽的功能，又具有營(yíng)養(yǎng)寡肽的效果，還可以簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝，顯著地降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品功效。

本實(shí)驗(yàn)擬以羅非魚(yú)下腳料為主要基質(zhì)，利用研究團(tuán)隊(duì)前期分離得到的一株抗菌脂肽高產(chǎn)菌株納豆芽孢桿菌NT-6[22]進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)抗菌脂肽和營(yíng)養(yǎng)小肽，在對(duì)產(chǎn)生的脂肽組分進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，采用前期研究建立的抗菌脂肽高效液相色譜-質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）[23]定量檢測(cè)產(chǎn)物中脂肽的產(chǎn)量，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)對(duì)抗菌脂肽的發(fā)酵基質(zhì)和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在優(yōu)化抗菌脂肽生產(chǎn)工藝條件，為富含抗菌脂肽和營(yíng)養(yǎng)小肽的復(fù)合功能飼用活性肽生產(chǎn)工藝條件的建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

納豆芽孢桿菌NT-6，分離于中國(guó)傳統(tǒng)食品細(xì)菌性豆豉，廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院水產(chǎn)品食源性病原微生物及毒素綠色控制研究室保存。

1.2 材料與試劑

羅非魚(yú)下角料（生產(chǎn)加工羅非魚(yú)片過(guò)程中剩下的部分去掉內(nèi)臟，主要成分為水分、蛋白質(zhì)和少量脂肪、灰分） 廣東省湛江市恒興科技水產(chǎn)有限公司；麩皮湛江某面粉廠；甘蔗渣 湛江某制糖廠。

Surfactin、Iturin標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司；乙腈（色譜純）、無(wú)水甲醇、超純水、甲酸、NaOH、HCl（均為分析純） 齊云生物技術(shù)有限公司。

BPY培養(yǎng)基，無(wú)機(jī)鹽溶液（谷氨酸鈉5.00 g、KCl 1.00 g、MgSO4·7H2O 1.92 g、葡萄糖10.00 g、K2HPO4·3H2O 1.96 g、MnSO45.00×10－3g、CuSO41.60×10－4g、FeSO41.50×10－4g、蒸餾水1 000 mL）。

1.3 儀器與設(shè)備

TSQ Quantum Access HPLC-MS/MS聯(lián)用儀 美國(guó)Thermo公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海云泰儀器儀表有限公司；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱、GZX-9240MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.4 方法

1.4.1 菌株活化及種子液制備

取甘油保藏的納豆芽孢桿菌NT-6，用接種環(huán)挑取一環(huán)進(jìn)行平板劃線(xiàn)，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，挑取平板上的單菌落至營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，靜置培養(yǎng)24 h。挑取斜面上的納豆芽孢桿菌NT-6菌株接種于BPY液體培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h得到種子液。

1.4.2 發(fā)酵產(chǎn)物的制備

將發(fā)酵基質(zhì)（羅非魚(yú)下腳料、麩皮和甘蔗渣）混勻，裝入250 mL錐形瓶，再加入一定體積配制好的無(wú)機(jī)鹽溶液，121 ℃高壓滅菌20 min，冷卻至室溫。接入一定體積的納豆芽孢桿菌NT-6種子液，置于生化培養(yǎng)箱中30 ℃發(fā)酵，期間每6 h攪拌一次。發(fā)酵完成后，將產(chǎn)物于恒溫鼓風(fēng)干燥箱中60 ℃烘干、粉碎。

1.4.3 抗菌脂肽的提取及檢測(cè)

