海南溫莪術(shù)揮發(fā)油的抑菌活性及提取工藝研究

莫崢嶸，邢福佳，楊 平，鄭彩娟

（熱帶藥用植物化學(xué)教育部重點實驗室，海南師范大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，海南 ?？?571158）

海南溫莪術(shù)揮發(fā)油的抑菌活性及提取工藝研究

莫崢嶸，邢福佳，楊 平，鄭彩娟

（熱帶藥用植物化學(xué)教育部重點實驗室，海南師范大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，海南 ?？?571158）

文章研究海南溫莪術(shù)揮發(fā)油的抑菌活性及最佳提取工藝.采用微量稀釋法測定海南溫莪術(shù)揮發(fā)油對白色念珠菌（Candida albicans）、白色葡萄球菌（Staphylococcus albus）、四聯(lián)球菌（Micrococcus tetragenus）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的抑菌活性，并與浙江溫莪術(shù)進行比較；以對白色念珠菌的抑菌活性為評價指標(biāo)，用正交試驗法研究海南溫莪術(shù)揮發(fā)油的提取工藝.結(jié)果表明：海南溫莪術(shù)揮發(fā)油的抑菌活性上優(yōu)于浙江；海南溫莪術(shù)揮發(fā)油抑菌活性成分的最佳提取工藝為：料液比1∶6（g/mL），提取1次，提取時間40 min.為海南溫莪術(shù)的開發(fā)利用提供依據(jù).

海南溫莪術(shù)；揮發(fā)油；抑菌活性；提取工藝

溫莪術(shù)是姜科姜黃屬植物溫郁金（Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling）的干燥根莖，主產(chǎn)于浙江[1-2].始載于《新修本草》，性寒、味苦、辛、歸肝、膽、心經(jīng).具有活血止痛、行氣解郁、涼血、利膽退黃的功效[3].溫莪術(shù)中主要含有揮發(fā)油、姜黃素類及多糖類成分[1].揮發(fā)油的主要活性成分為莪術(shù)醇、β-欖香烯、莪術(shù)酮及莪術(shù)二酮等.溫莪術(shù)揮發(fā)油具有抑菌作用，對白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等均有較強的抑制作用[4].

多年來國內(nèi)外學(xué)者對浙江和廣西溫莪術(shù)的研究較多，但對海南溫莪術(shù)的研究較少.王丹[5]通過比較水蒸氣蒸餾法和超臨界CO2萃取法的優(yōu)缺點來確定廣西莪術(shù)揮發(fā)油的最佳提取工藝，結(jié)果表明臨界CO2萃取的揮發(fā)油的收率高，但水蒸氣蒸餾法提取的揮發(fā)油中莪術(shù)醇的含量高.黃輝鋒等[6]研究了溫莪術(shù)揮發(fā)油與藥渣殘油的抑菌活性差別，實驗結(jié)果表明溫莪術(shù)藥渣殘油抑菌活性總體上比揮發(fā)油的抑菌活性強.本試驗通過對海南溫莪術(shù)揮發(fā)油的抑菌活性及提

取工藝進行研究，為深入開發(fā)利用該植物提供依據(jù).

1 儀器、試劑及試驗材料

立式壓力蒸汽滅菌器（上海賽洋生物科技實業(yè)有限公司，AUTOCLAVE.G154DWS）；超聲波清洗器（上海Branson公司，SB2200）電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海森信實驗儀器有限公司，DRP—9052）；酶標(biāo)儀（美國BioTek公司，ELx800）；試劑為分析純.供試菌種：白色葡萄球菌（Staphylococcus albus）、四聯(lián)球菌（Micrococcus tetragenus）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、均由海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供；白色念珠菌（Candida albicans）由海南醫(yī)學(xué)院提供；海南溫莪術(shù)由海南回元堂藥業(yè)有限公司提供.

