里氏木霉Rut-C30發(fā)酵熱水預(yù)處理稻草產(chǎn)纖維素酶

蘇存生，賀建龍，熊鵬，岳春，于鳳川，孫付保*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫, 214122) 2(淮陰師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院, 江蘇省生物質(zhì)能與酶技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 淮安, 223005) 3(南陽理工學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，河南 南陽, 473004)

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里氏木霉Rut-C30發(fā)酵熱水預(yù)處理稻草產(chǎn)纖維素酶

蘇存生1，賀建龍2，熊鵬2，岳春3，于鳳川1，孫付保1*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫, 214122) 2(淮陰師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院, 江蘇省生物質(zhì)能與酶技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 淮安, 223005) 3(南陽理工學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，河南 南陽, 473004)

為提高工業(yè)生產(chǎn)菌TrichodermareeseiRut-C30產(chǎn)酶能力，以熱水預(yù)處理稻草(hot water pretreated rice straw, HWPRS)為碳源，開展系統(tǒng)優(yōu)化培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件以及采用添加劑等方面的實(shí)驗(yàn)工作。菌株初始搖瓶發(fā)酵HWPR 產(chǎn)纖維素酶在168 h時(shí)濾紙酶活(FPA)為1.20 U/mL。通過單因素實(shí)驗(yàn)與正交實(shí)驗(yàn)，獲得最佳培養(yǎng)基(g/L)：HWPRS 50.0、玉米漿6.0、(NH4)2SO44.0、KH2PO41.0、尿素0.2、MgSO4·7H2O 0.4、CaCl20.3；最佳培養(yǎng)條件：pH6.0、轉(zhuǎn)速220 r/min、溫度30 ℃、接種量φ6%；優(yōu)化后菌株產(chǎn)酶FPA達(dá)2.69 U/mL，是優(yōu)化前2倍以上。添加吐溫-80能顯著提高產(chǎn)酶，β-葡萄糖苷酶活(BG)提高26%；添加乳糖主要能提高BG酶活；實(shí)驗(yàn)中首次發(fā)現(xiàn)殼聚糖類物質(zhì)能促進(jìn)纖維素酶發(fā)酵，其中殼聚糖效果最明顯，添加1.5 g/L殼聚糖時(shí)纖維素酶FPA與BG分別提高了10%和30%，使纖維素酶FPA、CMCase和BG分別達(dá)到3.67、8.65和1.76 U/mL。該產(chǎn)酶穩(wěn)定性為上罐實(shí)驗(yàn)證實(shí)，所產(chǎn)纖維素酶FPA水平是初始搖瓶發(fā)酵的3倍，初步顯示了其工業(yè)發(fā)酵潛力。

熱水預(yù)處理稻草；里氏木霉Rut-C30；纖維素酶；發(fā)酵優(yōu)化；殼聚糖

在木質(zhì)纖維素生產(chǎn)燃料乙醇過程中，纖維素酶將纖維質(zhì)原料水解為可發(fā)酵性糖，為后續(xù)微生物生產(chǎn)燃料乙醇提供基質(zhì)，纖維素酶酶解是纖維素乙醇商業(yè)化的關(guān)鍵步驟[1-2]。據(jù)報(bào)道，纖維素酶成本占纖維素乙醇成本的20%～40%，目前纖維素酶成本高和用量大是纖維素乙醇生產(chǎn)成本居高不下的重要原因[1, 3]?？梢?，如何經(jīng)濟(jì)高效地生產(chǎn)纖維素酶是當(dāng)前纖維素乙醇行業(yè)值得關(guān)注的課題。

在發(fā)酵基質(zhì)方面，傳統(tǒng)上使用純纖維素及其衍生物，如結(jié)晶纖維素、羧甲基纖維素鈉和紙漿等，表明了纖維基質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶可行性[4-5]。為降低生產(chǎn)成本，近年來逐步出現(xiàn)了利用天然纖維質(zhì)原料替代高成本的工業(yè)產(chǎn)物發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的報(bào)道，例如利用甘蔗渣、橡木和農(nóng)作物秸稈等替代純的纖維素進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶[6-7]。2013年，CULBERTSON等[2]用20 g/L的氨氣爆破預(yù)處理的玉米秸稈進(jìn)行搖瓶發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶，酶活在144 h達(dá)到1.90 U/mL；2015年，馬立娟等[8]用10 g/L的玉米芯進(jìn)行搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶，酶活在120 h達(dá)到1.53 U/mL。這些工作展示了利用天然纖維質(zhì)廢棄物發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶具有切實(shí)可行性與潛在經(jīng)濟(jì)性。

