PLK1抑制劑對骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制研究

黃崇新 呂波 王躍 龐健 郝鵬 劉萍

·實驗研究論著·

PLK1抑制劑對骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制研究

黃崇新 呂波 王躍 龐健 郝鵬 劉萍

目的 探討Polo樣激酶1（polo?like kinase 1,PLK1）的小分子抑制劑NMS?P937對骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制，并分析PLK1蛋白水平與臨床骨肉瘤患者預(yù)后的關(guān)系。方法 本研究采用HOS、Saos?2骨肉瘤細(xì)胞系以及人成骨細(xì)胞系HOB?C作為實驗細(xì)胞，通過Western Blot和熒光定量PCR檢測PLK1在不同細(xì)胞系中蛋白和mRNA的表達(dá)水平；分別用不同濃度（0.01、0.05、0.1、0.2、0.5μmol/L）的NMS?P937干預(yù)骨肉瘤細(xì)胞，采用MTT比色法檢測細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度NMS?P937對骨肉瘤細(xì)胞系細(xì)胞周期的調(diào)控作用；免疫共沉淀技術(shù)檢測PLK1蛋白與p53蛋白的相互作用情況；通過對骨肉瘤患者的組織芯片分析及隨訪，分析PLK1蛋白表達(dá)水平與臨床預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果 研究結(jié)果表明與人成骨細(xì)胞系HOB?C細(xì)胞相比，HOS、Saos?2骨肉瘤細(xì)胞系中PLK1蛋白和mRNA表達(dá)水平更高；NMS?P937可有效抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖，且經(jīng)過NMS?P937處理后，S、G2/M期的骨肉瘤細(xì)胞Saos?2顯著升高，G0/G1期細(xì)胞顯著降低；細(xì)胞免疫共沉淀結(jié)果表明PLK1與p53蛋白存在相互作用；生存分析顯示PLK1的表達(dá)水平與患者生存率呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論 PLK1抑制劑可抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖，這可能與PLK1通過調(diào)節(jié)p53蛋白參與細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換過程有關(guān)，此外，PLK1蛋白水平的高度表達(dá)與患者不良預(yù)后密切相關(guān)，提示PLK1蛋白可作為臨床潛在治療骨肉瘤患者的有效靶點。

骨肉瘤；Polo樣激酶1；蛋白激酶抑制劑；p53；生存分析

骨肉瘤是一種好發(fā)于兒童和青少年的原發(fā)性惡性骨腫瘤，惡性程度高且進(jìn)展迅速。傳統(tǒng)治療方法包括外科手術(shù)切除及輔助化療，但易復(fù)發(fā)。目前人們在治療骨肉瘤、改善患者生存率方面尚未取得長足的進(jìn)歩。因此，探尋新的骨肉瘤治療靶標(biāo)顯得尤為迫切與重要。

Polo樣激酶1（polo?like kinase 1，PLK1）是定位于人類染色體16p12上的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是Polo樣激酶家族的重要成員之一，于1994年由Golsteyn等［1］最先報道。PLK1參與細(xì)胞周期各檢測點的活動，可以在M期促進(jìn)細(xì)胞的增殖［2］。目前研究發(fā)現(xiàn)，PLK1在包括肉瘤在內(nèi)的許多惡性腫瘤中表達(dá)增高［3，4］，與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展預(yù)后關(guān)系密切［5］；同時，針對PLK1的shRNA或siRNA可抑制腫瘤細(xì)胞生長并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［6，7］，這也在Horning等［8］對橫紋肌肉瘤的研究中得到了驗證。

本研究中，我們分析了PLK1蛋白在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)，通過應(yīng)用小分子抑制劑NMS?P937抑制PLK1的表達(dá)，探討了以下內(nèi)容：①NMS?P937對骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響；②NMS?P937對骨肉瘤細(xì)胞周期的調(diào)控；③NMS?P937調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞周期的分子機(jī)制；④PLK1蛋白水平與臨床骨肉瘤患者預(yù)后的關(guān)系。以期為臨床使用NMS?P937等腫瘤抑制劑治療癌癥提供理論依據(jù)，闡明NMS?P937調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞周期的分子機(jī)制，為骨肉瘤患者的預(yù)后情況提供潛在的臨床指標(biāo)。

