固相萃取-超高效液相色譜法測定黃酒中的有機酸

王琳，陳雙，徐巖

(江南大學，食品科學與技術國家重點實驗室，工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，生物工程學院釀酒微生物與酶技術研究室，江蘇 無錫，214122)

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固相萃取-超高效液相色譜法測定黃酒中的有機酸

王琳，陳雙，徐巖*

(江南大學，食品科學與技術國家重點實驗室，工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，生物工程學院釀酒微生物與酶技術研究室，江蘇 無錫，214122)

確定了氨基酸/多肽和色素是黃酒有機酸色譜分析的主要干擾因素，篩選了對干擾因素有較強去除能力的固相萃取(SPE)小柱。建立了固相萃取-超高效液相色譜法(SPE-UPLC)快速測定黃酒中7種主要有機酸的方法。黃酒樣品采用流動相稀釋，經活化后的SCX-SPE小柱凈化處理，并使用ACQUITY UPLC HSS T3柱對黃酒中的7種主要有機酸進行分離檢測。流動相為20 mmol/L NaH2PO4(pH 2.7)，流速為0.25 mL/min，檢測波長為210 nm。結果表明，該方法可在5 min內實現(xiàn)7種有機酸的完全分離，各有機酸在0.100～37 456.000 mg/L范圍內線性相關性良好，回歸方程的線性相關系數(shù)均在0.999 3以上，7種有機酸的加標回收率為94.96%～105.08%，相對標準偏差(RSD)為0.43%～1.79%(n=5)。該方法具有凈化步驟簡單，準確性高的特點。采用該檢測方法對傳統(tǒng)型黃酒(n=12)和清爽型黃酒(n=6)有機酸含量比較發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)型黃酒總酸含量顯著(P<0.05)高于清爽型黃酒，且這種差異是由于酒石酸、蘋果酸和乳酸含量的顯著差異(P<0.05)造成的。

超高效液相；固相萃?。挥袡C酸；傳統(tǒng)型黃酒；清爽型黃酒

黃酒是我國民族特色酒精飲料，具有酒度低、營養(yǎng)豐富、風味獨特的特點，深受我國人民的喜愛，是國家政策重點扶持的傳統(tǒng)產業(yè)。黃酒按照釀造工藝不同可以分為傳統(tǒng)型、清爽型和特型3種，其中以傳統(tǒng)型和清爽型黃酒為主。不同類型黃酒感官特征具有鮮明的差異，傳統(tǒng)型黃酒以口味厚重為特色，而清爽型黃酒則具有口味淡雅柔和的特點[1-2]，但是構成不同類型黃酒風味差異的物質基礎還不清晰。

“無酸不成味”，有機酸是黃酒中含有的一類重要呈味物質，其種類和含量對黃酒的風味品質具有決定性的影響[3]。黃酒中有機酸含量過低容易造成黃酒酒味寡淡、單調、短口，而含量過高則顯得味酸、刺舌、粗糙[4-5]，同時黃酒中的有機酸在平衡黃酒口味和香氣[6]方面也具有重要作用。黃酒中的有機酸主要有乳酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸、酒石酸等，不同有機酸感官特征不同，其含量比例的差異對黃酒風味品質也會造成較大的影響[7]。但目前關于傳統(tǒng)型和清爽型黃酒中有機酸含量特征的研究還缺乏相關報道。

黃酒中有機酸的分析方法主要有紅外光譜法[8]、分光光度法[9]、CE[10]、GC/GC-MS[11-12]、RP-HPLC[13]、離子排斥色譜技術[14]等。其中，RP-HPLC法因靈敏度較高、重復性好、操作簡便而被廣泛使用。但是基于HPLC法進行有機酸分析遇到的最常見的問題就是樣品中其他雜質的干擾[15]。黃酒作為一種發(fā)酵酒，其化學成分十分復雜，除水、乙醇外，還含有大量的氨基酸/多肽[16-17]、色素[18]及糖類等組分，均可能對有機酸的色譜分離產生影響。任一平等人首先嘗試采用C18小柱對黃酒樣品進行凈化處理實現(xiàn)了乳酸、乙酸和琥珀酸的準確定量[19]；畢麗君等人采用C18小柱對色酒進行色素去除處理，進而實現(xiàn)了7種有機酸的準確定量[20]。但目前對影響黃酒有機酸色譜分離的主要干擾因素還缺乏系統(tǒng)研究，這也限制了黃酒凈化處理方法的開發(fā)。

