四種胃蠅三期幼蟲的掃描電鏡觀察

楊紅霞，斯 清，吳 輝，伊春陽，謝小婉，巴音查汗，郭慶勇

（1. 新疆農(nóng)業(yè)大學，烏魯木齊 830052；2. 昭蘇縣察汗烏松鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，昭蘇 835604）

·研究論文·

四種胃蠅三期幼蟲的掃描電鏡觀察

楊紅霞1，斯 清2，吳 輝1，伊春陽1，謝小婉1，巴音查汗1，郭慶勇1

（1. 新疆農(nóng)業(yè)大學，烏魯木齊 830052；2. 昭蘇縣察汗烏松鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，昭蘇 835604）

為準確掌握伊犁馬四種胃蠅屬三期幼蟲的鑒別特征，本文以伊犁地區(qū)采集的馬胃蠅蛆（n=200）為試驗材料，借助體視顯微鏡、掃描電子顯微鏡對其進行形態(tài)學鑒定，并以各屬蠅蛆每節(jié)排列刺的差異、形狀、口鉤及氣門板等結(jié)構(gòu)作為鑒定依據(jù)。結(jié)果顯示，本次試驗共鑒定出四種馬胃蠅三期幼蟲：獸胃蠅蛆、鼻胃蠅蛆、紅尾胃蠅蛆、腸胃蠅蛆。超微觀察可見鼻胃蠅三期幼蟲第一胸段出現(xiàn)“隔板狀”突出物、其刺列為單排刺列且胸部第一刺列為雙排刺，此外鼻胃蠅三期幼蟲口鉤表面紋路差異較大且表面溝壑中有類似“纖毛狀物”的存在；獸胃蠅三期幼蟲背側(cè)下頜骨部分擴展成葉且葉部的頂部為平滑狀，其他三種胃蠅屬三期幼蟲葉部的頂端部位為鋸齒狀；紅尾胃蠅形態(tài)學特征與腸胃蠅差異不顯著，但其寄生部位與刺帶特征可作為其鑒定依據(jù)。胃蠅屬常見四種三期幼蟲體表刺列、頭部下頜骨葉部、口鉤表面溝壑等均可作為其鑒別要點，為馬胃蠅三期幼蟲的鑒定提供參考依據(jù)。

馬胃蠅三期幼蟲；體視顯微鏡；掃描電子顯微鏡；鑒定

馬胃蠅隸屬于節(jié)肢動物門（Arthropod）、雙翅目（Diptera）、環(huán)裂亞目（Cyclorrhapha）、胃蠅科（Gastrophilidae）、胃蠅屬（Gasterophilus），其幼蟲寄生于馬屬動物(馬、驢和斑馬等)胃腸道粘膜及胃賁門部，可引起騷亂不安、食欲減退及胃黏膜潰瘍炎癥[1]。馬胃蠅病呈世界性分布，在摩洛哥[2]、埃及[3]、瑞典[4]、比利時[5]、波蘭[6]、哈薩克斯坦[7]等地均有報道。我國多發(fā)生于西北、東北、內(nèi)蒙古等地。新疆維吾爾自治區(qū)常見胃蠅屬有4種，即獸胃蠅（Gasterophilus pecorum）、鼻胃蠅（Gasterophilus nasalis）、紅尾胃蠅（Gasterophilus haemorrhoidalis）、腸胃蠅（Gasterophilus intestinalis），感染率高達100%[8]，死亡率達34．3%[9]，其幼蟲利用身體棘刺和頭部口鉤附著在消化道內(nèi)壁上，對胃部損傷面積可高達60%～80%[10]。

新疆維吾爾自治區(qū)（下文簡稱新疆）自古就以畜牧業(yè)而聞名，而伊犁哈薩克自治州（下文簡稱伊犁）又是我區(qū)養(yǎng)馬業(yè)的重中之重。隨著近年來馬胃蠅蛆病的增多，死亡率也在逐年上升，嚴重影響了伊犁地區(qū)馬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前，對于伊犁地區(qū)馬胃蠅三期幼蟲種類的鑒定及其相關的報道甚少。本研究采用體視顯微鏡的初步鑒定，進一步對伊犁常見的馬胃蠅三期幼蟲進行了超微結(jié)構(gòu)鑒定，為該蟲種的形態(tài)學鑒定提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1 蟲體收集 從伊犁昭蘇縣病死馬胃腸道器官（n1=148）與患病馬糞（n2=52）中采集馬胃蠅的第三期幼蟲（獸胃蠅58只、鼻胃蠅44只、腸胃蠅37只、紅尾胃蠅61只），生理鹽水沖洗后將其保存在75%乙醇中，標注采集地點與采集時間。物種的識別基于胃腸道的位置與體視顯微鏡的初步鑒定。

