夾心ELISA檢測牛γ-干擾素方法的建立及應(yīng)用

錢 琨，趙 巍，黃大盧，邵紅霞,4，秦愛建

（1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；2.江蘇省動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009；3.教育部禽類預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009；4.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009）

·研究論文·

夾心ELISA檢測牛γ-干擾素方法的建立及應(yīng)用

錢 琨1,2,3,4，趙 巍2,3，黃大盧2,3，邵紅霞2,3,4，秦愛建1,2,3,4

（1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；2.江蘇省動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009；3.教育部禽類預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009；4.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009）

為建立檢測牛γ-干擾素（BoIFN-γ）的雙夾心ELISA方法，將前期獲得的針對(duì)BoIFN-γ的單克隆抗體作為捕捉抗體進(jìn)行夾心ELISA檢測天然BoIFN-γ，結(jié)果表明單克隆抗體BoIFN-γ-6E5、BoIFN-γ-3E1、BoIFN-γ-3C2三株能捕捉到天然的牛γ干擾素。經(jīng)過條件摸索和優(yōu)化，最終建立了以3E1/HRP-6E5為最佳組合的檢測BoIFN-γ的夾心ELISA方法。用建立的雙夾心ELISA檢測方法和進(jìn)口試劑盒同時(shí)對(duì)66份血樣進(jìn)行檢測，結(jié)果表明雙夾心ELISA方法和進(jìn)口試劑盒檢測結(jié)果的符合率達(dá)95.45%，說明該方法能有效地對(duì)牛結(jié)核病γ-干擾素進(jìn)行檢測。

牛γ-干擾素；雙夾心ELISA；應(yīng)用

牛結(jié)核?。╞ovine tuberculosis）是一種由結(jié)核分支桿菌引起的一種人畜共患病。人結(jié)核病中有10%左右是由牛結(jié)核分枝桿菌引起的。牛結(jié)核病的診斷及防治對(duì)控制人結(jié)核病具有十分重要的公共衛(wèi)生意義[1]。盡管動(dòng)物的結(jié)核病在許多發(fā)達(dá)國家已經(jīng)被控制，但是在發(fā)展中國家，結(jié)核病在人類和家畜中仍是一個(gè)非常嚴(yán)重的問題。

牛結(jié)核的根除主要依靠診斷和凈化，國內(nèi)外用于診斷牛結(jié)核病的檢測主要有3種方法[2]：細(xì)菌學(xué)檢測法、分子生物學(xué)檢測法[3]、免疫學(xué)檢測法[4]。結(jié)合分枝桿菌培養(yǎng)法檢測時(shí)間長，不利于快速盡早地診斷結(jié)核病，不易達(dá)到早期阻斷結(jié)核病傳播的目的。分子生物學(xué)診斷法中的PCR法容易出現(xiàn)樣品間的交叉污染，同時(shí)還易出現(xiàn)假陽性和假陰性的結(jié)果。結(jié)核菌素（purified protein derivative，PPD）變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果主要是通過人肉眼判斷，所以會(huì)存在人為判斷誤差，同時(shí)它檢測的特異性差，時(shí)間長，同樣達(dá)不到快速診斷的目的，在臨床應(yīng)用中靈敏度也不高，影響因素多[5]。1990年，Rothel等[6]建立了一種通過檢測γ-干擾素（interferon γ，IFN-γ）來檢測牛結(jié)核病的方法，由于其特異性好，靈敏度高的特點(diǎn)而被推廣。IFN-γ檢測法的田間試驗(yàn)已在許多國家完成[7]，在愛爾蘭、澳大利亞和新西蘭等國家，IFN-γ正式試驗(yàn)已被批準(zhǔn)[8]。IFN-γ試驗(yàn)的發(fā)展已成為牛結(jié)核病診斷的一個(gè)主要發(fā)展趨勢[9]，相關(guān)試劑盒在國外已商品化，但由于進(jìn)口試劑盒價(jià)格昂貴，限制了其在我國的推廣應(yīng)用。因此，本研究在前期制備得到針對(duì)牛γ-干擾素單克隆抗體的基礎(chǔ)上，建立了檢測牛γ-干擾素的雙夾心ELISA方法，為我國牛結(jié)核病的防控與根除提供技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1 抗體、待檢血樣與生物試劑 單克隆抗體BoIFN-γ-6E5、BovIFN-γ-3E1、BoIFN-γ-3C2、His-BoIFN-γ融合蛋白由本實(shí)驗(yàn)室自行研制保存[10,11]；66份待檢牛血清樣品分別來自江蘇省、山東省和北京市；TMB購自AMRESCO公司；30%過氧化氫購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記兔抗鼠IgG 、OPD（鄰苯二胺）購自上海生工生物公司；澳大利亞的進(jìn)口試劑盒Mycobacterium bovis Gamma interferon Test Kit for Cattle；辣根過氧化物酶標(biāo)記試劑盒購于Thermo公司；抗體純化Protein G柱購于GE公司；其他有關(guān)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 天然牛γ-干擾素的刺激 參照文獻(xiàn)[12]，用肝素抗凝管無菌采集江蘇省某牛場可疑的結(jié)核病牛全血，總共9份血樣，無菌環(huán)境下分裝到24孔板中，每孔1．5 mL，每個(gè)血樣設(shè)3個(gè)孔。分別加100μLBPPD、100μL APPD、100μL 1640，輕輕混勻，放置37℃、含5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，收集全血上清檢測。