然而，目前利用天然纖維質(zhì)原料發(fā)酵產(chǎn)酶水平并不高，F(xiàn)PA大多在1.0 U/mL左右。于是，陸續(xù)有研究者開展了纖維素酶發(fā)酵工藝優(yōu)化方面的工作。2005年，JUHASZ等[7]以40 g/L酸預(yù)處理橡木為底物采用分批補(bǔ)料方式對(duì)纖維素酶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，酶活在168 h達(dá)到3.20 U/mL，比之前提高近1倍；鐘桂芳等[9]以18 g/L麩皮為碳源進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵條件，酶活達(dá)到3.12 U/mL，比優(yōu)化前提高72%。此外，CHANDRA等[10]發(fā)酵時(shí)添加氨基丁酸與茉莉酸，酶活達(dá)到3.21 U/mL，比之前提高3倍；劉佳等[11]在固態(tài)發(fā)酵時(shí)添加鼠李糖與吐溫-80使酶活提高50%。這些工作顯示，利用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化和采用合適添加劑等策略進(jìn)行纖維素酶發(fā)酵工藝優(yōu)化，是提高纖維素酶發(fā)酵水平的有效途徑。

基于此，本文以HWPRS為碳源，嘗試采用試驗(yàn)設(shè)計(jì)系統(tǒng)優(yōu)化和添加劑等手段提高工業(yè)化菌株T.reeseiRut-C30發(fā)酵產(chǎn)酶水平，為現(xiàn)行纖維素酶發(fā)酵工業(yè)提供技術(shù)支撐。實(shí)驗(yàn)首先考察了該工業(yè)菌株的現(xiàn)行發(fā)酵水平，接著依次采用單因素與正交實(shí)驗(yàn)對(duì)纖維素酶發(fā)酵培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上開展了吐溫-80、乳糖與殼聚糖等添加劑探索，最后在5 L發(fā)酵罐上進(jìn)行了發(fā)酵驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種與試劑

里氏木霉T.reeseiRut-C30由淮安百麥綠色能源公司饋贈(zèng)。熱水預(yù)處理稻草(hot water pretreated rice straw, HWPRS)是粉碎至粒徑小于5 mm的稻草在180 ℃高壓熱水中處理10 min，由淮安百麥綠色能源公司提供。Whatman No.1濾紙購于英國Whatman公司；吐溫-80、乳糖、殼聚糖等試劑均購自于上海國藥集團(tuán)，玉米漿為市場(chǎng)購買。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：土豆200，葡萄糖20，pH自然。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：HWPRS 20.0，玉米漿2.0，(NH4)2SO41.4，KH2PO42.0，尿素0.3，MgSO4·7H2O 0.3，CaCl20.3，pH5.0；Mandels營養(yǎng)鹽微量元素(mg/L)：FeSO4·7H2O 5.0，MnSO4·H2O 1.6，ZnSO4·7H2O 1.4，CoC12·6H2O 3.7，過濾除菌后加入培養(yǎng)基。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 種子培養(yǎng)

取1.0 mL含量為1.0×108/mL里氏木霉Rut-C30孢子懸液接種到種子培養(yǎng)基中，于30 ℃和180 r/min旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)24 h，獲得種子菌液。

1.2.2 纖維素酶發(fā)酵的初步探討

發(fā)酵時(shí)取上述種子液按體積百分比 6%的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基上，于30 ℃和180 r/min旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)168 h，定期取樣測(cè)定酶活。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基(HWPRS、玉米漿、(NH4)2SO4、KH2PO4、尿素、MgSO4·7H2O、CaCl2)和上述培養(yǎng)條件(初始pH、轉(zhuǎn)速、溫度、接種量)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，考察某一個(gè)因素時(shí)保持其他條件不變，找出對(duì)纖維素酶影響最為明顯的因素。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)上面單因素實(shí)驗(yàn)確定的因素水平，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)。對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基與發(fā)酵條件分別設(shè)計(jì)L18(37)和L9(34)兩個(gè)正交表，如表1和表2所示。