1.2 主要儀器 日立（HITACHI）S-570型掃描電子顯微鏡；KQ-5200型單槽式超聲波清洗機、ALPHA1-2型真空冷凍干燥儀（德國Christ 公司）、體視顯微鏡（MOTIC ST-39）。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理 用PBS緩沖液（pH=7．2）仔細清洗馬胃蠅三期幼蟲體表，再用超聲波清洗60 min。將馬胃蠅三期幼蟲浸于PBS緩沖液，在體視顯微鏡下將馬胃蠅三期幼蟲第3、5、7腹節(jié)側(cè)面輕刺3個小孔，依次轉(zhuǎn)移到含有1．5%、2．5%、3．5%戊二醛固定液5 mL離心管中，室溫下分別進行3、4、5 h的固定樣品。再將馬胃蠅三期幼蟲樣品放入真空冷凍干燥儀（真空度0．1 mbar，溫度-42℃）進行干燥，將獲得的馬胃蠅三期幼蟲樣品，用導電膠帶粘附于樣品臺上，進行噴金。馬胃蠅三期幼蟲樣品全部背面噴金，進行掃描電鏡觀察。

1.3.2 鑒定方法 通過體視顯微鏡和文獻[11,12]從外部結(jié)構(gòu)特征進行分類鑒定。選取獸胃蠅、鼻胃蠅、紅尾胃蠅、腸胃蠅三期幼蟲各5只，進行掃描電子顯微鏡觀察，重點觀察比較口鉤表面紋理、下頜骨等部位的特征。

2　結(jié)果

2.1 體視顯微鏡觀察結(jié)果 在體視顯微鏡下對4種馬胃蠅三期幼蟲進行觀察分類，其主要鑒別要點歸納見表1。

2.2 掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果 4種馬胃蠅三期幼蟲頭胸部對比可見，鼻胃蠅頭部延伸出“隔板狀物”（圖1B），而其他3種并未突出。鼻胃蠅上頜骨前頭段突出，口鉤向內(nèi)彎曲且縱向平行蟲體，以供其固定于宿主組織；觸角神經(jīng)葉位于背側(cè)上頜骨，朝向外側(cè)，頭部探出時將其伸出背部上頜骨。

表1　獸胃蠅、鼻胃蠅、紅尾胃蠅、腸胃蠅在體視顯微鏡下的鑒別要點Table 1 Morphological identifi cation of G.pecorum, G.nasalis, G.intestinalis and G.haemorrhoidalis under stereo microscopy

4種馬胃蠅三期幼蟲下顎具有顯著差異，背側(cè)下頜骨部分擴展成葉，鼻胃蠅、紅尾胃蠅與腸胃蠅三期幼蟲葉部的頂端部位為鋸齒狀，而獸胃蠅三期幼蟲葉部的頂部為平滑狀（圖2B）。

4種馬胃蠅三期幼蟲第一胸段特點是存在完整的環(huán)狀前沿小刺（圖3），小刺出現(xiàn)在第二和第三的前沿胸段和腹部1～6段（圖2）。獸胃蠅、紅尾胃蠅與腸胃蠅的三期幼蟲背腹部刺帶為雙排刺，外刺列均大于內(nèi)刺列（圖3C、D），鼻胃蠅三期幼蟲形態(tài)特征為單排刺列，但在其胸部第一刺列為雙排刺（圖4）。

4種馬胃蠅三期幼蟲口鉤可作為種類的鑒別特征（圖5）。在鼻胃蠅的口鉤外側(cè)可見清晰且平行于口鉤的紋路，口鉤溝壑內(nèi)長有類似于“纖毛”的物體且密度不一；其他3種馬胃蠅三期幼蟲表面光滑，其內(nèi)側(cè)口鉤底部可見菱形紋路，口鉤中部到尖端處為平行于口鉤的溝壑，而其尖端為類似于鱗片疊加狀溝壑，且無纖毛狀結(jié)構(gòu)（圖6）。

圖1　掃描電子顯微鏡的馬胃蠅三期幼蟲頭胸部(50×)Fig. 1 The head and thorax of the third stage larvae of bots by scanning electron microscope (50×)

圖2　掃描電子顯微鏡的馬胃蠅三期幼蟲下顎部(120×)Fig. 2 The mandible and thorax of the third stage larvae of bots by scanning electron microscope (120×)