材料與方法

一、臨床樣本的收集

36例受試骨肉瘤患者（發(fā)生于四肢的原發(fā)、低分化骨肉瘤，患者年齡＜40歲）均得到病理診斷確診，均簽署知情同意書，該研究經(jīng)四川省人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)執(zhí)行。

二、試劑及儀器

人骨肉瘤細(xì)胞系HOS、Saos?2及人成骨細(xì)胞系HOB?C（ATCC，美國），IMDM成骨細(xì)胞專用培養(yǎng)基（PromoCell，德國），胎牛血清、青霉素-鏈霉素溶液、胰蛋白酶-EDTA溶液、L-谷氨酰胺、PBS（Gibco，美國），PLK1小分子抑制劑NMS?P937（Selleck，美國），兔抗人單克隆PLK1抗體、鼠抗人GAPDH抗體（Cell Siganling Technologies，美國），總RNA提取試劑盒（Omega Bio?Tek，美國），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑SYBR?（TaKaRa，日本），MTT細(xì)胞增殖檢測試劑盒、支原體染色檢測試劑盒（碧云天，中國），羊抗鼠和羊抗兔辣根過氧化物酶二抗，正常兔或鼠IgG抗體（Bio?Rad，美國）；SuperSignalWestPico化學(xué)熒光底物（Pierce，美國），F(xiàn)uGENE轉(zhuǎn)染試劑（Pro?mega，美國），PVDF膜、蛋白G瓊脂糖（Sigma，美國）。

實時熒光定量PCR系統(tǒng)（ABI公司，美國），電泳儀、電轉(zhuǎn)儀、PCR儀（Bio?rad公司，美國），流式細(xì)胞儀（BD公司，美國），倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）；二氧化碳培養(yǎng)箱、冷凍離心機(jī)、酶標(biāo)儀、Nano?Drop分光光度計（Thermo公司，美國）。

三、細(xì)胞培養(yǎng)及分組

（一）細(xì)胞培養(yǎng)

骨肉瘤細(xì)胞株HOS、Saos?2培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，成骨細(xì)胞HOB?C培養(yǎng)于含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基中。置于37℃，5% CO2以及適宜濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長，在細(xì)胞狀態(tài)良好且長滿80%～90%時根據(jù)需要按照1∶3～1∶5的比例傳代。細(xì)胞系經(jīng)檢測確認(rèn)無支原體污染。

（二）細(xì)胞分組

細(xì)胞分組主要根據(jù)NMS?P937的濃度，各組中NMS?P937的濃度分別為0.01、0.05、0.1、0.2、0.5 μmol/L。

四、三種細(xì)胞中PLK1的表達(dá)水平

培養(yǎng)上述細(xì)胞至生長對數(shù)期后，收集細(xì)胞提取總RNA和蛋白。

各取1μg RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，每個處理采取三重復(fù)原則，進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)，記錄數(shù)據(jù)。

收集各組細(xì)胞后，4度裂解細(xì)胞30min，進(jìn)行蛋白定量，余下蛋白液中加入loading buffer，于95℃水浴中10min。根據(jù)蛋白定量的結(jié)果上樣，80 V電泳30min，120 V電泳至指示劑到分離膠底層，轉(zhuǎn)為恒壓100 V轉(zhuǎn)膜90min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，5%的脫脂牛奶封閉1 h。根據(jù)蛋白marker的位置孵育一抗，4℃過夜。次日用PBST溶液洗PVDF膜3次，每次5min；孵育相應(yīng)二抗，室溫1 h，PBST洗PVDF膜3次，每次7min?；旌习l(fā)光液，與PVDF膜充分反應(yīng)，壓片適當(dāng)時間后進(jìn)行曝光。

五、NMS?P937對骨肉瘤細(xì)胞的作用

（一）對PLK1的抑制作用

收集不同濃度NMS?P937處理過的Saos?2細(xì)胞至EP管中，采用Western Blot分析PLK1的蛋白表達(dá)水平變化，方法同步驟四。依據(jù)曝光的片子進(jìn)行蛋白灰度處理分析，并比較蛋白水平的差異。

