雞SP-A在293T細胞中的表達及免疫學檢測

黃 琪，汪 凱，涂 健，潘 玲，祁克宗，李澤君，陳鴻軍，劉紅梅

（1. 安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，合肥 230036；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

·研究論文·

雞SP-A在293T細胞中的表達及免疫學檢測

黃 琪1,2，汪 凱1,2，涂 健1，潘 玲1，祁克宗1，李澤君2，陳鴻軍2，劉紅梅1

（1. 安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，合肥 230036；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

為表達雞肺表面活性蛋白A（chicken palmonary surfactant protein A，cSP-A）基因，本研究擴增去除終止子的cSP-A，通過Nhe I和Apa I雙酶切，連接進入真核表達載體pcDNA3.1/myc-His(-)A中，構(gòu)建獲得重組載體pcSP-A；同時，將cSP-A和gfp基因按Nhe I-BamH I和BamH I-Apa I分別連接至pcDNA3.1/myc-His(-)A載體中，構(gòu)建獲得融合表達載體pcSP-A-GFP。通過脂質(zhì)體法將這兩類真核載體瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞，48 h 4%多聚甲醛固定細胞，利用cSP-A特異性鼠多抗進行間接免疫熒光，于倒置熒光顯微鏡下觀察cSP-A表達和亞細胞定位情況，然后收獲細胞進行Western blot檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，cSP-A在細胞質(zhì)中表達，pcSP-A和pcSP-A-GFP融合蛋白的相對分子量分別約為30 kDa和55 kDa。上述研究結(jié)果為進一步研究cSP-A的功能奠定了基礎(chǔ)。

雞肺表面活性蛋白A；真核表達；檢測

先天性免疫防御系統(tǒng)是機體抵抗病原體入侵的第一道防線。先天性免疫反應的主要特征為細胞吞噬、溶菌作用、免疫調(diào)節(jié)以及模式識別[1]。凝集素屬于可溶性的模式識別受體，存在于動物不同的組織中，與不同的微生物表面的多糖相互作用。雞肺表面活性蛋白A（chicken surfactant protein-A，cSP-A）是雞肺泡上皮分泌的一種親水性糖蛋白。與大多數(shù)哺乳動物相似，成熟的cSP-A單體從N端到C端依次為5個結(jié)構(gòu)域：短的N-端區(qū)、N-末端膠原樣結(jié)構(gòu)域（collagen-like region，CLR）、未知區(qū)、莖區(qū)和C-末端的凝集素糖識別結(jié)構(gòu)域（carbohydrate-recognition domain，CRD），屬于鈣依賴型凝集素（C-type lectin）[2]。研究表明，哺乳動物SP-A主要分布于呼吸道、消化道、腎臟、膀胱、睪丸，胸腺、脾臟等[3]。cSP-A蛋白的組織分布與哺乳動物是否一致尚不清楚。SP-A能夠通過凝集或者聚合作用來刺激吞噬細胞進行清除或殺死多種病原微生物[4]。Reemers等[5]發(fā)現(xiàn)禽流感病毒感染后，氣管中cSP-A的mRNA表達上調(diào)，在肺臟中表達下調(diào)，表明cSP-A可能在先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。

本研究室前期嘗試從雞肺臟灌洗液中提取并純化蛋白，但未得到高質(zhì)量的純化蛋白，且純化成本較高，原核表達產(chǎn)物也沒有明顯抑菌效果。為制備有生物活性的SP-A重組蛋白，本研究利用真核表達系統(tǒng)表達cSP-A，以期為進一步研究cSP-A功能與臨床應用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1 細胞、菌株及載體 HEK-293T細胞由本實驗室保存，用含10%胎牛血清的Opti-MEM培養(yǎng)基（購自美國Gibco公司）培養(yǎng)；大腸桿菌工程菌DH5α感受態(tài)購自美國Invitrogen公司；pcDNA3．1/myc-His（-）A、pEGFP-C1載體由本實驗室保存；pCold-cSP-A載體由本實驗室構(gòu)建，將cSP-A基因克隆至原核表達pCold-TF載體（購自大連寶生物公司）中。