圖3　掃描電子顯微鏡的馬胃蠅三期幼蟲腹面刺帶(20×)Fig. 3 Ventral spine zone of the third stage larvae of bots by scanning electron microscope (20×)

圖4　鼻胃蠅三期幼蟲腹面刺帶（胸部第一刺列為雙排刺，箭頭所指，其余刺列為單排刺列）（20×）Fig. 4 Ventral spine zone of the third stage larvae of bots(The fi rst row of thorax is double which arrow indicates and the others are single row spines) (20×)

圖5　掃描電子顯微鏡的馬胃蠅三期幼蟲口鉤特征(120×)Fig. 5 The characteristics of mouth hooks by scanning electron microscope (120×)

3　討論

圖6　掃描電子顯微鏡的馬胃蠅三期幼蟲口鉤表面(1000×)Fig. 6 The surface of mouth hook of bots by scanning electron microscope(1000×)

馬胃蠅三期幼蟲在馬科動物消化道寄生，包括胃、十二指腸和直腸，但主要寄生在胃內(nèi)，寄生時間大約持續(xù)10個月，易造成胃潰爛、腸阻塞、貧血、腹瀉等問題，嚴重的可引起死亡。全世界已知的馬胃蠅共有9種[12]，除了南方胃蠅、扁腹胃蠅、三列棘胃蠅，其他6種（獸胃蠅、鼻胃蠅、腸胃蠅、紅尾胃蠅、黑角胃蠅和裸節(jié)胃蠅）在我國均有分布[13,14]。因此，對于其幼蟲尤其是三期幼蟲的研究顯得尤為重要，但國內(nèi)外這方面研究較少。期幼蟲獨一無二的特征，可能代表一個適應當?shù)丨h(huán)境的特點[15]（如腸道能動性）。背側(cè)部分的下頜骨部分擴展成葉，除獸胃蠅三期幼蟲葉部的頂部為平滑狀外，其他3種胃蠅屬三期幼蟲葉部的頂端部位為鋸齒狀。鼻胃蠅三期幼蟲的體表刺列為單排刺列，但在其胸部第一刺列為雙排刺。2007年Cowell等[15]對鼻胃蠅口鉤表面紋路進行了對比，結(jié)果顯示，可能由于地方差異，紋路差距較大。本研究拍攝過程中，放大口鉤表面，發(fā)現(xiàn)鼻胃蠅三期幼蟲的表面溝壑中有類似“纖毛狀物”的存在，而在其他3種胃蠅屬中并未發(fā)現(xiàn)。紅尾胃蠅的形態(tài)學特征與腸胃蠅不易區(qū)分，在后期的研究中，希望通過更多的途徑去區(qū)分。

背腹部刺列排布等傳統(tǒng)的鑒定特征是馬胃蠅三期幼蟲鑒定的重要依據(jù)[11]，但由于個體與觀察者視覺上存在差異，使馬胃蠅三期幼蟲在種類區(qū)分上存在爭議。本研究以期通過掃描電子顯微鏡的觀察，為該蟲種的鑒定提供參考依據(jù)。

20世紀60年代中期掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）的出現(xiàn)，使人類觀察微小物質(zhì)的能力有了質(zhì)的飛躍。在體視顯微鏡的觀察中，有較多細微部分未能觀察到，而掃描電子顯微鏡可以對蟲體進行更加細微的觀察，可以進行進一步區(qū)分。第一胸段的“隔板狀”突出物是鼻胃蠅三

[1] 彭光政, 劉松, 劉兵, 等． 馬胃蠅蛆病的防治措施[J]． 中國畜牧獸醫(yī)文摘, 2011, 27(5), 99-100．

[2] Pandey V, Ouhelli H, Elkhalfane A． Observations on the epizootiology of gasterophilus-intestinalis and Gasterophilus nasalis in horses in morocco[J]． Vet Parasitol, 1980, 7(4): 347-356．

[3] Hilali M, Derhalli F S, Baraka A． Incidence and monthly prevalence of Gasterophilus spp． larvae (Diptera: Gasterophilidae) in the stomach of donkeys (Equus asinus) in Egypt[J]． Vet Parasitol, 1987, 23(3-4): 297-305．

[4] Agneessens J, Engelen S, Debever P, et al． Gasterophilus intestinalis infections in horses in Belgium[J]． Vet Parasitol, 1998, 77(2): 199-204．