準(zhǔn)確稱(chēng)取一定質(zhì)量的發(fā)酵產(chǎn)物，加入一定體積的無(wú)水甲醇（1∶5，m/V）浸提12 h。后將提取液10 000 r/min離心15 min，取上清液，過(guò)濾除去不溶物，所得液體即為抗菌脂肽提取液。采用HPLC-MS法[23]檢測(cè)產(chǎn)物中抗菌脂肽的含量。HPLC條件：色譜柱為氰柱Venusil XBP CN（100 mm×2.1 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A），5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）（B）；洗脫速率：300 μL/min；洗脫過(guò)程：0～4 min，40% A和60% B；4～7 min，90% A和10% B；7～12 min，40% A和60% B。質(zhì)譜條件：在ESI正離子模式下，采用選擇性離子掃描SIR模式，噴霧電壓4.5 kV；鞘氣壓力40 arb；輔助氣壓力15 au；毛細(xì)管溫度270 ℃，碰撞壓0.2 Pa。

1.4.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.4.1 羅非魚(yú)下腳料與麩皮的配比對(duì)抗菌脂肽產(chǎn)量的影響

添加甘蔗渣6%，接種量5.0 mL/100 g，初始基質(zhì)含水量70%，初始pH 7.0，羅非魚(yú)下腳料與麩皮的配比分別設(shè)為50∶0、45∶5、40∶10、35∶15、30∶20、25∶25（m/m），總質(zhì)量50 g（以下單因素試驗(yàn)同），30℃條件下發(fā)酵60 h，測(cè)定抗菌肽產(chǎn)量。

1.4.4.2 甘蔗渣添加量對(duì)抗菌脂肽產(chǎn)量的影響

分別添加甘蔗渣0、1、2、3、4、5 g（分別為下腳料與麩皮總質(zhì)量的0、2%、4%、6%、8%、10%），接種量5.0 mL/100 g，羅非魚(yú)與下腳料的配比40∶10（m/m），初始基質(zhì)含水量70%，初始pH 7.0，30℃條件下發(fā)酵60 h，測(cè)定抗菌肽產(chǎn)量。

1.4.4.3 初始基質(zhì)水分含量對(duì)抗菌脂肽產(chǎn)量的影響

添加甘蔗渣6%，接種量5.0 mL/100 g，初始基質(zhì)水分含量分別設(shè)為55%、60%、65%、70%、75%、80%，初始pH 7.0，羅非魚(yú)與下腳料的配比40∶10，30 ℃條件下發(fā)酵60 h，測(cè)定抗菌肽產(chǎn)量。

1.4.4.4 初始pH值對(duì)抗菌脂肽產(chǎn)量的影響

添加甘蔗渣6%，接種量5.0 mL/100 g，初始基質(zhì)水分含量為70%，初始pH值分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，羅非魚(yú)與下腳料的配比40∶10，30℃條件下發(fā)酵60 h，測(cè)定抗菌肽產(chǎn)量。

1.4.4.5 接種量對(duì)抗菌脂肽產(chǎn)量的影響

添加甘蔗渣6%，接種量分別為2.5、5.0、7.5、 10.0、12.5、15.0 mL/100 g，初始基質(zhì)水分含量為70%，初始pH 7.0，羅非魚(yú)與下腳料的配比40∶10，30℃條件下發(fā)酵60 h，測(cè)定抗菌肽產(chǎn)量。

1.4.4.6 發(fā)酵溫度對(duì)抗菌脂肽產(chǎn)量的影響

添加甘蔗渣6%，接種量5.0 mL/100 g，初始基質(zhì)水分含量為70%，初始pH 7.0，羅非魚(yú)與下腳料的配比40∶10，分別在27、30、33、36、39 ℃條件下發(fā)酵60 h，測(cè)定抗菌肽產(chǎn)量。

1.4.4.7 發(fā)酵時(shí)間對(duì)抗菌脂肽產(chǎn)量的影響

添加甘蔗渣6%，接種量5.0 mL/100 g，初始基質(zhì)水分含量為70%，初始pH 7.0，羅非魚(yú)與下腳料的配比40∶10，30℃條件下發(fā)酵12、24、36、48、60、72 h，測(cè)定抗菌肽產(chǎn)量。