1.3 單克隆抗體與天然BoIFN-γ的反應(yīng)性 按照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行，最終得到的陽性單抗利用過氧化物酶標(biāo)記試劑盒標(biāo)記進(jìn)行后期的夾心ELISA實(shí)驗(yàn)。

1.4 雙夾心ELISA檢測牛γ-干擾素方法的建立

14.1 最適包被抗體和最適酶標(biāo)抗體的篩選及反應(yīng)條件優(yōu)化 將能結(jié)合天然BoIFN-γ反應(yīng)的抗體BoIFN-γ-6E5、BoIFN-γ-3E1、BoIFN-γ-3C2分別包被，同時(shí)酶標(biāo)抗體HRP-BoIFN-γ-6E5、HRP-BoIFN-γ-3E1分別做雙夾心ELISA檢測天然BoIFN-γ，以最終確定夾心ELISA方法中的最佳包被單抗和最佳酶標(biāo)抗體。參考文獻(xiàn)[11]，通過常規(guī)方法確定最佳包被抗體和酶標(biāo)抗體的使用條件。

1.4.2 雙夾心ELISA靈敏度和特異性確定 將原核表達(dá)的His-BoIFN-γ按照10、5、2．5、1．25、0．7、0．3、0．1、0．01 μg/mL依次稀釋以每孔100 μL的量加入相應(yīng)的孔中計(jì)算夾心ELISA方法的靈敏度；將建立的夾心ELISA方法檢測已知的陰性和陽性牛全血上清，同時(shí)用原核表達(dá)的His-BoIFN-γ作為陽性對(duì)照，確定夾心ELISA方法的特異性。

1.5 夾心ELISA方法的臨界值判定 選擇優(yōu)化好的ELISA條件，對(duì)已知的陽性以及陰性樣品與進(jìn)口試劑盒進(jìn)行比對(duì)檢測的基礎(chǔ)上，制定本ELISA的判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.6 夾心ELISA方法的臨床應(yīng)用 用建立好的夾心ELISA方法檢測臨床收集的66份樣品，同時(shí)與進(jìn)口試劑盒檢測結(jié)果進(jìn)行比較。

2　結(jié)果

2.1 單克隆抗體結(jié)合天然BoIFN-γ的反應(yīng)結(jié)果 包被前期實(shí)驗(yàn)篩選到的9株單抗，用HRP酶標(biāo)抗BoIFN-γ抗體作為檢測抗體，檢測9株單抗是否能捕獲到已知陽性血清中天然的BoIFN-γ，結(jié)果顯示BoIFN-γ-6E5、BoIFN-γ-3E1、BoIFN-γ-3C2三株單抗能夠捕獲到天然BoIFN-γ，結(jié)果見表1。

表1　夾心ELISA檢測單抗與天然BoIFN-γ反應(yīng)性結(jié)果Table 1 The results of McAb to natural BoIFN-γdetected by sandwish ELISA

2.2 3 株單抗識(shí)別的抗原表位分析結(jié)果 為了了解BoIFN-γ-6E5、BoIFN-γ-3E1、BoIFN-γ-3C2三株單抗是否針對(duì)不同的抗原表位，進(jìn)行了單克隆抗體相加ELISA試驗(yàn)，在抗體相加ELISA試驗(yàn)中，當(dāng)兩兩抗體疊加的AI值＞10%時(shí)，表明這兩種抗體所識(shí)別不同的抗原表位。從表2可知，3E1、3C2和6E5I識(shí)別不同的抗原表位。