表1 L18(37)發(fā)酵培養(yǎng)基正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表2 L9(34)發(fā)酵培養(yǎng)條件正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.2.5 添加劑考察

在正交優(yōu)化基礎(chǔ)上，進(jìn)行吐溫-80添加時(shí)間 (24、48、72、96、120 h) 與添加量 (0、1.0、2.0、4.0、6.0 g/L) 優(yōu)化；在其基礎(chǔ)上對(duì)乳糖添加量 (0、0.25、0.5、1.0、1.5 g/L) 進(jìn)行優(yōu)化；最后優(yōu)化殼聚糖添加量 (0、0.5、1.0、1.5、2.0 g/L)，促進(jìn)里氏木霉Rut-C30產(chǎn)酶，提高酶活。

1.2.6 上罐放大

按照上述優(yōu)化好的條件進(jìn)行5 L發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)：溫度30 ℃，通氣量1.5 v/v/min，攪拌轉(zhuǎn)速220 r/min，pH≥4.5，溶氧在前48 h控制在80%左右，48 h后控制在40%左右。每隔24 h取樣，測(cè)定酶活。

1.3 分析測(cè)定方法

1.3.1 酶活測(cè)定

發(fā)酵液取樣后于4 ℃、8 000 r/min離心10 min獲得上清液，經(jīng)適當(dāng)稀釋以測(cè)定纖維素酶活性。測(cè)定時(shí)取稀釋酶液0.5 mL與1.0 mL的50 mmol/L檸檬酸緩沖液(pH4.8)混合，加入50 mg (1 cm × 6 cm) Whatman No.1濾紙條后于50 ℃靜置反應(yīng)1 h，加入1.0 mL DNS溶液后于沸水浴5 min。冷卻至室溫后稀釋10倍測(cè)定OD540值，并根據(jù)相關(guān)公式換算成酶活[12]。CMCase與BG則分別以1%的CMC和水楊苷為底物，反應(yīng)時(shí)間30 min，其他條件不變。酶活定義：水解底物時(shí)每分鐘產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需酶量定義為1個(gè)酶活單位(U)。

1.3.2 蛋白測(cè)定

參考Bradford法測(cè)定蛋白含量[13]。實(shí)驗(yàn)時(shí)吸取適當(dāng)稀釋發(fā)酵液0.5 mL于5 mL離心管中，再加入2.50 mL考馬斯亮藍(lán)溶液，通過渦流混勻后測(cè)定OD595值，根據(jù)蛋白標(biāo)曲換算成蛋白含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 纖維素酶發(fā)酵的初步探討

本實(shí)驗(yàn)以合作單位淮安百麥綠色能源生物有限公司的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行初步的搖瓶發(fā)酵，結(jié)果如圖1所示。隨著發(fā)酵進(jìn)行，菌株產(chǎn)酶逐步提高，144 h時(shí)纖維素酶FPA、CMCase和BG酶活均達(dá)到最高水平，分別為1.20、6.70和0.81 U/mL。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與公司數(shù)據(jù)(內(nèi)部交流)相一致，代表著現(xiàn)有纖維素酶發(fā)酵工業(yè)水平。已有文獻(xiàn)顯示，里氏木霉在酸處理橡木、汽爆橡木和玉米芯等天然纖維素質(zhì)原料上發(fā)酵產(chǎn)酶FPA可達(dá)3～5 U/mL[7-9]，顯示出該菌具有較大的發(fā)酵潛力。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中嘗試從培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件等方面對(duì)該菌株發(fā)酵HWPRS產(chǎn)酶過程進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化以提高其產(chǎn)酶水平。另外，考慮到公司實(shí)際生產(chǎn)中采用較昂貴的添加劑進(jìn)行產(chǎn)酶誘導(dǎo)，所以本文也將探討一些廉價(jià)添加劑的使用以降低纖維素酶生產(chǎn)成本。