1.4.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用SPSS 19.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，選取對(duì)脂肽產(chǎn)量影響顯著的因素（羅非魚(yú)與下腳料的配比、發(fā)酵時(shí)間、初始基質(zhì)含水量、發(fā)酵溫度）為考察因素，以抗菌脂肽的產(chǎn)量為考察指標(biāo)，采用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行四因素三水平的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共29 組試驗(yàn)，每組試驗(yàn)3 個(gè)平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌脂肽組分的鑒定

圖1 產(chǎn)物抗菌脂肽提取物的陽(yáng)離子流圖Fig. 1 Positive ion current chromatogram of HPLC-MS for antimicrobial lipopeptide extract

由圖1可知，在此固態(tài)發(fā)酵工藝條件下所產(chǎn)的抗菌脂肽產(chǎn)物主要包含7 種物質(zhì)，其[M+H]+離子峰值分別為995.20、1 008.20、1 058.20、1 044.30、1 071.20、1 493.00。其中1 044.30出現(xiàn)2 個(gè)離子峰，推測(cè)為2 個(gè)同分異構(gòu)體。對(duì)比相關(guān)抗菌脂肽的研究報(bào)道[24-25]可知，此發(fā)酵產(chǎn)物中的抗菌脂肽主要分為Surfactin（m/z 995.20、1 008.20、1 058.20）和Iturin（m/z 1 044.30、1 071.20）兩類(lèi)，另外還有很少量的Fengycin（m/z 1 493.00）。本實(shí)驗(yàn)主要研究發(fā)酵條件對(duì)Surfactin和Iturin總含量的影響。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 羅非魚(yú)下腳料與麩皮的配比對(duì)抗菌脂肽產(chǎn)量的影響細(xì)菌的生長(zhǎng)代謝非常容易受到培養(yǎng)基質(zhì)及外界環(huán)境的影響，尤其是發(fā)酵基質(zhì)，其組成決定了其中各營(yíng)養(yǎng)組分，很大程度上會(huì)影響到微生物的生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物的生成[26]。由圖2可知，隨著下腳料與麩皮的配比中下腳料的含量不斷減少，麩皮量不斷增多，抗菌脂肽的產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，并在配比為40∶10（m/m）的時(shí)候達(dá)到最大，產(chǎn)量為3.33 g/kg。羅非魚(yú)下角料富含蛋白質(zhì)，且濕度和黏度較大，而麩皮呈干燥顆粒狀態(tài)，二者配比的變化直接影響納豆芽孢桿菌代謝產(chǎn)物的生成，最終導(dǎo)致抗菌脂肽產(chǎn)量的不同。

圖2 羅非魚(yú)下腳料與麩皮的配比對(duì)抗菌脂肽產(chǎn)量的影響Fig. 2 Effect of ratio of tilapia processing byproducts to bran on the yield of antimicrobial lipopeptides

2.2.2 甘蔗渣添加量對(duì)抗菌脂肽產(chǎn)量的影響

圖3 甘蔗渣添加量對(duì)抗菌脂肽產(chǎn)量的影響Fig. 3 Effect of the amount of sugarcane bagasse on the yield of antimicrobial lipopeptides

在本實(shí)驗(yàn)的固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，甘蔗渣是作為一種通氣的基質(zhì)，有助于菌株的呼吸。由圖3可知，隨著甘蔗渣添加量的增加，抗菌脂肽的產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，但是總的來(lái)說(shuō)變化幅度不大，當(dāng)甘蔗渣添加量為6%時(shí)產(chǎn)量達(dá)最大，為3.29 g/kg。

2.2.3 初始基質(zhì)水分含量對(duì)抗菌脂肽產(chǎn)量的影響

圖4 初始基質(zhì)水分含量對(duì)抗菌脂肽產(chǎn)量的影響Fig. 4 Effect of initial substrate moisture content on the yield of antimicrobial lipopeptides