本文首先分析了黃酒檢測中影響有機酸色譜分離分析的主要干擾因素，進而通過不同類型固相萃取柱凈化效果的比較選擇最佳的凈化處理方法，最后建立了一種基于固相萃取一步凈化與UPLC技術相結合的快速檢測黃酒中有機酸含量的方法。進一步采用該方法比較分析了傳統(tǒng)型黃酒和清爽型黃酒有機酸含量特征及差異。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸標準品(美國sigma公司)；氨基酸混合物[參照黃酒中主要氨基酸的大致比例天冬氨酸∶谷氨酸∶絲氨酸∶甘氨酸∶精氨酸∶丙氨酸∶纈氨酸∶苯丙氨酸∶異亮氨酸∶亮氨酸∶脯氨酸=2.5∶6∶1∶1∶2∶2∶2∶1∶1∶1.5∶2，(美國sigma公司)]；多肽混合物[TRYPTONE，(英國OXOID公司)]；焦糖色素(古越龍山有限公司提供)；NaH2PO4(美國sigma公司)；甲醇(美國sigma公司)；葡萄糖(國藥集團化學試劑有限公司)。SPE小柱型號及規(guī)格：PRS(丙磺酸；500 mg，3 mL)、SCX(強陽離子；500 mg，3 mL)、MCX(混合型陽離子；500 mg，3 mL)、WCX(弱陽離子；500 mg，3 mL)、C8-SCX(500 mg，3 mL)、Si(硅膠；500 mg，3 mL)、HC-C18(500 mg，3 mL)、Coconut(椰子殼活性炭；500 mg，3 mL)、Celite545(硅藻土；4 g，10 mL)、Alumina-B(堿性氧化鋁；500 mg，3 mL)(上海安譜科學儀器有限公司)。不同品牌傳統(tǒng)型與清爽型黃酒樣品信息，見表1。

表1 傳統(tǒng)型與清爽型黃酒樣品信息

1.2 主要儀器與設備

Acquity型超高效液相色譜儀及2966型光電二級管陣列檢測器(美國Waters公司)；Milli-Q超純水系列(美國密理博公司)；Visipreep DL型固相萃取裝置(美國Supelco公司)。

1.3 色譜條件

參照文獻[21]通過優(yōu)化確定色譜條件。色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3(i.d 2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流動相：20 mmol/L NaH2PO4溶液(pH 2.7)；檢測波長：210 nm，柱溫：30 ℃，流速：0.25 mL/min，進樣1 μL。

以此色譜條件將有機酸標準品和樣品色譜圖進行對照，根據保留時間確定樣品中各組分的色譜峰[22]。

1.4 實驗方法

1.4.1 黃酒中有機酸檢測干擾因素分析

本研究通過分析不同類型雜質添加對有機酸標準溶液回收率影響確定黃酒中干擾有機酸分離檢測的主要雜質類型，設計實驗方案如下：

方案1：直接分析不經處理黃酒中有機酸的加標回收率情況。向成品黃酒(13#半干型黃酒，以下涉及成品黃酒有機酸回收率所用黃酒樣品均為13#)中添加有機酸標準品(各有機酸添加濃度，g/L：草酸0.198、酒石酸0.123、蘋果酸0.069、乳酸0.207、乙酸1.236、檸檬酸0.6、琥珀酸1.068)測定回收率。成品黃酒中有機酸本底含量是以優(yōu)化后方法的測定值。

方案2：考察氨基酸/多肽混合物對有機酸測定的影響。向有機酸混合標準溶液(以流動相為溶劑，以13#酒樣有機酸含量為參照，各有機酸添加濃度，g/L：草酸0.408、酒石酸0.171、蘋果酸0.405、乳酸3.370、乙酸1.016、檸檬酸0.444、琥珀酸0.949，下同)添加氨基酸/多肽類雜質(加入量參照黃酒中的大致比例，氨基酸與多肽質量比約為1∶3)總量為6.0 g/L[23-24]，測定回收率。

方案3：考察焦糖色素對有機酸測定的影響。向有機酸混合標準溶液添加焦糖色素(黃酒中的主要色素)測定回收率，焦糖色素添加濃度1.0 g/L[18]。

方案4：考察糖分對黃酒有機酸測定影響。向有機酸混合標準溶液添加葡萄糖測定回收率，葡萄糖添加濃度100.017 g/L(模擬甜型黃酒總糖(以葡萄糖計)>100 g/L)。