圖1 HWPRS發(fā)酵纖維素酶初步探索Fig.1 Preliminary cellulase fermentation of HWPRS

2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化

2.2.1 單因素優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基碳源(HWPRS)、氮源[(NH4)2SO4、玉米漿、尿素]和無機(jī)鹽(KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2)等進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示。

當(dāng)培養(yǎng)基中碳源濃度較低時(shí)，發(fā)酵所產(chǎn)纖維素酶活隨著基質(zhì)HWPRS添加明顯提高，在HWPRS濃度為40.0 g/L時(shí)酶活最高，達(dá)到1.38 U/mL，此后進(jìn)一步添加基質(zhì)酶活反而下降，可能是基質(zhì)過高會(huì)導(dǎo)致整個(gè)發(fā)酵體系的傳質(zhì)傳氧降低，進(jìn)而影響產(chǎn)酶，也可能是高濃度基質(zhì)吸附過多纖維素酶導(dǎo)致發(fā)酵液中游離酶濃度降低[14-15]。因此，選擇40.0 g/L作為適宜的發(fā)酵基質(zhì)濃度。玉米漿作為一種常見易得的氮源，不僅含有豐富的氮元素，又能為微生物生長提供多種必需的生長因子，為合成各種酶提供前體[16]。實(shí)驗(yàn)中纖維素酶活隨玉米漿濃度增大不斷上升，當(dāng)玉米漿加量為4.0 g/L時(shí)酶活達(dá)到最高值1.48 U/mL，因此確定玉米漿濃度為4.0 g/L。當(dāng)(NH4)2SO4濃度達(dá)到3.0 g/L時(shí)纖維素酶發(fā)酵酶活達(dá)到最高值1.37 U/mL，因而選擇(NH4)2SO4添加量為3.0 g/L，這與文獻(xiàn)報(bào)道是一致的[15]。同樣地，實(shí)驗(yàn)中確定尿素添加量為0.3 g/L、KH2PO4為2.0 g/L、MgSO4·7H2O為0.3 g/L和CaCl2為0.3 g/L。

圖2 發(fā)酵培養(yǎng)基單因素實(shí)驗(yàn)Fig.2 Single factor experiment of selecting the fermentation medium

2.2.2 培養(yǎng)基正交實(shí)驗(yàn)

上述單因素實(shí)驗(yàn)確定出培養(yǎng)基中各成分含量，本實(shí)驗(yàn)通過設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)考察這些因素對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如表3所示。

對(duì)正交實(shí)驗(yàn)使用“正交設(shè)計(jì)助手II v3.1”進(jìn)行7因素3水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，并對(duì)所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。由表3可知，培養(yǎng)基中各成分對(duì)纖維素酶產(chǎn)量影響各不相同。由極差分析可知，各個(gè)因素對(duì)纖維素酶分泌的影響順序按照極差大小排序依次是：玉米漿 >HWPRS > (NH4)2SO4>尿素 > KH2PO4>MgSO4·7H2O > CaCl2。

根據(jù)表4方差分析，培養(yǎng)基中所有成分對(duì)纖維素酶影響順序依次為：玉米漿 > HWPRS > (NH4)2SO4>尿素 > KH2PO4> MgSO4·7H2O > CaCl2，這與上面極差分析是一致的。確定出最佳組合為A3B3C3D1E1F3G2，即產(chǎn)酶最適發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：HWPRS 50.0，玉米漿6.0，(NH4)2SO44.0；KH2PO41.0；尿素0.2；MgSO4·7H2O 0.4；CaCl20.3。按照最佳組合進(jìn)行驗(yàn)證，F(xiàn)PA最高產(chǎn)量達(dá)到2.40 U/mL，實(shí)驗(yàn)結(jié)果處于正交實(shí)驗(yàn)中較高水平，結(jié)果可信，較優(yōu)化前提高了1倍；CMCase與BG分別達(dá)到7.12 U/mL與0.87 U/mL，與優(yōu)化前相比略有提高。

表3 L18(37)正交實(shí)驗(yàn)及結(jié)果

表4 正交實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果

2.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化

培養(yǎng)條件對(duì)微生物發(fā)酵具有重要意義，在微生物發(fā)酵過程中，合適的培養(yǎng)條件不僅能夠穩(wěn)定菌體的生長，還能夠促進(jìn)產(chǎn)酶[5, 17]。在上述最適培養(yǎng)基基礎(chǔ)之上，考察初始pH、轉(zhuǎn)速、溫度與接種量等主要培養(yǎng)條件對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