（二）對骨肉瘤細(xì)胞增殖情況的影響

取生長狀態(tài)良好且處于對數(shù)生長期的HOS和Saos?2細(xì)胞，用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基將細(xì)胞制備成每毫升含2×104個細(xì)胞的懸液，每孔200 μl，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后，依次加入含不同濃度NMS?P937的培養(yǎng)基，用完全培養(yǎng)基作為空白對照。進(jìn)一步培養(yǎng)24 h后，每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20μl，繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)。棄掉孔內(nèi)培養(yǎng)液上清，每孔加入150μl DMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分融解。在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上570 nm測定吸光度A值，繪制不同濃度抑制劑處理后的細(xì)胞增殖曲線。

（三）對細(xì)胞周期的影響

取對數(shù)生長期的Saos?2細(xì)胞，按每毫升1×106個細(xì)胞的濃度分別接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，實驗組分別加入不同濃度的NMS?P937（終濃度分別為0.01、0.05、0.1、0.2、0.5μmol/L），對照組加入與NMS?P937等量的培養(yǎng)液。24 h后收集細(xì)胞，并用75%冰乙醇于-20℃固定，然后在含溴化乙啶（50mg/L）和RNase（10mg/L）的PBS緩沖液中室溫避光孵育30min，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。用ModFit LT軟件（Verity Software House，美國）分析G0/G1、S、G2/ M各期細(xì)胞所占百分比，重復(fù)實驗3次。

六、PLK1與p53的免疫共沉淀分析

（一）質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染

以pcDNA3為載體，來源于原代肝母細(xì)胞瘤的cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增帶FLAG標(biāo)簽的人pcD?NA3?FLAG?PLK1載體。上游引物序列為5'?CC? GCTCGAGAGTGCTGCAGTGACTGCAGGGAAG?3'，下游引物序列為5'?CTAGTCTAGATTAGGAG?GCCTTGAGACGGTTGCT?3'。構(gòu)建成功的載體經(jīng)測序驗證無誤后通過FuGENE轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染Saos?2細(xì)胞，收集用于后續(xù)的免疫共沉淀實驗。

（二）免疫共沉淀

上述收集的Saos?2細(xì)胞用細(xì)胞裂解液進(jìn)行充分裂解，4℃下以最大轉(zhuǎn)速離心10min，留取適量蛋白液作為陽性對照，余下蛋白液依據(jù)細(xì)胞體積分為兩等份，一部分加入抗體原液（p53或FLAG），另一部分加入正常兔或鼠IgG抗體，4℃搖床過夜孵育；次日，兩部分中各加入蛋白G瓊脂糖30μl，4℃搖床孵育2 h；離心收集瓊脂糖珠，適量裂解緩沖液，4℃搖床洗3次，每次5min；在沉淀中加入30μl的loading buffer，95℃煮10min。而后進(jìn)行Western Blot的實驗，孵育一抗為待測稀釋抗體（PLK1或p53）。

七、PLK1的表達(dá)水平與骨肉瘤患者臨床預(yù)后的關(guān)系

采集臨床骨肉瘤患者的骨肉瘤組織芯片信息，依據(jù)PLK1的表達(dá)水平，患者被分為高、中、低三組，分析PLK1表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系。

八、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件（SPSS公司，美國）分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，蛋白水平的兩兩比較采用獨立樣本t檢驗，細(xì)胞周期的比較采用單因素方差分析，其中的兩兩比較采用q檢驗。Kapla?Meier方法繪制生存曲線，PLK1高表達(dá)組和低表達(dá)組之間的比較采用log?rank檢驗。檢驗水準(zhǔn)α值取雙側(cè)0.05。

結(jié)果

一、PLK1在骨肉瘤細(xì)胞系中高表達(dá)

無論是在mRNA水平還是蛋白水平，與正常人成骨細(xì)胞系（HOB?C）相比，PLK1在HOS、Saos?2細(xì)

胞中呈高表達(dá)狀態(tài)（圖1 a、b）。

圖1 PLK1在骨肉瘤細(xì)胞系HOS和Saos?2中高表達(dá)