表2　單抗相加ELISA試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Result of additive ELISA of monoclonalantibodies to BoIFN-γ

注：數(shù)值為AI值

Note: The data was the AI value

2.3 最適捕捉抗體和最適檢測抗體的配對(duì)實(shí)驗(yàn) 將BoIFN-γ-6E5、BoIFN-γ-3E1、BoIFN-γ-3C2三株單抗作為捕捉抗體包被，酶標(biāo)抗體HRP-BoIFN-γ-6E5和HRP-BoIFN-γ-3E1作為檢測抗體進(jìn)行夾心ELISA，檢測已知的陽性和陰性牛全血上清。結(jié)果顯示，BoIFN-γ-3E1包被，用HRP-BoIFN-γ-6E5檢測時(shí)特異性和反應(yīng)性都較好，結(jié)果見表3。

2.4 最佳捕捉抗體溶度和酶標(biāo)檢測抗體濃度的確定 以直接ELISA方法檢測酶標(biāo)抗體HRP- BoIFN-γ-6E5的最低稀釋度和工作濃度，以表達(dá)的His-BoIFN-γ融合蛋白為包被抗原，酶標(biāo)抗體作系列稀釋，計(jì)算OD450平均值。直接ELISA結(jié)果表明，酶標(biāo)結(jié)合物HRP-BoIFN-γ-6E5最佳工作濃度確定為0．09 μg/mL。

將捕捉抗體BoIFN-γ-3E1按照4、2、1、0．5、0．25、0．125、0．07、0．03 μg/孔包被反應(yīng)板，每孔加樣的體積為100 μL，HRP- BoIFN-γ-6E5工作濃度為0．09 μg/mL，結(jié)果顯示BoIFN-γ-3 E1抗體最適包被量為0．5 μg/孔。

2.5 雙夾心ELISA檢測方法的靈敏度與特異性 將BoIFN-γ-3E1按照0．5 μg/孔包被；將原核表達(dá)的His-BoIFN-γ融合蛋白作為檢測抗原按照10 μg/mL、5 μg/mL、0．5 μg/mL、0．05 μg/mL、0．005 μg/mL、0．0005 μg/mL濃度梯度稀釋，每孔加樣100 μL；HRP- BoIFN-γ-6 E5按照1:4 000工作濃度稀釋。夾心ELISA結(jié)果顯示，檢測原核表達(dá)rBoIFN-γ的靈敏度為0．5 ng，結(jié)果見表4。同樣的方法檢測抗原為His-BoIFN-γ融合蛋白、His蛋白、試劑盒檢測出的含天然BoIFN-γ牛全血上清和不含天然BoIFN-γ陰性牛全血上清，結(jié)果顯示雙夾心ELISA方法既不與His蛋白反應(yīng)也不與陰性牛全血上清反應(yīng)，說明該方法特異性較好，結(jié)果見表5。

表3　包被抗體和檢測抗體的篩選Table 3 The selection of detecting antibody

表4　夾心ELISA檢測rBoIFN-γ的靈敏性結(jié)果Table 4 The sensitivity results of sandwich ELISA to detect rBoIFN-γ

表5　夾心ELISA檢測BoIFN-γ結(jié)果Table 5 The results of sandwich ELISA to detect BoIFN-γ

2.6 雙夾心ELISA檢測方法臨界值的確定 對(duì)已知的陽性以及陰性樣品與進(jìn)口試劑盒進(jìn)行比對(duì)檢測的基礎(chǔ)上，制定了本ELISA的判定標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)BPPD的OD450-1640的OD450≥0．15，且BPPD的OD450-APPD的OD450≥0．1，判斷為陽性；BPPD的OD450-1640的OD450＜0．15，或者BPPD的OD450-APPD的OD450＜0．15判斷為陰性。

2.7 雙夾心ELISA檢測方法的臨床檢測 利用本研究建立的雙夾心ELISA方法檢測分別來自北京市、江蘇省和山東省的共66份牛血樣，雙夾心ELISA方法檢測到陽性樣品36份，陰性樣品30份，所檢測結(jié)果與進(jìn)口試劑盒結(jié)果相比較，符合率達(dá)95．45%。具體檢測結(jié)果見表6。

表6　雙夾心ELISA與進(jìn)口試劑盒對(duì)比實(shí)驗(yàn)Table 6 Comparison of the results between the sandwichELISA and commercial ELISA kit