2.3.1 培養(yǎng)條件單因素實(shí)驗(yàn)

發(fā)酵初始pH、轉(zhuǎn)速、溫度與接種量等參數(shù)的單因素實(shí)驗(yàn)如圖3所示。當(dāng)培養(yǎng)基初始pH較低時(shí)，纖維素酶發(fā)酵酶活隨著pH增加而明顯上升，在pH5.5時(shí)酶活達(dá)到最高為2.51 U/mL，因此確定最適發(fā)酵初始pH5.5。在轉(zhuǎn)速方面，纖維素酶發(fā)酵隨著轉(zhuǎn)速增加，傳質(zhì)傳氧加快，從而提高了產(chǎn)酶水平；當(dāng)轉(zhuǎn)速過大時(shí)，搖瓶轉(zhuǎn)動(dòng)產(chǎn)生剪切力也會(huì)對(duì)菌絲體造成損害，進(jìn)而影響產(chǎn)酶[18]。當(dāng)轉(zhuǎn)速為220 r/min時(shí)酶活最高達(dá)到2.56 U/mL，所以確定220 r/min為最佳轉(zhuǎn)速。在培養(yǎng)溫度28～32 ℃時(shí)里氏木霉發(fā)酵所產(chǎn)酶活變化不大，但溫度升高到34 ℃時(shí)酶活迅速降低，確定適宜培養(yǎng)溫度為30 ℃。同樣地，實(shí)驗(yàn)中確定最適接種量φ為8%。

圖3 發(fā)酵條件單因素實(shí)驗(yàn)Fig.3 Single factor experiment of fermentation condition

2.3.2 培養(yǎng)條件正交實(shí)驗(yàn)

基于上述的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表5和表6所示。

表5 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)及結(jié)果

表6 正交實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果

經(jīng)過極差和方差分析，確定各個(gè)條件對(duì)酶活影響大小順序依次為：接種量>pH>溫度>轉(zhuǎn)速 ，最佳組合為A3B2C2D1，即：pH6.0、轉(zhuǎn)速220 r/min、溫度30 ℃、接種量φ6%。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證獲得該酶發(fā)酵酶活為2.69 U/mL，比培養(yǎng)條件優(yōu)化前提高了12.1%；CMCase與BG達(dá)到7.32 U/mL與0.91 U/mL，與優(yōu)化前相差別不大。

2.4 添加劑對(duì)纖維素酶的促進(jìn)作用

2.4.1 添加吐溫-80

一些資料顯示，表面活性劑吐溫-80能改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)，增大細(xì)胞膜通透性，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)容物外流，使得胞外蛋白分泌加速[11]。本實(shí)驗(yàn)考察吐溫-80添加時(shí)間與添加量對(duì)纖維素酶發(fā)酵酶活的影響，結(jié)果如圖4。由圖4A可知，在發(fā)酵前48 h添加吐溫-80不利于發(fā)酵產(chǎn)酶，從發(fā)酵72 h開始時(shí)添加對(duì)纖維素酶酶活提高有積極作用，在96 h添加時(shí)酶活達(dá)到最高水平3.12 U/mL，添加時(shí)間再晚時(shí)酶活反而降低。因此，選擇吐溫-80添加時(shí)間為發(fā)酵96 h。在96 h添加不同量吐溫-80考察添加量對(duì)產(chǎn)酶影響，如圖4B所示。在添加量較低時(shí)酶活隨著吐溫-80添加而明顯提高，在添加4.0 g/L時(shí)酶活達(dá)到3.15 U/mL，添加量再高時(shí)酶活反而降低。因此確定在96 h添加吐溫-80，添加量為4.0 g/L；此時(shí)纖維素酶FPA、CMCase和BG分別達(dá)到3.15、8.28和1.22 U/mL，比對(duì)照組分別提高了13%、13%和26%。

圖4 添加吐溫-80對(duì)HWPRS發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的影響Fig.4 Effect of the Tween-80 on the cellulase production from HWPRS