以上設計方案樣品檢測前均經0.22 μm微孔濾膜過濾。

1.4.2 樣品預處理

待測黃酒樣品進樣前需經過以下步驟：首先采用移液管準確量取黃酒樣品5 mL，流動相10 mL充分混勻，其次經SPE小柱進行凈化處理，凈化處理流程如下：依次用1倍柱體積的純甲醇和水活化小柱，將待凈化的稀釋后黃酒樣品通過SPE小柱進行凈化處理，舍去前面1倍柱體積凈化液，剩余凈化液經0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。

1.4.3 標準曲線繪制

分別精確稱取草酸(0.409 g)、酒石酸(0.171 g)、蘋果酸(0.405 g)、乳酸(3.746 g)、乙酸(1.106 g)、檸檬酸(0.444 g)和琥珀酸(0.949 g)，以流動相為溶劑溶解定容至100 mL配制成有機酸混合標準溶液母液，使用時，采用流動相逐級稀釋，進行標準曲線的繪制，標準品母液現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4.4 樣品測定

根據建立的黃酒有機酸準確定量方法對傳統(tǒng)型和清爽型黃酒樣品進行測定，每個樣品平行測定3次，結果取平均值。

2 結果與討論

2.1 黃酒中有機酸檢測干擾因素分析

本研究分析比較了黃酒中含量較高的組分(氨基酸/多肽、色素、糖分)對有機酸分離檢測的影響，黃酒本底有機酸含量的測定采用了SCX-SPE小柱凈化處理。首先對未經凈化處理的黃酒樣品直接進行UPLC色譜分析及回收率的測定，結果顯示各有機酸分離度較差，且大部分有機酸回收率不滿足要求(見圖1，表2)，由此可知黃酒中存在的雜質嚴重干擾了有機酸的準確定量。有機酸標準溶液中添加干擾雜質進行回收率分析發(fā)現(xiàn)，氨基酸/多肽類雜質對有機酸檢測影響最大，其中蘋果酸和草酸的回收率分別達到了164.54%和159.75%；其次為色素類雜質，酒石酸和蘋果酸的回收率分別達到了146.34%和143.68%；而糖類雜質添加后，各有機酸的回收率均在95%～110%，未對有機酸準確定量造成影響(表2)。由此可知黃酒中存在的氨基酸/多肽類以及色素類雜質對有機酸準確定量的具有較大的影響。

1-草酸；2-酒石酸；3-蘋果酸；4-乳酸；5-乙酸；6-檸檬酸；7-琥珀酸圖1 未經SPE小柱凈化處理黃酒樣品有機酸超高效液相色譜圖Fig.1 UPLC chromatogram of organic acids in Chinese rice wine without SPE purify

方案草酸酒石酸蘋果酸乳酸乙酸檸檬酸琥珀酸方案1(黃酒樣品)27.38224.5563.1187.2857.79235.12202.92方案2(氨基酸/多肽)159.75120.13164.54117.50101.36136.56137.43方案3(色素)107.32146.34143.68106.30135.04110.14110.38方案4(糖分)105.35102.39109.1297.5995.0197.9396.62

2.2 基于SPE小柱凈化方法優(yōu)化

為了降低樣品中雜質對有機酸檢測的干擾，SPE技術經常用于樣品的凈化處理[25-27]。傳統(tǒng)處理方法一般要經過活化、上樣、淋洗、洗脫等繁瑣步驟。為了簡化樣品凈化處理的流程，本研究提出直接通過SPE過濾吸附除雜對黃酒樣品進行凈化處理的方案?？紤]到有機酸在黃酒中主要以分子或陰離子狀態(tài)存在，因此在SPE小柱的選擇時，采用陰離子以外的SPE柱對凈化效果進行比較。本研究優(yōu)化比較的SPE小柱型號見1.1，樣品處理流程參照1.4。

2.2.1 不同SPE小柱氨基酸/多肽及色素類雜質去除能力比較

針對氨基酸/多肽和色素兩類雜質對有機酸出峰有較大影響的問題 ，選取不同型號的SPE小柱對,2種雜質的去除能力進行比較。

表3 SPE小柱凈化黃酒樣品雜質去除能力

注：空白為未經固相萃取小柱處理。

[28, 29]中的方法分別對黃酒樣品中水解氨基酸濃度和610 nm波長下的光密度值進行測定，以比較不同SPE小柱的氨基酸/多肽和色素去除能力。從表3中可以看出，不同型號SPE小柱均在一定程度上具有氨基酸/多肽及色素吸附的能力，但吸附效果差異較大。其中SCX和MCX對氨基酸/多肽及色素具有較強的吸附能力，氨基酸/多肽去除率分別為95.28%和82.84%，色素去除率分別為47.57%和51.46%。而其他小柱的氨基酸/多肽和色素去除能力均較低。