水分是微生物生長(zhǎng)的必需條件，微生物的生長(zhǎng)代謝很大程度上受到水分含量的影響，因此，非常有必要探究初始基質(zhì)水分含量對(duì)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)抗菌脂肽的影響。由圖4可知，隨著初始基質(zhì)水分含量的升高，抗菌脂肽的產(chǎn)量先增加后降低，在含水量為70%時(shí)，抗菌脂肽的產(chǎn)量達(dá)到最高，為4.22 g/kg。此后，隨著水分含量的增加，抗菌脂肽產(chǎn)量不斷下降。固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，水分含量過(guò)高，不利于菌株的呼吸生長(zhǎng)，進(jìn)而影響其代謝產(chǎn)物的生成。

2.2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)抗菌脂肽產(chǎn)量的影響

圖5發(fā)酵時(shí)間對(duì)抗菌脂肽產(chǎn)量的影響Fig. 5 Effect of fermentation time on the yield of antimicrobial lipopeptides

圖5 表明，隨著發(fā)酵的不斷進(jìn)行，即時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，抗菌脂肽的產(chǎn)量不斷升高，發(fā)酵到60 h時(shí)，抗菌脂肽的產(chǎn)量達(dá)到3.85 g/kg，之后再延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，抗菌脂肽產(chǎn)量差異不顯著（P＞0.05）。

2.2.5 接種量對(duì)抗菌脂肽產(chǎn)量的影響

圖6 接種量對(duì)抗菌脂肽產(chǎn)量的影響Fig. 6 Effect of inoculums volume on the yield of antimicrobial lipopeptides

由圖6可以看出，接種量為5 mL/100 g時(shí)，抗菌脂肽的產(chǎn)量最高，為4.06 g/kg。之后隨著菌種接種量的增加，抗菌脂肽的產(chǎn)量反而下降，即抗菌脂肽的產(chǎn)量與菌種的接種量并不成正比關(guān)系。分析原因可能是因?yàn)榫N濃度太大，會(huì)消耗到營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，影響到細(xì)菌代謝產(chǎn)物的生成。

2.2.6 發(fā)酵溫度對(duì)抗菌脂肽產(chǎn)量的影響

溫度也是影響芽孢桿菌生長(zhǎng)代謝產(chǎn)脂肽的重要因素[27]，由圖7可知，發(fā)酵產(chǎn)物中抗菌脂肽的產(chǎn)量在30 ℃時(shí)達(dá)到最高，為4.23 g/kg。之后隨著溫度的升高，抗菌脂肽產(chǎn)量呈不斷下降的趨勢(shì)。表明30 ℃條件下，菌株生長(zhǎng)代謝旺盛，脂肽產(chǎn)量高，超過(guò)此溫度范圍，菌株的生長(zhǎng)代謝能力降低，脂肽產(chǎn)量也隨之下降。

圖7 發(fā)酵溫度對(duì)抗菌脂肽產(chǎn)量的影響Fig. 7 Effect of fermentation temperature on the yield of antimicrobial lipopeptides

2.2.7 初始pH值對(duì)抗菌脂肽產(chǎn)量的影響

圖8 初始pH值對(duì)抗菌脂肽產(chǎn)量的影響Fig. 8 Effect of initial pH on the yield of antimicrobial lipopeptides

由圖8可知，抗菌脂肽的產(chǎn)量在pH 7.5時(shí)達(dá)到最大，為4.54 g/kg。在pH 5.5～7.5區(qū)間范圍內(nèi)，隨pH值的增大，抗菌脂肽的產(chǎn)量不斷升高，之后pH值再升高，脂肽產(chǎn)量下降，過(guò)高或過(guò)低的pH值都不利于脂肽的生成。

2.3 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)抗菌脂肽工藝參數(shù)優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