1.2 試劑 凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒小量和中量提取純化試劑盒購自德國Qiagen公司；T4 DNA連接酶、Nhe I、BamH I、Apa I等限制性內(nèi)切酶購自英國NEB公司；ECL顯色發(fā)光試劑盒購自美國熱電公司；TransIT?-293轉(zhuǎn)染試劑購自美國Mirus公司；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）購自美國Molecular Probe公司。

1.3 抗體 HRP標記羊抗鼠IgG購自美國Santa Cruz公司；Fluor?594標記羊抗鼠IgG（H+L）購自美國Invitrogen公司；利用pCold-cSP-A進行原核表達，將純化產(chǎn)物作為免疫原，包裹弗氏佐劑經(jīng)腹腔注射6周齡Balb/c小鼠（100 μg/只），7 d后加強免疫1次，隨后再隔7 d后追加免疫純化抗原（100 μg/只），5 d后采集血液，分離血清備用。

1.4 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中雞SP-A基因核苷酸序列（登錄號：AF411083），利用Lasergene 10設(shè)計兩對引物，同時在cSP-A的C端融合綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因，設(shè)計引物序列如下（表1），下劃線標記的為酶切位點。

表1　本研究中引物設(shè)計Table 1 Primers for amplifi cation in this study

1.5cSP-A成熟肽PCR擴增 以pCold-cSP-A質(zhì)粒為模板，以P1、P2引物和P1、P3引物，分別擴增不同酶切位點的去除終止密碼子cSP-A基因片段cSP-A1和cSP-A2。熱循環(huán)條件：95℃預變性5 min；94℃變性15 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進行DNA電泳檢測，回收純化目的條帶，-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 pcSP-A真核表達載體構(gòu)建 對cSP-A1的PCR產(chǎn)物及pcDNA3．1/myc-His(-)A載體分別用限制性內(nèi)切酶Nhe I和Apa I進行雙酶切。膠回收目的基因片段，經(jīng)T4 DNA連接酶16℃過夜連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)菌DH5α，PCR鑒定為陽性克隆后，送蘇州金唯智公司測序，測序正確的陽性質(zhì)粒命名為pcSP-A。

1.7 pcSP-A-GFP真核表達載體構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶Nhe I和Bam H I分別對cSP-A PCR產(chǎn)物及pcDNA3．1/ myc-His(-)A載體雙酶切，回收、連接、轉(zhuǎn)化，構(gòu)建pcSPA-NB重組載體；利用pEGFP-C1載體作為模板，擴增GFP基因（gfp），將重組載體pcSP-ANB和gfp PCR產(chǎn)物分別用BamH I和Apa I雙酶切，回收、連接、轉(zhuǎn)化，挑取陽性克隆提取質(zhì)粒，送蘇州金唯智公司測序，測序正確的陽性質(zhì)粒命名為pcSPA-GFP。

1.8 重組真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞 用含10%小牛血清的Opti-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)293T細胞，轉(zhuǎn)染前12 h消化細胞，接種至6孔板中。分別將1μg pcSP-A和pcSP-A-GFP，溶于500 μL無抗性無血清的Opti-MEM培養(yǎng)液中，加入2 μL TransIT?-293轉(zhuǎn)染試劑，振蕩混勻，室溫孵育30 min，加至6孔板，同時設(shè)空質(zhì)粒和pEGFP-C1做對照。37℃、5% CO2培養(yǎng)4～6 h后，更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.9 利用間接免疫熒光試驗（indirect immunoflu orescence assay，IFA）進行亞細胞定位 pcSP-AGFP和pcSP-A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后，4%多聚甲醛固定293T細胞10 min，用0．2% Triton X-100的PBS溶液滲透2 min，以1:100稀釋的cSP-A多抗為一抗，F(xiàn)luor?594標記羊抗鼠IgG（H+L）（1:500）為二抗，同時用DAPI染細胞核，IFA檢測cSP-A的表達情況及亞細胞定位。