2.2.2 黃酒樣品凈化處理后有機酸回收率測定

為了進一步考察氨基酸/多肽和色素對黃酒樣品有機酸測定的影響及不同SPE小柱的凈化效果，通過不同SPE小柱凈化處理加標和未加標黃酒樣品(13#)，對有機酸回收率測定結果見表4。從表4可以看出，SCX-SPE小柱凈化效果最好，各有機酸回收率均在91%～114%。而經MCX-SPE小柱凈化處理，各有機酸回收率也有了明顯提升，但較SCX效果略差。而經其他SPE小柱凈化處理后，有機酸回收率的測定結果不理想，無法實現(xiàn)有機酸的準確定量。比較表2，表3結果可知，對氨基酸/多肽和色素去除效果較好的SPE小柱一般能夠獲得較好的有機酸測定回收率，這也進一步表明氨基酸/多肽和色素可能是影響黃酒有機酸測定的主要干擾因素。

表4 SPE小柱凈化處理黃酒樣品7種有機酸回收率(%)

2.3 方法學考察

2.3.1 標準曲線、最低檢測限和線性范圍

對7種有機酸混合標準品母液采用流動相逐級稀釋，依照1.3所示色譜條件進行檢測，結果顯示7種有機酸均有較好的分離度，峰形對稱性好，基線噪音小，標準曲線、檢測限和線性范圍見表5。各有機酸的相關系數(shù)均在0.999 3～1.000 0，說明在此液相條件下各有機酸組分的峰面積和質量濃度線性相關性很好，可以滿足有機酸準確定量的要求。

2.3.2 回收率及精密度

取流動相稀釋處理的加標和未加標黃酒樣品(13#)各5份，SPE小柱型號為SCX(500 mg，3 mL)，凈化處理流程參照1.4，色譜條件參照1.3。UPLC色譜圖見圖2，各有機酸的回收率及精密度測定結果(n=5)見表6。從圖2可以看出，經SCX-SPE小柱處理后，7種目標有機酸的峰形均有了較大改善，基本可以實現(xiàn)基線分離。各有機酸的回收率均在94.96%～105.08%之間，RSD為0.43%～1.79%，符合有機酸準確定量的要求。

表5 7種有機酸的線性范圍、線性回歸方程、相關系數(shù)和檢出限

注：y，峰面積；X，濃度，g/L。

1-草酸；2-酒石酸；3-蘋果酸；4-乳酸；5-乙酸；6-檸檬酸；7-琥珀酸圖2 經SCX-SPE小柱凈化處理的黃酒有機酸超高效液相色譜圖Fig.2 UPLC chromatogram of organic acids in Chinese rice wine with SCX-SPE purifying

有機酸酒樣濃度/(g·L-1)加標濃度/(g·L-1)加標檢測濃度/(g·L-1)回收率/%RSD/%草酸0.1110.1980.32196.260.43酒石酸0.0630.1230.177105.081.31蘋果酸0.1890.2070.41794.961.79乳酸3.3063.846.987102.280.80乙酸1.1611.2362.337102.571.03檸檬酸0.6330.61.185104.051.17琥珀酸0.9511.0682.04698.680.87