二、NMS?P937對PLK1的抑制作用

Western Blot結(jié)果顯示PLK1的表達(dá)水平隨著NMS?P937濃度升高逐漸降低（圖2 a）；蛋白灰度分析表明，除0.01μmol/L時，其余濃度的NMS?P937均可顯著降低Saos?2細(xì)胞中PLK1的表達(dá)水平，且該抑制作用呈劑量依賴性（圖2 b）。

圖2 NMS?P937對PLK1的抑制作用（與NMS?P937濃度為0時相比，*P＜0.05）

三、NMS?P937抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖

隨著NMS?P937濃度的提升，HOS和Saos?2細(xì)胞的增殖受到抑制，抑制效果呈現(xiàn)劑量依賴性。NMS?P937抑制HOS和Saos?2細(xì)胞增殖的最低有效濃度均為0.1μmol/L；以最高濃度的NMS?P937處理72 h后，抑制效果消失，故其最長有效抑制時間為72 h（圖3）。

圖3 不同濃度NMS?P937對骨肉瘤細(xì)胞HOS與Saos?2增殖的影響

四、NMS?P937對骨肉瘤細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，NMS?P937作用Saos?2細(xì)胞后，G0/G1期細(xì)胞含量降低，S期與G2/M期細(xì)胞比例則明顯增加，且隨著處理濃度的增加，其G2/M期細(xì)胞含量逐漸增加。除0.01μmol/L組外，其余各組與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05，表1）。其中NMS?P937的最低有效濃度為0.05μmol/L。

五、p53蛋白和PLK1蛋白的相互作用

免疫共沉淀實驗結(jié)果表明，PLK1與p53之間存在相互作用（圖4）。當(dāng)以p53抗體進(jìn)行免疫沉淀實驗，F(xiàn)LAG蛋白抗體為孵育一抗時，Western Blot結(jié)果顯示，p53蛋白可與FLAG?PLK1蛋白相互作用（圖4a）；當(dāng)以FLAG抗體進(jìn)行免疫沉淀，孵育一抗為p53蛋白抗體時，Western Blot結(jié)果顯示FLAG?PLK1蛋白與p53蛋白存在相互作用（圖4 b）。

六、PLK1表達(dá)水平與骨肉瘤患者臨床預(yù)后相關(guān)

通過骨肉瘤組織芯片信息分析PLK1蛋白表達(dá)水平與骨肉瘤患者臨床預(yù)后之間的關(guān)系；依據(jù)PLK1的表達(dá)水平將36例患者分為低、中、高三組。在這36例患者的組織芯片中，其中14例（38.9%）的PLK1表達(dá)水平為低，10例（27.8%）的PLK1表達(dá)水平為中，12例（33.3%）的PLK1表達(dá)水平為高。Kaplan?Meier分析表明PLKl表達(dá)水平低的患者生存率明顯高于較PLK1表達(dá)水平高的患者（P=0.03，圖5）。

表1 不同濃度NMS?P937干預(yù)Saos?2細(xì)胞24 h后對細(xì)胞周期的影響

圖4 PLK1與p53在細(xì)胞內(nèi)的相互作用

圖5 PLK1表達(dá)高低與骨肉瘤患者臨床生存率相關(guān)性

討論

人類激酶組由至少600種不同的蛋白激酶組成，其中許多激酶如PI3K、AKT和mTOR等在不同肉瘤組織中持續(xù)高表達(dá)，且蛋白水平隨著腫瘤的進(jìn)展而升高［9?11］。蛋白激酶通過磷酸化激活蛋白，抑制這些蛋白激酶表達(dá)則可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長和增殖［12］，將上述蛋白激酶作為治療靶點可能開辟治療各種肉瘤的新方法。

PLK1是蛋白激酶家族中的一員，結(jié)構(gòu)上高度保守，N末端含有一個激酶結(jié)構(gòu)域，C末端具有保守的Polo?box domain，PLK1蛋白在腫瘤組織中高度表達(dá)，表達(dá)水平與腫瘤進(jìn)展、預(yù)后等密切相關(guān)［13］，現(xiàn)如今針對PLK1蛋白的蛋白酶抑制劑廣泛應(yīng)用于腫瘤治療或基礎(chǔ)實驗［14］。NMS?P937是一種新型的PLK1蛋白抑制劑，它具有藥效良好、服用簡易等優(yōu)勢，已在多個臨床前實驗?zāi)Ｐ椭凶C實其對腫瘤的抑制作用［15］。