通過(guò)Design-Expert軟件的Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)，利用HPLC-MS法測(cè)定各試驗(yàn)組產(chǎn)物中抗菌脂肽的含量。設(shè)計(jì)的試驗(yàn)組合和測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 1 Response surface experimental design with experimental and predictive yield of antimicrobial lipopeptides

續(xù)表1

2.3.2 回歸模型的建立和方差分析

對(duì)響應(yīng)面結(jié)果用Design-Expert 8.0.5軟件的Box-Behnken進(jìn)行多元回歸分析，得到抗菌脂肽產(chǎn)量的預(yù)測(cè)值（Y）對(duì)編碼自變量羅非魚(yú)下腳料與麩皮的配比（x1）、發(fā)酵時(shí)間（x2）、初始基質(zhì)含水量（x3）、發(fā)酵溫度（x4）的二次多項(xiàng)回歸方程，剔除掉非顯著項(xiàng)后模型方程為Y＝7.02-0.68x1+0.40x2-0.90x4+0.50x1x4+ 0.25x3x4-1.66x12-1.46x22-1.50x32-1.30x42。對(duì)上述二次多項(xiàng)回歸方程進(jìn)行多因素方差分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 抗菌脂肽產(chǎn)量回歸模型方差分析Table 2 Analysis of variance (ANOVA) for regression?equation for predicting the yield of antimicrobial lipopeptides

由模型的方差分析結(jié)果（表2）可以看出，回歸模型的P＜0.000 1，失擬項(xiàng)的P＝0.603 3＞0.05，此二次多項(xiàng)模型具有極好的顯著性，失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾很小；且模型的相關(guān)系數(shù)R2＝0.987 4，校正系數(shù)R2Adj＝0.972 6；說(shuō)明該模型與實(shí)際情況擬合良好，能較好反映抗菌脂肽的產(chǎn)量與羅非魚(yú)下腳料與麩皮的配比、發(fā)酵時(shí)間、初始基質(zhì)水含量和發(fā)酵溫度之間的關(guān)系，因此該模型可用來(lái)分析和預(yù)測(cè)利用納豆芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)抗菌脂肽的工藝條件。由表2的F值大小可知，4 個(gè)因素對(duì)抗菌脂肽產(chǎn)量影響的顯著性順序?yàn)椋喊l(fā)酵溫度＞羅非魚(yú)下腳料與麩皮的配比＞發(fā)酵時(shí)間＞初始基質(zhì)含水量。

回歸方程中的一次項(xiàng)x1、x2和x4的P值均小于0.000 1，影響極顯著，x3的P值大于0.05，影響不顯著；交互項(xiàng)x1x4極顯著，x3x4顯著，其他交互項(xiàng)均不顯著，二次項(xiàng)x12、x22、x32和x42均處于極顯著水平。

2.3.3 兩因素交互作用對(duì)抗菌脂肽產(chǎn)量的影響

圖9 兩因素交互作用對(duì)抗菌脂肽產(chǎn)量影響的響應(yīng)面圖Fig. 9 Response surface plots for the effect of interaction among four factors on the yield of antimicrobial lipopeptides

響應(yīng)面圖是響應(yīng)值在各試驗(yàn)因素交互作用下得到的結(jié)果構(gòu)成的一個(gè)三維空間曲面圖。曲面越陡峭，則表明因素間的交互作用越顯著，反之則不顯著。由圖9可知，羅非魚(yú)下腳料與麩皮配比和發(fā)酵溫度的交互作用極顯著，初始基質(zhì)含水量和發(fā)酵溫度交互作用顯著，羅非魚(yú)下腳料與麩皮配比和發(fā)酵時(shí)間、羅非魚(yú)下腳料與麩皮配比和初始基質(zhì)含水量、發(fā)酵時(shí)間和初始基質(zhì)含水量、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度交互作用不顯著。