2.4.2 添加乳糖誘導(dǎo)產(chǎn)酶

文獻(xiàn)報(bào)道顯示，添加乳糖對(duì)纖維素酶發(fā)酵具有誘導(dǎo)作用。在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，考察乳糖添加對(duì)發(fā)酵誘導(dǎo)產(chǎn)酶的影響[19]。由圖1可知，在發(fā)酵48 h內(nèi)主要是菌體生長，產(chǎn)酶能力較弱，若此時(shí)添加乳糖會(huì)被消耗用于生長。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇在發(fā)酵中期(48、72和96 h)添加不同濃度乳糖(0.25、0.5、1.0、1.5 g/L)，考察乳糖對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶影響。由圖5看出，少量乳糖對(duì)纖維素酶發(fā)酵產(chǎn)酶具有促進(jìn)作用，但濃度過高也不利于纖維素酶合成，反而抑制酶的表達(dá)。主要原因可能是少量乳糖進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部后誘導(dǎo)酶表達(dá)，但乳糖濃度過高時(shí)乳糖分解產(chǎn)生單糖抑制了纖維素酶表達(dá)[19]。在乳糖添加量0.5 g/L時(shí)纖維素酶3種酶活均達(dá)到最高水平，F(xiàn)PA、CMCase和BG分別為3.29、8.40和1.36 U/mL。與添加前相比，乳糖添加對(duì)BG酶活提高最為明顯，提高了13%以上。確定乳糖最佳添加量為0.5 g/L。

圖5 乳糖添加對(duì)HWPRS發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的影響Fig.5 Effect of the lactose addition on cellulase production from HWPRS

2.4.3 添加殼聚糖

殼聚糖是幾丁質(zhì)脫乙?；蟮漠a(chǎn)物，是自然界中含量僅次于纖維素的天然糖鏈資源，有文獻(xiàn)報(bào)道里氏木霉能夠降解殼聚糖產(chǎn)生殼寡糖[20]。陸大年等[21]發(fā)現(xiàn)在纖維素酶解過程中添加殼聚糖能促進(jìn)酶解。然而，殼聚糖能否對(duì)纖維素酶發(fā)酵生產(chǎn)有作用，尚未見諸報(bào)道。

選取殼聚糖、幾丁質(zhì)、羧甲基殼聚糖、殼寡糖等幾種結(jié)構(gòu)相近的物質(zhì)，考察它們對(duì)纖維素酶發(fā)酵影響。由圖6可知，發(fā)酵時(shí)添加殼聚糖能明顯提高產(chǎn)酶水平，羧甲基殼聚糖對(duì)產(chǎn)酶作用不明顯，而幾丁質(zhì)和殼寡糖對(duì)產(chǎn)酶有一定抑制作用。因此確定殼聚糖為添加物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)接著探討殼聚糖的最適添加時(shí)間與添加量，如圖7所示。在發(fā)酵前48 h添加殼聚糖對(duì)產(chǎn)酶無益，甚至有明顯抑制作用，在發(fā)酵48 h后添加時(shí)殼聚糖對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶有明顯促進(jìn)作用，在96 h添加時(shí)酶活最高達(dá)到3.41 U/mL。進(jìn)一步考察殼聚糖添加量發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加量較少時(shí)3種酶活均隨著殼聚糖添加而不斷提高，當(dāng)殼聚糖添加量為1.50 g/L時(shí)酶活達(dá)到最高水平，此時(shí)FPA、CMCase和BG分別為3.67、8.65和1.76 U/mL，與未添加相比分別提高11%、3%和29%。從結(jié)果看出，殼聚糖對(duì)纖維素酶BG酶活的促進(jìn)作用尤為明顯。分析原因可能是，殼聚糖在菌體生長早期添加會(huì)影響菌體生長與產(chǎn)酶，在菌體進(jìn)入穩(wěn)定期大量產(chǎn)酶階段添加，殼聚糖被快速降解成小分子二(三)糖產(chǎn)物，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部后進(jìn)一步強(qiáng)化纖維素酶誘導(dǎo)表達(dá)；此外，殼聚糖還能夠特異性地結(jié)合在細(xì)胞表面增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)酶的分泌[22]。因此確定殼聚糖最適添加時(shí)間與添加量為：發(fā)酵96 h添加1.50 g/L殼聚糖。