3　討論

結(jié)核病是威脅人類健康的重大疫病之一，世界衛(wèi)生組織對(duì)結(jié)核病的防控一直保持高度重視，每年投入的結(jié)核病的防控治療基金也在逐年上升[13]。牛結(jié)核病是由牛分枝桿菌引起的慢性消耗性傳染病，是一種能夠傳染人的人畜共患病。近年來人結(jié)核病雖然已經(jīng)有所控制，但是仍然呈現(xiàn)一種緩慢上升趨勢[14]，并且人結(jié)核病中有一部分病例是牛結(jié)核分枝桿菌引起的。同時(shí)牛結(jié)核病也嚴(yán)重影響全球奶牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，并嚴(yán)重阻礙著國際貿(mào)易的正常進(jìn)行[15]。所以對(duì)牛結(jié)核病的防治具有十分重大的公共衛(wèi)生意義，我國長期發(fā)展規(guī)劃中也將牛結(jié)核病列為動(dòng)物重要疫病之一。

目前，國內(nèi)外檢測牛結(jié)核的方法主要有細(xì)菌學(xué)方法、PCR方法和免疫學(xué)方法等[2]。在免疫學(xué)檢測方法中，結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)被廣泛使用，但其靈敏性和特異性不高，檢測時(shí)間較長。1990年，Wood等[6]建立了通過檢測經(jīng)牛PPD刺激的牛全血釋放出來的γ干擾素，從而診斷牛結(jié)核病的ELISA方法。牛結(jié)核分枝桿菌侵染機(jī)體后會(huì)刺激機(jī)體淋巴細(xì)胞形成記憶淋巴細(xì)胞，即會(huì)使淋巴細(xì)胞致敏。因此將無菌采集到的牛血用牛結(jié)核分枝桿菌的特異性抗原（BPPD）再次刺激，就會(huì)導(dǎo)致全血中的致敏淋巴細(xì)胞被活化，短時(shí)間釋放出大量的γ-干擾素，因此就可以通過檢查牛全血上清中的γ-干擾素來達(dá)到檢查牛結(jié)核病的目的。這種方法雖然需要一定的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)條件，但是作為結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)的有益補(bǔ)充，已經(jīng)幫助許多國家控制或根除了牛結(jié)核病。牛結(jié)核病在我國部分地區(qū)仍然存在，目前生產(chǎn)一線的檢測方法還停留在結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)方法的應(yīng)用。由于進(jìn)口檢測試劑盒價(jià)格昂貴，無法大范圍推廣應(yīng)用，因此我國急需自主研發(fā)具有完全獨(dú)立知識(shí)產(chǎn)權(quán)的檢測牛γ-干擾素的檢測方法。

本研究利用2株針對(duì)不同抗原表位，并能結(jié)合天然牛γ-干擾素的單克隆抗體建立了雙夾心ELISA檢測方法，能檢測到0．5 ng原核表達(dá)的rBoIFN-γ。在66份臨床樣品的對(duì)比檢測中，自制的雙夾心ELISA檢測方法檢測到36份陽性樣品，而進(jìn)口試劑盒僅檢測到其中的33份，陰性樣品檢測結(jié)果一致，這其中差異的3份牛血清樣品，還有待利用其他的方法來確定，同時(shí)還需要更多的檢測樣品來補(bǔ)充和完善應(yīng)用結(jié)果數(shù)據(jù)。此外，自制雙夾心ELISA檢測方法檢測靈敏度還可以進(jìn)一步提高，從而提高檢測方法的靈敏性。

本研究成功建立了單抗雙夾心ELISA檢測牛γ-干擾素方法，可以應(yīng)用于臨床樣本的檢測，并且該方法與進(jìn)口試劑盒檢測結(jié)果符合率高，為今后牛γ-干擾素檢測試劑盒的研發(fā)打下基礎(chǔ)，為我國牛結(jié)核病的檢疫和根除提供了一種實(shí)用、有效的檢測方法，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。

[1] Humblet M F, Boschiroli M L, Saegerman C． Classification of worldwide bovine tuberculosis risk factors in cattle: a stratified approach[J]． Vet Res, 2009, 40(5): 50．

[2] Sarnaik R M, Sharma M, Kate S K, et al． Serodiagnosis of tuberculosis: assessment of kaolin agglutination test[J]．Tuber Lung Dis, 1993, 74(6): 405-406．

[3] Dalovisio J R, Montenegro-James S, Kemmerly S A, et al． Comparison of the amplified Mycobacterium tuberculosis (MTB) direct test, Amplicor MTB PCR, and IS6110-PCR for detection of MTB in respiratory specimens[J]． Clin Infect Dis, 1996． 23(5): 1099-1106．