2 方法和結(jié)果

2.1 溫莪術(shù)揮發(fā)油的提取

揮發(fā)油的提取方法主要有水蒸氣蒸餾法、溶劑法、微波法、超臨界流體萃取法等，溶劑法是根據(jù)揮發(fā)油的親脂性，用有機溶劑如石油醚等提取[7].本試驗是以石油醚（沸程60～90℃）為提取溶劑，用超聲法提取揮發(fā)油，具體操作如下：稱取溫莪術(shù)的干燥根莖50g，用250 mL石油醚超聲提取20 min，抽濾，濾渣再用250 mL石油醚超聲提取20 min，合并濾液，回收溶劑，得到溫莪術(shù)揮發(fā)油.取6 mg揮發(fā)油溶解于1 mL二甲基亞砜（DMSO）配成濃度為6 mg/mL的溶液，置于小離心管中，備用.

2.2 試驗菌的準(zhǔn)備

LB培養(yǎng)液的配制[8]：取胰蛋白胨20g，酵母提取粉10g，氯化鈉20g，加去離子水配成2 L培養(yǎng)液.高壓蒸汽滅菌20 min.選取白色念珠菌、白色葡萄球菌、四聯(lián)球菌、金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌、大腸桿菌及枯草芽孢桿菌在營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)上傳代培養(yǎng)一次后，再將它們分別接種至LB培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)12 h，備用.

2.3 抑菌活性的初步篩選[9]

分別配1mg·mL-1的環(huán)丙沙星溶液和氟康唑溶液，備用.取U型96孔微量稀釋板一塊，進行編號.取100μL已培養(yǎng)的細(xì)菌菌種用培養(yǎng)液進行稀釋（稀釋度為1∶1000）.用無菌移液槍將稀釋的菌液198μL和2μL溫莪術(shù)揮發(fā)油溶液（DMSO配制），分別加入96孔板的1-7列孔內(nèi);將稀釋的菌液198μL，2μLDMSO溶液加入第11列孔內(nèi)（菌對照）；將稀釋的菌液198μL，2μL環(huán)丙沙星溶液或氟康唑溶液加入第12列孔內(nèi)（藥物對照），每個樣品設(shè)兩個平行孔.震蕩混合后37℃培養(yǎng)24 h，用酶標(biāo)儀在630 nm處測其吸光度值進行初步篩選.

結(jié)果表明：海南溫莪術(shù)揮發(fā)油對白色念珠菌、白色葡萄球菌、四聯(lián)球菌、金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌、大腸桿菌及枯草芽孢桿菌都有抑制作用.而浙江溫莪術(shù)揮發(fā)油只對白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌及大腸桿菌有抑制作用.

2.4 最小抑菌濃度的測定[9]

將具有抑菌活性的揮發(fā)油溶液在96孔微量稀釋板內(nèi)作二倍遞減濃度稀釋，然后接種稀釋菌液，其中留第11列孔作為菌對照，第12列孔為藥物對照，震蕩混勻后置37℃溫培養(yǎng)24 h，用酶標(biāo)儀在630 nm處測其吸光度值.結(jié)果見表1.

從表1可得出海南溫莪術(shù)揮發(fā)油對供試菌種的最小抑菌濃度.由于揮發(fā)油成分復(fù)雜，因此所配制溶液的濃度均比較高.結(jié)果表明：海南溫莪術(shù)揮發(fā)油對白色念珠菌、白色葡萄球菌、四聯(lián)球菌、蠟狀芽孢桿菌及枯草芽孢桿菌的抑制效果優(yōu)于浙江.

表1 溫莪術(shù)揮發(fā)油的抑菌活性Tab.1 Antimicrobial activity of volatile oils in Cultivated Curcuma wenyujin

2.5 海南溫莪術(shù)揮發(fā)油抑菌活性成分的提取工藝研究[10]

首先進行單因素試驗，選取料液比（A）、提取次數(shù)（B）、提取時間（C）為工藝考察對象.根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，再采用正交試驗法，其正交試驗設(shè)計見表2.并按2.3試驗方法測定海南溫莪術(shù)揮發(fā)油對白色念珠菌的抑菌活性，平行測定3次.根據(jù)抑菌率確定最佳提取工藝，其正交試驗結(jié)果統(tǒng)計見表3.抑菌

率按下列公式計算，其中Α0為加DMSO的菌液平均吸光度值，Αt為加溫莪術(shù)揮發(fā)油的菌液平均吸光度值.