圖6 不同添加劑對(duì)纖維素酶影響Fig. 6 Effect of different additives on cellulase

圖7 殼聚糖對(duì)HWPRS發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶促進(jìn)作用Fig.7 Active role of chitosan addition on the cellulase production from HWPRS

2.5 上罐放大實(shí)驗(yàn)

在上述搖瓶發(fā)酵基礎(chǔ)上，進(jìn)行5 L發(fā)酵罐上產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn)。發(fā)酵溫度控制在30 ℃，pH、溶氧控制與發(fā)酵酶活情況如圖8所示。由圖8A看出，在發(fā)酵前48 h，發(fā)酵液pH迅速下降，通過補(bǔ)加氨水控制pH不低于4.5，此時(shí)發(fā)酵主要處于菌體旺盛生長階段，其中在發(fā)酵24 h時(shí)恒速流加乳糖；發(fā)酵48 h后菌體進(jìn)入穩(wěn)定期，pH開始回升，溶氧48 h以前控制在80%左右，48 h后在40%左右以使菌體更好產(chǎn)酶[23]，其中在發(fā)酵96 h添加吐溫-80與殼聚糖。由圖8B顯示，在發(fā)酵前48 h由于發(fā)酵處于菌體生長期，所以酶蛋白分泌較少，產(chǎn)酶量較低；菌體在發(fā)酵48 h后開始大量向外分泌蛋白，相應(yīng)的纖維素酶酶活FPA和CMCase迅速上升，BG酶活也不斷增加。96 h之后，pH趨于穩(wěn)定，菌體產(chǎn)酶能力有所下降，酶活積累速度下降，在144 h時(shí)酶活達(dá)到最高值。FPA、CMCase、BG3種酶活分別達(dá)到3.50、8.94和1.74 U/mL。與搖瓶發(fā)酵結(jié)果相比，上罐發(fā)酵初步探索的酶活與搖瓶數(shù)據(jù)相近，但并沒有較大程度提高。認(rèn)為主要原因是搖瓶參數(shù)跟上罐參數(shù)之間并不完全一致，尤其是在溶氧控制和pH控制上，有待進(jìn)一步優(yōu)化。因此后續(xù)將通過控制溶氧和pH以及觀察菌體形態(tài)相結(jié)合等策略，進(jìn)一步提高產(chǎn)酶。

本實(shí)驗(yàn)纖維素酶發(fā)酵水平與已有報(bào)道的比較結(jié)果如表7所示。目前的纖維素酶發(fā)酵碳源非常廣泛，眾多研究已從早期的纖維素及其衍生物轉(zhuǎn)向更具工業(yè)意義的天然木質(zhì)纖維素原料，如玉米秸、橡木、玉米芯等，這些基質(zhì)濃度通常在4%～6%。相對(duì)于纖維素及其衍生物發(fā)酵(>10 FPU/mL)，天然木質(zhì)纖維素基質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)酶仍較低，不足5.0 FPU/mL。本文報(bào)道的HWPRS發(fā)酵產(chǎn)酶FPA為3～4 U/mL，處于較高水平。與其它天然纖維質(zhì)原料相比，本發(fā)酵所產(chǎn)纖維素酶比酶活明顯高于同行報(bào)道，比如FPA達(dá)4～5 U/mg蛋白；另外，CMCase接近9.0 U/mL，也處于較高水平。由此可見，HWPRS發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶具有巨大的工業(yè)應(yīng)用潛力。

A-發(fā)酵參數(shù)控制；B-發(fā)酵產(chǎn)酶曲線圖8 纖維素酶5 L發(fā)酵罐發(fā)酵參數(shù)Fig.8 Cellulases fermentation in a 5 L stirred tank reactor

木質(zhì)纖維素底物含量/(g·L-1)規(guī)模纖維素酶/(U·mL-1)FPACMCaseBG蛋白含量/(mg·mL-1)文獻(xiàn)工業(yè)纖維素36搖瓶9.13-0.922.57[4]微晶纖維素42搖瓶15.883-2.32[5]AFEX-玉米秸桿6030L罐1.91.61.71.32[2]橡木30搖瓶3.21.720.86-[7]燕麥殼水解液40搖瓶2.81.73.2-[25]蒸汽爆炸橡木20搖瓶4.4--1.14[24]玉米芯10搖瓶1.53-0.612.11[8]木糖渣4030L罐5.25--1.85[26]堿化秸桿70搖瓶0.770.941.320.85[24]HWPRS50搖瓶3.678.651.760.69本研究HWPRS505L罐3.58.941.740.81本研究