2.4 不同類型黃酒中有機酸含量分析

采用本研究建立的方法對不同來源的傳統(tǒng)型黃酒樣品(1#～12#)和清爽型黃酒樣品(13#～18#)中有機酸含量進行了測定，結果見表7。

從表7可以看出，黃酒中含量最高的有機酸為乳酸(2.290～5.959 g/L)，其次為琥珀酸(1.776～3.228 g/L)及乙酸(0.511～1.306 g/L)。雖然傳統(tǒng)型黃酒中有機酸總含量顯著高于清爽型黃酒(P<0.05)，但兩種類型黃酒中乙酸、琥珀酸、檸檬酸和草酸的含量接近，并沒有顯著差異。兩種類型黃酒中有機酸含量的差異主要集中于乳酸、蘋果酸和酒石酸。傳統(tǒng)型黃酒中酒石酸、蘋果酸和乳酸的含量顯著高于清爽型黃酒(P<0.05)，分別是后者的2.78、1.71和1.60倍。這3種有機酸可能是造成兩種類型黃酒口感差異的重要因素之一，因此可作為區(qū)分傳統(tǒng)型黃酒和清爽型黃酒的特征性組分。乳酸作為黃酒中最主要的有機酸，其口感柔和，能夠增加酒體醇厚感。乳酸在黃酒釀造過程中主要由搭窩過程中霉菌和浸米發(fā)酵過程中乳酸菌代謝生成[30]，傳統(tǒng)型黃酒較長浸米時間和發(fā)酵時間可能是造成其高乳酸含量的主要原因。蘋果酸酸味清新爽快，呈味持久緩慢且呈味閾值較低(0.087 g/L)，其主要由三羧酸循環(huán)途徑代謝生成，微生物種類及代謝特征的差異均能影響蘋果酸的生成[31]。酒石酸作為兩種類型黃酒中含量差異最大的有機酸，其在黃酒中的形成途徑還未見相關報道，值得進一步的研究。

3 結論

本研究系統(tǒng)考察了黃酒中主要雜質組分對有機酸測定的影響，明確了氨基酸/多肽和色素這兩類組分是影響有機酸的準確定量的主要因素。

本研究提出了基于SPE一步凈化除雜的策略，建立了一種基于固相萃取一步凈化與UPLC技術相結合的快速檢測黃酒中主要有機酸的方法。采用SCX-SPE小柱可以有效去除對有機酸測定影響較大的氨基酸/多肽和色素類雜質，結合UPLC能夠在5 min內實現(xiàn)黃酒中有機酸的分離檢測。該方法具有快速、便捷、準確性高等優(yōu)點，適合于黃酒樣品有機酸的準確測定。

采用本研究建立的方法對不同來源傳統(tǒng)型黃酒和清爽型黃酒樣品中有機酸含量特征進行分析發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)型黃酒中有機酸總含量顯著高于清爽型黃酒。這種差異主要由酒石酸、蘋果酸和乳酸的含量差異造成。2種類型黃酒中琥珀酸、乙酸、檸檬酸和草酸含量并沒有顯著差異。

表7 傳統(tǒng)型與清爽型黃酒樣品有機酸含量

注：* 每個樣品測定3個平行，平行間相對標準偏差(RSD)均小于5%。

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Determination of organic acids in Chinese rice wine by solid phase extraction-ultra performance liquid chromatography

WANG Lin,CHEN Shuang,XU Yan*

(State Key Laboratory of Food Science & Technology, Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education; Centre for Brewing Science and Enzyme Biotechnology, School of Biotechnology Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

The influence of major components in Chinese rice wine on the chromatographic analysis of organic acids was investigated. Amino acids, polypeptides and pigments were the major impurities which observably interfere with chromatographic separation of organic acids in Chinese rice wine. A method for the simultaneous determination of 7 organic acids in Chinese rice wine was developed by solid-phase extraction and ultra performance liquid chromatography (SPE-UPLC). The sample was purified by the SCX-SPE cartridge after pretreatment, and then separated by ACQUITY UPLC HSS T3 column. 20 mmol/L NaH2PO4(pH 2.7) was used as the mobile phase at a flow rate of 0.25 mL/min. The detection was performed by a diode array detector at 210 nm. The results showed that 7 organic acids were completely separated and determined in 5 min. the linear correlation coefficients were above 0.999 3 in the range of 0.100-37 456.000 mg/L. Under these conditions, the recoveries of 7 organic acids in rice wine were in the range of 94.96%-105.08% with the relative standard deviations (RSDs,n=5) of 0.43%-1.79%. Compared with traditional organic acid SPE’s adsorption and elution operation, this method is feasible, accurate and applicable for the quantitative analysis of organic acids in Chinese rice wine. With this method, we analyzed the differences of the organic acids concentrations between Traditional and Qingshuang Chinese rice wine. The results showed that the total acids in Traditional Chinese rice wine was significantly higher (P<0.05) than those in Qingshuang Chinese rice wine, while the difference was mainly caused by the remarkable difference (P<0.05) in the concentrations of tartaric acid, malic acid and lactic acid.

ultra performance liquid chromatography(UPLC); solid phase extraction(SPE); organic acid; Traditional Chinese rice wine; Qingshuang Chinese rice wine

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201610024

碩士研究生(徐巖教授為通訊作者,E-mail：yxu@jiangnan.edu.cn)。

國家自然科學基金(31530055、21506074)；國家高技術研究發(fā)展計劃(863計劃)(2013AA102108)；江蘇省自然科學基金(BK20140153)

2016-02-24，改回日期：2016-03-30