表2 正交試驗設(shè)計Tab.2Orthogonal experimental designs

表3 正交試驗結(jié)果Tab.3Orthogonal experimental results

以正交試驗法優(yōu)選了海南溫莪術(shù)揮發(fā)油抑菌活性成分的提取工藝，結(jié)果如表3所示.由極差大小得知各因素對提取效果的影響，順序依次為提取時間、料液比和提取次數(shù).根據(jù)正交試驗法結(jié)果，確定最佳提取工藝為：料液比1∶6，提取1次，提取時間40 min.

3 結(jié)論

根據(jù)正交試驗法結(jié)果，海南溫莪術(shù)揮發(fā)油抑菌活性成分的最佳提取工藝為：料液比1∶6，提取次數(shù)一次，提取時間40 min.本研究為海南溫莪術(shù)的開發(fā)利用提供依據(jù).

[1]胡潤淮，邵清松.溫郁金化學(xué)成分研究進展[J].時珍國醫(yī)國藥，2007，18（7）：1773-1775.

[2]李愛群，胡學(xué)軍，鄧遠輝.溫莪術(shù)揮發(fā)油的成分[J].中草藥，2001，32（9）：782-783.

[3]方露敏，黃真.溫郁金的研究進展[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2008，26（9）：1998-2000.

[4]張煒，劉雯，覃潔萍.中藥莪術(shù)的研究概況[J].廣西科學(xué)院學(xué)報，2006，22（S）：481-486.

[5]王丹.廣西莪術(shù)揮發(fā)油的最佳提取工藝研究[J].湖北中醫(yī)雜志，2013，35（12）：68-70.

[6]黃輝鋒，鄭彩娟，陳光英，等.莪術(shù)油與藥渣殘油的化學(xué)成分和抗菌活性比較[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2015，21（20）：67-71.

[7]溫悅.揮發(fā)油提取方法研究概況[J].中國藥業(yè)，2010，19（12）：84-85.

[8]吳建英，宋建新，曹金萍.多重PCR快速檢測3種食源性致病菌[J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué)，2014，36（2）：146-149.

[9]王燕，陳文豪，陳光英，等.海南染木樹葉中的蒽醌成分研究[J].有機化學(xué)，2014，34：522-525.

[10]莫崢嶸，鐘哲君，黃宇志，等.海南高良姜揮發(fā)油的超臨界CO2萃取工藝研究[J].食品工業(yè)，2013，34（6）：103-104.

責(zé)任編輯：劉 紅

Study on Antimicrobial Activity and Extraction Technology of Volatile Oils in Cultivated Curcuma Wenyujin Located in Hainan Province

MO Zhengrong，XING Fujia，Yang Ping，ZHENG Caijuan
（Key Laboratory of Tropical Medicinal Plant Chemistry of Ministry of Education，School of Chemistry and Chemical Engineering，Hainan Normal University，Haikou 571158，China）

This paper studies the antimicrobial activity and extraction technology of volatile oils in cultivated Curcuma wenyujin in Hainan province,China.Antimicrobial activity of volatile oils in cultivated C.wenyujin in Hainan province is studied by microdilution method.Then by comparing with cultivated C.wenyujin in Zhejiang province;the paper uses Candida albicans as test-bacteria to evaluate antimicrobial capacity,and studies extraction technology of volatile oils in cultivated C. wenyujin in Hainan province by orthogonal experiment.The antimicrobial activity of volatile oils in cultivated C.wenyujin in Hainan province is stronger than those in Zhejian province.The best conditions of extraction are as follows:the ratio of material and solvent is 1∶6,the extracting times is 1,and extracting time is 40 min.The results provide basis for the development of cultivated C.wenyujin in Hainan province.

Cultivated Curcuma wenyujin in Hainan；volatile oils；antimicrobial activity；extraction technology

R 284.2

A

1674-4942（2016）03-0274-03

2016-05-13

海南省應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)專項（ZDXM20130059)；海南省自然科學(xué)基金項目（213020）