3 結(jié)論

本文通過單因素實(shí)驗(yàn)與正交實(shí)驗(yàn)對(duì)里氏木霉發(fā)酵培養(yǎng)基與發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，顯著提高了纖維素酶活水平，纖維素酶FPA達(dá)到2.69 U/mL，是優(yōu)化前2.2倍。吐溫-80和乳糖等添加劑也能促進(jìn)發(fā)酵產(chǎn)酶。本文首次發(fā)現(xiàn)殼聚糖類物質(zhì)能促進(jìn)纖維素酶發(fā)酵產(chǎn)酶，使纖維素酶FPA、CMCase和BG分別提高了11%、3%和29%，分別達(dá)到3.67、8.65、1.76 U/mL，其發(fā)酵穩(wěn)定性好。結(jié)合表7，HWPRS發(fā)酵所產(chǎn)纖維素酶FPA比酶活較高，可達(dá)4～5 U/mg蛋白，其CMCase接近9.0 U/mL，也處于較高水平。確定HWPRS發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶具有巨大的工業(yè)應(yīng)用潛力。

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Cellulase production from the hot water pretreated rice straw by Trichoderma reesei Rut-C30

SU Cun-sheng1, HE Jian-long2, XIONG Peng2, YUE Chun3, YU Feng-chuan1, SUN Fu-bao1*

1(Laboratory of Industrial Biotechnology of Department of Education, School of Bitechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 2(Jiangsu Key Laboratory for Biomass-Based Energy and Enzyme Technology, School of Chemistry and Chemical Engineering, Huaiyin Normal University, Huaian 223005，China) 3(Department of Biological and Chemical Engineering, Nanyang Institute of Technology, Nanyang 473004, China)

In order to enhance the cellulase production ability of industrial strainTrichodermareeseiRut-C30, this study with hot water pretreated rice straw (HWPRS) as carbon source focused on optimization of the fermentation nutrition and condition and the supplement with some additives. The FPA of cellulase produced at our laboratory level for 168 h were 1.20 U/mL. With single-factor and orthogonal experiments, the fermentation medium was optimized as below (g/L): HWPRS 50.0, corn steel liquid 6.0, (NH4)2SO44.0, KH2PO41.0, urea 0.2, MgSO4·7H2O 0.4, CaCl20.3. And the fermentation conditions were selected as follows: pH6.0, rotation speed 220 r/min, temperature 30 ℃, inoculation sizeφ6%. Under above optimized condition, the FPA of cellulase reached 2.69 U/mL, which was double of FPA before optimization. By supplement with some additives, it was found that Tween-80 and lactose both enhanced the enzyme activity of cellulase production significantly, especially the BG activity. Initially, it was found that chitosan and its derivate facilitated cellulase fermentation, in which the chitosan effect was best. The FPA and BG activity of cellulase produced after adding 1.50 g/L chitosan reached 3.67 U/mL and 1.76 U/mL, respectively, which increased by 10% and 30% as compared to that without addition, and the CMCase reached 8.65 U/mL. The fermentation level was basically stable when enlarged to 5 L fermenter level. Thus, the cellulase FPA level studied herein was 3 times of that before the optimization from HWPRS, indicating a promising industrial future of cellulase production.

hot water pretreated rice straw (HWPRS);TrichodermareeseiRut-C30; cellulase; fermentation optimization; chitosan

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201610003

碩士研究生(孫付保副教授為通訊作者,E-mail: fubaosun@jiangnan.edu.cn)。

國家自然科學(xué)基金(21176106)；中國博士后科學(xué)基金(2015M571666)；江蘇省生物質(zhì)綠色燃料與化學(xué)品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助課題(JSBGFC14006)；河南省科技開放合作項(xiàng)目(162106000007)

2016-03-02，改回日期：2016-03-28