[5] Hoglund J, Ljungstrom B, Nilsson O, et al． Occurrence of Gasterophilus intestinalis and some parasitic nematodes of horses in Sweden[J]． Acta Vet Scand, 1997, 38(2): 157-166．

[6] Studzinska M B, Wojcieszak K． Gasterophilus S P． Botfly larvae in horses from the South-eastern part of Poland [J]． B Vet Pulawy, 2009, 53(4): 651-655．

[7] Baltabek I, Lyudmila L, Christian B． Gasterophilus spp． infections in horses from northern and central Kazakhstan[J]． Vet Parasitol, 2015, 207(1-2): 94-98．

[8] 劉善輝． 馬胃蠅形態(tài)學、流行病學調(diào)查及COI、16S r RNA 基因系統(tǒng)發(fā)育研究[D]． 北京: 北京林業(yè)大學, 2012．

[9] 楊四雄． 馬胃蠅蛆病的診療[J]． 云南畜牧獸醫(yī), 2003, (1): 2．

[10] 楊健梅, 張東, 胡德夫, 等． 馬胃蠅蛆病造成馬體損傷性研究[J]． 中國畜牧獸醫(yī), 2013, 40(5): 177－180．

[11] 王善志, 徐顯增． 新疆馬胃蠅種類觀察及其地理分布[J]．中國獸醫(yī)科技, 1991, 21(11): 14-15．

[12] Zumpt F． Myiasis in Man and Animals in the Old World[M]． London: Butterworths, 1965: 267．

[13] 范滋德． 中國常見蠅類檢索表[M]． 2版． 北京: 科學出版社, 1992: 890-895．

[14] 薛萬琦, 趙建銘． 中國蠅類(下冊)[M]． 沈陽: 遼寧科學技術出版社, 1996: 2207-2217．

[15] Cowell D D, Otranto D, Horak I G． Comparative scanning electron microscopy of Gasterophilus third instars[J]． Med Vet Entomol, 2007, 27(3): 255-264．

OBSERVATIONS OF FOUR KINDS OF GASTEROPHILUS THIRD INSTARS UNDER SCANNING ELECTRON MICROSCOPY

YANG Hong-xia1, SI Qing2, WU Hui1, YI Chun-yang1, XIE Xiao-wan1, BA Yin-chahan1, GUO Qing-yong1
( 1.Xinjiang Agricultural University, Urumchi 830052, China; 2 .The Veterinary Station of Cahanusun Village Mongolkure Town, Mongulkure 835604, China)

To gather knowledge for the diagnostic characteristics of the third-stage larvae of four equine Gasterophilus species, 200 equine Gasterophilus samples were collected from Ili region, Xinjiang and examined for their morphological identifi cation under stereo microscopy and scanning electron microscopy. The identifi cation basis for Gasterophilus species were their differences of spine rows on every segments, shapes, mouth hooks and stigmal plates. These Gasterophilus samples were found to contain the third-stage larvae of four equine Gasterophilus species, i.e. G.pecorum, G.nasalis, G.haemorrhoidalis and G.intestinalis. Ultramicroscopic observations revealed that the third-stage larvae of G.nasalis` had a “separator like” process on its fi rst thorax area with single spines while double rows of spines were arranged on the fi rst thorax area. Additionally, more differences on the superfi cial stripes of mouth hooks and existence of similar “seta like” structures in superfi cial gullies were noted. The dorsal mandibles of the third-stage larvae of G.pecorum`s expanded andformed the smooth lobes at the apex while the serrate lobes at the apexes were observed in other Gasterophilus species. The differences of morphological characters of G.haemorrhoidalis and G.pecorum were minor but the parasitic positions and characteristics of spine zones were quite different and considered as identifi cation basis. In conclusion, the major identifi cation points of the third-stage larvae of the most common four Gasterophilus were the superfi cial spine rows, mandible lobes of head and superfi cial gully of mouth hooks.

Gasterophilus third-stage larvae; stereo microscope; scanning electron microscope; identifi cation

S852.743

A

1674-6422（2016）05-0051-06

2016-01-11

國家自然基金-新疆聯(lián)合基金重點項目（U1403283）；國家自然科學基金-新疆聯(lián)合基金項目（U1503188）；新疆農(nóng)業(yè)大學產(chǎn)學研聯(lián)合培養(yǎng)研究生項目（xjaucxy-yjs-20151023）

楊紅霞，女，碩士研究生，臨床獸醫(yī)學專業(yè)

巴音查汗，E-mail：2514062881@qq．com；郭慶勇，E-mail：83949588@qq．com