在本研究中，我們使用了兩種骨肉瘤細(xì)胞系（HOS與Saos?2），無論在蛋白還是mRNA水平上，其中PLK1的表達(dá)均高于人成骨細(xì)胞系（HOB?C）。這一結(jié)果提示PLK1蛋白水平的高表達(dá)可能與腫瘤細(xì)胞的生長或侵襲等相關(guān)；在對骨肉瘤細(xì)胞應(yīng)用NMS?P937抑制劑后，通過Western Blot和熒光定量PCR實驗，我們發(fā)現(xiàn)PLK1蛋白和基因水平均出現(xiàn)了降低，抑制效果良好，提示NMS?P937可能通過抑制PLK1基因的表達(dá)水平進(jìn)而抑制蛋白的表達(dá)。

同時我們發(fā)現(xiàn)NMS?P937對骨肉瘤細(xì)胞的細(xì)胞增殖及周期也有一定的影響。實驗結(jié)果顯示，經(jīng)過不同濃度抑制劑處理后，骨肉瘤細(xì)胞的增殖受到了抑制，細(xì)胞周期停滯在G2/M期，提示我們骨肉瘤細(xì)胞的增殖抑制可能是由于PLK1蛋白調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞周期，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。Sero等［16］的研究報道證實，PLK1與中心體復(fù)制、紡錘體形成、染色體分離以及細(xì)胞質(zhì)分裂等一系列細(xì)胞有絲分裂事件聯(lián)系密切，猜測PLK1蛋白參與細(xì)胞周期調(diào)控，而我們的研究結(jié)果在骨肉瘤細(xì)胞中與之相對應(yīng)。

p53作為一種重要的腫瘤抑制基因，在絕大多數(shù)腫瘤中高度表達(dá)，人類腫瘤中有50%以上都是由p53基因的缺失造成的［17，18］，而相關(guān)文獻(xiàn)報道PLK1可抑制p53的活性［19］，在PLK1與p53的相互作用中，兩者各以一段特殊的DNA序列作為結(jié)合區(qū)。因此，筆者進(jìn)行了免疫共沉淀實驗，驗證二者之間的相互作用關(guān)系，免疫共沉淀結(jié)果顯示，PLK1蛋白和p53蛋白存在相互作用，提示p53可能是PLK1的一個直接作用靶點，筆者猜測PLK1可能通過磷酸化p53抑制其一部分的生物活性，進(jìn)而抑制p53發(fā)揮檢驗點蛋白和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)

胞的異常增殖和癌癥發(fā)生，然而，其中的具體機(jī)制有待進(jìn)一步的探索。

最后，通過繪制不同PLK1蛋白表達(dá)水平的臨床骨肉瘤患者生存曲線，筆者發(fā)現(xiàn)PLKl蛋白表達(dá)水平與患者5年生存率呈負(fù)相關(guān)（P=0.03，圖4），進(jìn)一步提示PLK1蛋白水平的高表達(dá)可能與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，這與已報道的PLK1在小細(xì)胞肺癌患者中的表型是一致的［20］，然而，PLK1蛋白水平的高度表達(dá)是否是骨肉瘤或肺癌細(xì)胞中所特有的特征還有待確定。

然而，此次研究中仍有不足。PLK1蛋白與p53蛋白相互作用驗證一部分為FLAG?PLK1外源性蛋白水平上的驗證，二者在內(nèi)源性蛋白的相互作用未曾探討，此外，二者作用的方式是直接還是間接的模式也未有驗證；其次，在PLK1蛋白水平表達(dá)發(fā)生變化后，未對p53磷酸化和總的蛋白水平進(jìn)行驗證，尚不能闡明PLK1蛋白對p53蛋白的調(diào)控具體機(jī)制；最后，筆者收集的進(jìn)行臨床樣本數(shù)目不足，僅探討了骨肉瘤患者生存率與PLK1蛋白水平的表達(dá)，未對腫瘤分型或者PLK1蛋白在不同腫瘤患者中分析等進(jìn)行探索，臨床數(shù)據(jù)不夠充分。