1.10 Western blot分析 分別收集轉(zhuǎn)染pcSP-A-GFP和pcSP-A質(zhì)粒的293T細胞及上清液，加入2×loading buffer，經(jīng)12% SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)印至NC膜；5%脫脂奶粉4℃封閉過夜，0．1mol/L TBST洗滌15 min后，以1:1000稀釋的抗cSP-A單抗為一抗，室溫孵育2～4 h；TBST洗膜3次，每次10 min，以1:5000稀釋的HPR標記的羊抗鼠IgG為二抗，室溫孵育1 h；TBST洗膜3次，每次10 min，用化學發(fā)光試劑盒（ECL）進行顯色，在天能發(fā)光成像系統(tǒng)中成像分析。

2　結(jié)果

2.1 cSP-A蛋白真核表達載體構(gòu)建 以真核表達載體pcSP-A為模板，PCR擴增均得到666 bp的目的條帶（圖1A），以真核表達載體pcSP-A-GFP為模板的PCR擴增產(chǎn)物電泳后也得到666 bp的目的條帶，與預期相符（圖1B）。測序結(jié)果表明cSP-A真核表達載體構(gòu)建成功。

2.2 SP-A基因在293T細胞中的表達及亞細胞定位pEGFP-C1空載體和pcSP-A-GFP重組質(zhì)粒同樣條件轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染24～48 h，熒光倒置顯微鏡下進行觀察可見綠色熒光主要分布在細胞質(zhì)中（圖2A），表明融合蛋白cSP-A-GFP已經(jīng)成功在293T細胞中獲得表達，且主要在細胞質(zhì)或細胞膜表面表達。用DAPI染細胞核，以cSP-A單抗為一抗進行IFA檢測，結(jié)果與此相符，紅色熒光均在細胞質(zhì)或細胞膜表面（圖2B）。對熒光表達結(jié)果、IFA結(jié)果以及核染結(jié)果（圖2C）進行Merge，結(jié)果如圖2D所示，而對照組中綠色熒光分布整個細胞（圖2E），且免疫組化沒有紅色熒光表達（圖2F）。同樣方法轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcSP-A，IFA結(jié)果顯示紅色熒光也主要在細胞質(zhì)或細胞膜表面（圖3A，圖3B），而空質(zhì)粒pcDNA3．1（-）則無紅色熒光表達（圖3C，圖3D）。

2.3 Western blot分析 分別收集轉(zhuǎn)染pcSP-A-GFP和pcSP-A質(zhì)粒的細胞及上清，用抗cSP-A-CRD小鼠多抗血清進行Western blot檢測。結(jié)果顯示細胞上清組沒有出現(xiàn)特異性條帶，而pcSP-A-GFP的細胞裂解產(chǎn)物在分子量約為55 kDa處出現(xiàn)特異性的雜交條帶（圖4），pcSPA的細胞裂解產(chǎn)物在分子量約為30 kDa處出現(xiàn)特異性的雜交條帶（圖4）。根據(jù)理論計算，cSP-A分子量約為24 kDa，由于它還有一個潛在的N-糖基化位點，所以Western blot顯示分子量大于其理論值。而空載體對照未見特異性條帶，表明cSP-A基因在293T細胞中表達。

圖1　cSP-A 基因PCR擴增結(jié)果Fig. 1 PCR analysis of cSP-A gene

圖2　pcSP-A-GFP重組質(zhì)粒的間接免疫熒光試驗鑒定Fig. 2 Identifi cation of the pcSP-A-GFP recombinant plasmid by indirect immunofl uorescence assay（IFA）

圖3　pcSP-A重組質(zhì)粒的間接免疫熒光試驗鑒定Fig. 3 Identifi cation of the pcSP-A recombinant plasmid by immunofl uorescence assay（IFA）

圖4　重組cSP-A蛋白的Western blot檢測Fig. 4 Detection of the recombinant cSP-A protein by Western blot analysis