[4] Sugden E A, Stilwell K, Rohonczy E B, et al． Competitive and indirect enzyme-linked immunosorbent assays for Mycobacterium bovis infections based on MPB70 and lipoarabinomannan antigens[J]． Can J Vet Res, 1997, 61(1): 8-14．

[5] Corrin K C, Carter C E, Kissling R C, et al． An evaluation of the comparative tuberculin skin test for detecting tuberculosis in farmed deer[J]． N Z Vet J, 1993, 41(1): 12-20．

[6] Rothel J S, Jones S L, Corner L A, et al． A sandwich enzyme immunoassay for bovine interferon-gamma and its use for the detection of tuberculosis in cattle[J]． Aust Vet J, 1990, 67(4): 134-137．

[7] Ameni G, Mi?rner H, Roger F, et al． Comparison between comparative tuberculin and gamma-interferon tests for the diagnosis of bovine tuberculosis in Ethiopia[J]． Trop Anim Health Prod, 2000, 32(5): 267-276．

[8] González Llamazares O R, Gutiérrez Martín C B, Alvarez Nistal D, et al． Field evaluation of the single intradermal cervical tuberculin test and the interferongamma assay for detection and eradication of bovine tuberculosis in Spain[J]． Vet Microbiol, 1999, 70(1-2): 55-66．

[9] Pollock J M, Neill S D． Mycobacterium bovis infection and tuberculosis in cattle[J]． Vet J, 2002, 163(2): 115-127．

[10] 許金?。?奶牛干擾素-γ基因的表達(dá)及其在乳房炎防治中的初步應(yīng)用[D]． 揚(yáng)州: 揚(yáng)州大學(xué), 2005．

[11] 尹天燕． γ-干擾素介導(dǎo)牛結(jié)核快速檢測方法的研究及初步應(yīng)用[D]． 揚(yáng)州: 揚(yáng)州大學(xué), 2010．

[12] 黃大盧． BoIFN-γ基因的原核表達(dá)及其單克隆抗體的研制[D]． 揚(yáng)州: 揚(yáng)州大學(xué), 2012．

[13] Sattah M V, Aye S S, Azen C, et al． Interferon-gamma release assay T-SPOT．TB and HIV-related tuberculosis[J]． Int J Tuberc Lung Dis, 2012, 16(2): 281-282．

[14] Humblet M F, Boschiroli M L, Saegerman C．Classification of worldwide bovine tuberculosis risk factors in cattle: a stratified approach[J]． Vet Res, 2009, 40(5): 50．

[15] Sabio y García J V, Bigi F, Rossetti O, et al． Expression of MPB83 from Mycobacterium bovis in Brucella abortus S19 induces specific cellular immune response against the recombinant antigen in BALB/c mice[J]． Microbes Infect, 2010, 12(14-15): 1236-1243．

DEVELOPMENT AND APPLICATION OF SANDWICH ELISA FOR DETECTING BOVINE INTERFERON GAMMA

QIAN Kun1,2,3,4, ZHAO Wei2,3, HUNAG Da-lu2,3, SHAO Hong-xia2,3,4, QIN Ai-jian1,2,3,4
(1. Colledge of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China; 2. Key Laboratory of Jiangsu Preventive Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China; 3. Ministry of Education Key Lab for Avian Preventive Medicine, Yangzhou 225009, China; 4. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)

To develop a sandwich ELISA for detection of bovine interferon γ (BoIFN-γ), 3 monoclonal antibodies against BoIFN-γ were tested as capture antibodies. All of 3 monoclonal antibodies recognized BoIFN-γ. The sandwich ELISA method was optimized and monoclonal antibody 3E1 was determined as the capture antibody. Total 66 serum samples from different regions were tested using the sandwich ELISA developed here and a commercial ELISA kit. The agreement between these two methods was 95.45%, suggesting the promising possibility of the sandwich ELISA for effective detection of BoIFN-γ in bovine tuberculosis disease.

Bovine interferon γ; sandwich ELISA; application

S852.4

A

1674-6422（2016）05-0057-06

2016-01-18

江蘇省科技支撐計(jì)劃（BE2013391）；江蘇省優(yōu)勢學(xué)科項(xiàng)目

錢 琨，男，博士，主要從事動(dòng)物傳染病研究

秦愛建，E-mail：aijian@yzu．edu．cn