綜上所述，我們的研究結(jié)果表明PLK1蛋白可能通過抑制p53蛋白的活性，從而調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞的周期，進(jìn)而抑制瘤細(xì)胞的增殖，而研究所用的NMS?P937小分子抑制劑顯著抑制了PLK1蛋白水平的表達(dá)和骨肉瘤細(xì)胞的增殖，提示PLK1蛋白可作為骨肉瘤治療的潛在靶標(biāo)進(jìn)行開發(fā)，而其小分子抑制劑將來亦可在人類腫瘤尤其是骨肉瘤臨床試驗性治療中的得到檢驗；此外，臨床骨肉瘤患者預(yù)后良好可能與PLK1蛋白水平的低表達(dá)相關(guān)，也未臨床預(yù)測骨肉瘤患者預(yù)后提供一個潛在的方向。

［1］Golsteyn RM,Schultz SJ,Bartek J,et al.Cell cycle analysis and chromosomal localization of human Plk1,a putative homologue of themitotic kinases Drosophila polo and Saccharomyces cerevisiae Cdc5［J］.JCellSci,1994,107(Pt6):1509?1517.

［2］Craig SN,WyattMD,Mclnnes C.Current assessmentof polo?like kinases as anti?tumor drug targets［J］.Expert Opin Drug Discov, 2014,9(7):773?789.

［3］Gjertsen BT,Sch?ffski P.Discovery and development of the Polo?like kinase inhibitor volasertib in cancer therapy［J］.Leukemia, 2015,29(1):11?19.

［4］Holland AJ,Cleveland DW.Polo?like kinase 4 inhibition:a strategy for cancer therapy?［J］.Cancer Cell,2014,26(2):151?153.

［5］Zhang XG,Lu XF,Jiao XM,etal.PLK1 gene suppresses cell inva? sion of undifferentiated thyroid carcinoma through the inhibition of CD44v6,MMP?2 and MMP?9［J］.Exp TherMed,2012,4(6):1005?1009.

［6］Zhao CL,Ju JY,GaoW,et al.Downregulation of PLK1 by RNAi attenuates the tumorigenicity of esophageal squamous cell carci?noma cells via promoting apoptosis and inhibiting angiogenesis［J］.Neoplasma,2015,62(5):748?755.

［7］McCarroll JA,Dwarte T,Baigude H,etal.Therapeutic targeting of polo?like kinase 1 using RNA?interfering nanoparticles(iNOPs)for the treatmentofnon?small cell lung cancer［J］.Oncotarget,2015,6 (14):12020?12034.

［8］Horning JL,Sahoo SK,Vijayaraghavalu S,et al.3?D tumormodel for in vitro evaluation of anticancer drugs［J］.Mol Pharm,2008,5 (5):849?862.

［9］Bittinger S,Alexiadis M,Fuller PJ.Expression status and muta?tional analysis of the PTEN and P13K subunit genes in ovarian granulosa cell tumors［J］.Int JGynecol Cancer,2009,19(3):339?342.

［10］Tsutsui S,Matsuyama A,Yamamoto M,et al.The Akt expression correlates with the VEGF?A and?C expression as well as the microvessel and lymphatic vessel density in breast cancer［J］. OncolRep,2010,23(3):621?630.

［11］Chuang WY,Chang YS,Chao YK,et al.Phosphorylated mTOR expression correlates with podoplanin expression and high tumor grade in esophageal squamous cell carcinoma［J］.Int JClin Exp?Pathol,2015,8(10):12757?12765.

［12］Kim JH,Choi SY,Kang BH,et al.AMP?activated protein kinase phosphorylates CtBP1 and down?regulates its activity［J］.Biochem BiophysRes Commun,2013,431(1):8?13.

［13］張瑞濤,史惠蓉,任芳,等.PLK1和P53蛋白在卵巢上皮性癌中的表達(dá)及其意義［J］.中國臨床醫(yī)師雜志(電子版),2014,8(8): 1432?1436.

［14］Gutteridge RE,Ndiaye MA,Liu X,et al.Plk1 inhibitors in cancer therapy:from laboratory to clinics［J］.Mol Cancer Ther,2016,15 (7):1427?1435.