3　討論

禽類防御系統(tǒng)主要包括非特異性免疫反應和特異性免疫反應，特異性免疫反應的建立需要一定的時間，因此，研究非特異性天然防御活性物質(zhì)對降低家禽的呼吸系統(tǒng)疾病有著重要意義。SP-A在肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白中含量最豐富。作為一類天然免疫分子，SP-A依靠其CRD識別多種微生物糖基[6]，又借其CLR與吞噬細胞表明的ClqR結(jié)合，從而調(diào)理吞噬作用[7]，此外，SP-A的Neck區(qū)和CRD區(qū)可以識別流感病毒的血凝素，使流感病毒聚集，以降低其感染性[8]。

SP-A的來源主要是天然提取和基因工程合成。天然提取SP-A在結(jié)構(gòu)和活性的完整性方面優(yōu)于基因工程合成，由于取材困難，國外學者多采用maltose-agarose親和層析及Superose-6凝膠過濾[9]，而Superose-6凝膠過濾柱價格高昂，使天然提取方法的應用受到限制，國內(nèi)目前尚無提取雞SP-A的文獻報道。有研究人員嘗試用原核表達系統(tǒng)，pCold-TF表達載體對cSP-A成熟肽進行原核表達，得到高效表達的可溶性蛋白，但抑菌試驗證明該蛋白并沒有明顯抑菌功能，這可能由于原核產(chǎn)物沒有天然蛋白的翻譯后修飾，也不能形成三聚體，從而不能發(fā)揮生物活性[10]。

為制備具有生物活性的SP-A重組蛋白，本研究構(gòu)建了pcSP-A-GFP重組真核表達載體，并在C端融合了His標簽，以便于通過His-Bind瓊脂糖凝膠親和層析法從培養(yǎng)基中純化cSP-A重組蛋白。pcSP-AGFP載體表達的融合蛋白具有cSP-A和GFP的雙重特性，可用gfp作為報告基因觀察cSP-A的表達與定位?？紤]到GFP對cSP-A蛋白活性可能造成影響，同時構(gòu)建了pcSP-A載體。目前融合蛋白主要在細胞中表達，并沒有分泌到上清，下一步計劃構(gòu)建SP-A基因的真核分泌性表達載體pCD5-cSP-A，對表達產(chǎn)物進行親合層析純化，利用純化的蛋白進行病毒抑制試驗在體內(nèi)外研究cSP-A的功能，為臟肺表面活性物質(zhì)制劑研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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EUKARYOTIC EXPRESSION AND IMMUNOLOGICAL ASSAYS OF CHICKEN PULMONARY SURFACTANT PROTEIN A IN 293T CELLS

HUANG Qi1,2, WANG Kai1,2, TU Jian1, PAN Ling1, QI Ke-zong1, LI Ze-jun2, CHEN Hong-jun2, LIU Hong-mei1
(1. College of Animal Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China; 2. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

Chicken pulmonary surfactant protein A (cSP-A) gene was amplifi ed without the stop codon and subcloned into pcDNA3.1/ myc-His (-) A vector with Nhe I and Apa I for expression in eukaryotic system. The resulting plasmid pcSPA was subsequently linked with the green fl uorescence protein (GFP) gene into pcDNA3.1/myc-His (-) A vector with Nhe I/BamH I and BamH I/Apa I sites to construct a recombinant eukaryotic expression vector pcSP-A-GFP. The pcSPA-GFP plasmids were then transfected into 293T cells by TransIT-293 reagent. The sublocalization of cSP-A protein was detected using indirect immunofl uorescence assay (IFA) with the specifi c antibody against cSP-A. The expressed fusion protein was identifi ed in Western blot. Expression of cSP-A was visualized in cytoplasms of the transfected 293T cells. The relative molecular mass of the fusion proteins pcSP-A-GFP and pcSP-A were about 55 kDa and 30 kDa, respectively. The biological activities of cSP-A expressed in the eukaryotic system will be investigated in the future study.

Chicken SP-A; eukaryotic expression; detection

S852.42

A

1674-6422（2016）05-0063-06

2016-03-07

安徽省自然科學基金（1408085MC49）

黃琪，女，碩士研究生，基礎(chǔ)獸醫(yī)學專業(yè)

劉紅梅，E-mail：1030775529@qq．com；陳鴻軍，E-mail：vetchj@shvri．a(chǎn)c．cn