2.3.4 最佳工藝參數(shù)的確定及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由Design-Expert 8.0.5軟件計(jì)算得到的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)抗菌脂肽的最佳工藝條件為：羅非魚(yú)下腳料與麩皮配比3.48∶1（m/m）、發(fā)酵時(shí)間61.69 h、初始基質(zhì)水分含量69.34%、發(fā)酵溫度28.97 ℃，抗菌脂肽產(chǎn)量為7.32 g/kg。在實(shí)驗(yàn)條件下，為了便于操作，采用下腳料與麩皮配比3.5∶1（m/m）、發(fā)酵時(shí)間62 h、初始基質(zhì)含水量70%、發(fā)酵溫度29 ℃進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，經(jīng)檢測(cè)抗菌脂肽產(chǎn)量為7.29 g/kg，相對(duì)于預(yù)測(cè)值誤差為0.37%，差異不顯著，說(shuō)明利用響應(yīng)面法優(yōu)化出的發(fā)酵工藝參數(shù)可靠，可用于實(shí)際生產(chǎn)。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)利用羅非魚(yú)下腳料做發(fā)酵基質(zhì)，固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)抗菌脂肽，此種發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單、成本低，不僅有效地拓寬了納豆芽孢桿菌的應(yīng)用范圍，更重要的是提高了加工副產(chǎn)物羅非魚(yú)下腳料的利用率，實(shí)現(xiàn)了原料的“零浪費(fèi)”。通過(guò)優(yōu)化工藝提高產(chǎn)物中抗菌脂肽的產(chǎn)量，實(shí)現(xiàn)抗菌脂肽這一抗生素的良好替代品的產(chǎn)量最大化，為抗菌脂肽的工業(yè)化生產(chǎn)提供了很好的參考。另外，由于目前抗菌脂肽的檢測(cè)方法主要采用傳統(tǒng)的稱(chēng)質(zhì)量法、抑菌圈法、界面張力測(cè)定法及HPLC法[23,28]，這些檢測(cè)方法只能對(duì)抗菌脂肽進(jìn)行粗略的初步分析和簡(jiǎn)單量化，使得脂肽發(fā)酵工藝條件優(yōu)化研究受到了很大限制。本研究采用了前期建立的HPLC-MS定量法檢測(cè)產(chǎn)物中抗菌脂肽。該方法不僅靈敏度高、檢出限低，而且回收率高，重復(fù)性好。利用此法對(duì)發(fā)酵過(guò)程的參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，取得了較好的優(yōu)化效果，為利用羅非魚(yú)下腳料生產(chǎn)抗菌脂肽提供了理論參考。

抗菌脂肽一般是由多種脂肽物質(zhì)組成的混合物，不同的組分各自具有獨(dú)特的化學(xué)性質(zhì)和生物活性[29]，從而造成抗菌脂肽功能活性的不同。即脂肽內(nèi)各組分含量的不同會(huì)很大程度上影響到抗菌脂肽的生物功能。本實(shí)驗(yàn)只是研究了抗菌脂肽總量的變化，并沒(méi)有明確探究在不同的發(fā)酵條件下脂肽內(nèi)各組分及其同系物含量的具體變化。另外，本研究是以抗菌脂肽為目標(biāo)產(chǎn)物對(duì)生產(chǎn)工藝進(jìn)行的優(yōu)化，而對(duì)發(fā)酵過(guò)程中微生物所產(chǎn)生的內(nèi)源酶及下腳料中蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)小肽的情況并未涉及，如何將抗菌脂肽和營(yíng)養(yǎng)小肽的生產(chǎn)有機(jī)結(jié)合起來(lái)，并使生產(chǎn)效率最大化，仍需要進(jìn)行深入研究。