［15］Valsasina B,Beria I,AlliC,etal.NMS?P937,an orally available, specific small?molecule polo?like kinase 1 inhibitorwith antitumor activity in solid and hematologic malignancies［J］.Mol Cancer Ther,2012,11(4):1006?1016.

［16］Sero V,Tavanti E,Vella S,et al.Targeting polo?like kinase 1 by NMS?P937 in osteosarcoma cell lines inhibits tumor cell growth and partially overcomes drug resistance［J］.Invest New Drugs, 2014,32(6):1167?1180.

［17］柴成國,張建軍,李寧,等.P53、C?MYC和BCL?6基因異常在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤中的臨床意義［J］.中國實驗血液學(xué)雜志, 2016,24(1):89?93.

［18］尹肖云,喬麗雅,王紅英,等.PTEN基因和P53基因在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及意義［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2014,14(14):2628?2631.

［19］Ando K,Ozaki T,Yamamoto H,etal.Polo?like kinase 1(Plk1)in?hibits p53 function by physical interaction and phosphorylation［J］.JBiolChem,2004,279(24):25549?25561.

［20］Yoon HE,Kim SA,ChoiHS,etal.Inhibition of Plk1 and Pin1 by 5'?nitro?indirubinoxime suppresses human lung cancer cells［J］. Cancer Lett,2012,316(1):97?104.

Effect of PLK 1 inhibitor on proliferation of osteosarcoma cells and itsmechanism.

HUANGChongxin*, LYU Bo,WANGYue,PANG Jian,HAOPeng,LIU Ping.*DepartmentofOrthopaedics,Sichuan Academy ofMedi?cal Sciences&Sichuan ProvincialPeople’sHospital,Chengdu 610072,China

LYU Bo,E?mail:lnter_1@163.com

Objective To investigate the effect and mechanism of NMS?P937,a smallmolecule inhibitor of PLK1 on the proliferation of human osteosarcoma cells,and the relationship between the level of PLK1 and the prognosis of patientswith osteosarcoma.M ethods In this study,HOS,Saos?2 osteosarcoma cell lines and human osteoblastic cell line HOB?C were used as experimental samples.The protein and mRNA levelsof PLK1 in various cell lineswere detected byWestern blottingand q?PCR respectively.Differentconcen?trations(0.01,0.05,0.1,0.2,0.5mol/L)of NMS?P937 were used to interfere osteosarcoma cells respectively. The inhibitory effects of NMS?P937 on proliferation were estimated by virtue of MTT assay,and regulation of cell cycle by NMS?P937 was verified applying flow cytometry.Association between PLK1 and p53 protein was tested by co?immunoprecipitation technology.Relationship between clinical prognosis and PLK1 protein expression levelwas analyzed through tissue array information by Kaplan?Meier.Results Our results indi?cated thatPLK1 protein andmRNA expression levelswere higher in HOSand Saos?2 cells than in HOB?c cells. The NMS?P937 inhibitor could effectively suppress the PLK1 expression level.Through treatmentwith NMS?P937 inhibitor,the number of Saos?2 cells in Sand G2/M phaseswas elevated significantly and that in G0/G1 phase decreased evidently.Co?immunoprecipitation indicated association between PLK1 and p53 protein.Sur?vival analysis showed a negative correlation between PLK1 protein expression leveland patients’survival rate. Conclusion The application of PLK1 inhibitor can inhibit the proliferation of osteosarcoma cells,whichmay be associated with the negative role of PLK1 in regulating p53 involved in cell cycle transformation.Besides, high PLK1 protein expression level affects patients’prognosis,indicating PLK1 protein may exert potential

Osteosarcoma;Polo?like kinase1;Protein kinase inhibitors;p53;Survivalanalysis

2016?02?19）

10.3969/j.issn.1674?8573.2016.05.014

國家自然科學(xué)青年基金（81300964）

610072 成都，四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院骨科（黃崇新、呂波、王躍、龐健、郝鵬）；山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院（劉萍）

呂波，E?mail：lnter_1@163.com

target role in treating clinicalosteosarcoma patients.