4 結(jié) 論

利用羅非魚(yú)下腳料為主要基質(zhì)固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的抗菌脂肽組分主要包括Surfactin（m/z 995.20、1 008.20、1 058.20）和Iturin（m/z 1 044.30、1 071.20）。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對(duì)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)抗菌脂肽的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得到最佳的發(fā)酵工藝條件是羅非魚(yú)下腳料與麩皮配比3.48∶1（m/m）、發(fā)酵時(shí)間61.69 h、初始基質(zhì)水分含量69.34%、發(fā)酵溫度28.97 ℃。在最佳條件下經(jīng)過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)抗菌脂肽的產(chǎn)量達(dá)7.29 g/kg，結(jié)果與理論預(yù)測(cè)值（7.32 g/kg）偏差很小，說(shuō)明由此響應(yīng)面設(shè)計(jì)得到的相關(guān)參數(shù)有效可用。本研究為利用羅非魚(yú)下腳料生產(chǎn)富含抗菌脂肽和營(yíng)養(yǎng)小肽的復(fù)合功能活性肽生產(chǎn)工藝條件的建立提供了參考。

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Component Analysis of Antimicrobial Lipopeptides from Solid-State Fermentation of Tilapia Processing Byproducts with Bacillus natto NT-6 and Optimization of Fermentation Conditions

ZHANG Ning1, SUN Lijun1,*, WANG Yaling1,*, LIAO Jianmeng2, DENG Qi1, LIU Ying1, XU Defeng1
(1. Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety, College of Food Science and Technology, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China; 2. Zhanjiang Food and Drug Institute, Zhanjiang 524000, China)

In this study, tilapia processing byproducts were used as the major substrate for solid-state fermentation to produce composite active peptides with antimicrobial and nutritional properties. In order to improve the yield of antimicrobial lipopeptides, the medium and fermentation conditions were optimized. The lipopeptide components generated were analyzed and quantitated by a high performance liquid chromatography-mass spectrometry method. The optimization was performed by applying one-factor-at-a-time method and response surface methodology. The results showed that the main antimicrobial lipopeptides produced were surfactin (m/z 995.20, 1 008.20 and 1 058.20, respectively) and iturin (m/z 1 044.30 and 1 071.20, respectively). Under the optimized conditions: tilapia processing byproducts to wheat bran ratio of 3.48:1 (m/m), initial moisture content of 69.34%, fermentation time of 61.69 h, fermentation temperature of 28.97 ℃, amount of sugarcane bagasse of 6% and inoculum volume of 5 mL/100 g, the yield of antimicrobial lipopeptides reached up to 7.32 g/kg (the actual yield was 7.29 g/kg), which increased 8.5 folds compared with that before optimization. The product obtained was found to consist of a mixture of lipopeptides.

Bacillus natto NT-6; tilapia processing byproducts; solid-state fermentation; response surface methodology; antimicrobial lipopeptides; high performance liquid chromatography-mass spectrometry

10.7506/spkx1002-6630-201621025

TS254.9

A

1002-6630（2016）21-0144-07

張寧, 孫力軍, 王雅玲, 等. 納豆芽孢桿菌NT-6固態(tài)發(fā)酵羅非魚(yú)下腳料條件優(yōu)化及產(chǎn)脂肽組分分析[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(21): 144-150. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621025. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Ning, SUN Lijun, WANG Yaling, et al. Component analysis of antimicrobial lipopeptides from solid-state fermentation of tilapia processing byproducts with Bacillus natto NT-6 and optimization of fermentation conditions[J]. Food Science, 2016, 37(21): 144-150. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621025. http://www.spkx.net.cn

2016-01-10

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31371746；31371777）；廣東省科技廳公益研究與能力建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目（2014B020204005；2014B020205006）；廣東省高等學(xué)校創(chuàng)新強(qiáng)校工程計(jì)劃項(xiàng)目（GDOU2013050312；GDOU2013050205；GDOU 20014050203）

張寧（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品質(zhì)量與安全。E-mail：zhangning_2013@sina.com

*通信作者：孫力軍（1965—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品質(zhì)量與安全。E-mail：suncamt@126.com

王雅玲（1965—），女，教授，博士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品質(zhì)量與安全。E-mail：wangylchina@163.com