新西蘭兔接種梅毒螺旋體后主要器官病理表現(xiàn)

韓 燕 劉宏業(yè) 尹躍平 龔匡隆 鐘銘英 朱小宇 施美琴

新西蘭兔接種梅毒螺旋體后主要器官病理表現(xiàn)

韓 燕 劉宏業(yè) 尹躍平 龔匡隆 鐘銘英 朱小宇 施美琴

目的: 觀察接種不同代數(shù)的菌株及不同藥物劑量組治療后的梅毒兔主要臟器的病理改變。方法: 睪丸接種組選擇原代組、一代組、二代組及陰性對照組各1只進(jìn)行解剖，取心、肝、脾、腎。背部皮膚的接種組藥效學(xué)評價選擇陽性對照家兔1只、普魯卡因青霉素和頭孢曲松中間兩個劑量組治療的家兔各1只，解剖心、肝、脾、腎，10%福爾馬林溶液固定、包埋、切片和HE染色。結(jié)果: 梅毒螺旋體感染家兔后2周，可引起心、肝和腎炎癥細(xì)胞的浸潤，但不引起脾臟的病理改變。一代組及二代組引起臟器的炎癥改變與原代組相似。梅毒感染后的家兔藥物治療后12周，部分梅毒兔主要臟器仍有炎癥反應(yīng)，頭孢曲松治療RPR滴度轉(zhuǎn)陰11周后家兔的心、肝及腎臟無明顯炎細(xì)胞浸潤。結(jié)論: 在進(jìn)行梅毒兔藥效學(xué)模型建立過程中無需增加病理學(xué)的數(shù)據(jù)，但在治愈轉(zhuǎn)陰后通過病理切片的觀察能夠更好地了解治療效果。

梅毒螺旋體； 新西蘭雄兔； 感染模型； 病理表現(xiàn)

梅毒是由梅毒螺旋體(Treponema pallidum，Tp)引起的慢性、系統(tǒng)性性傳播疾病。在我國梅毒已超過淋病成為最為常見的性傳播疾病，至2013年，梅毒報告發(fā)病率已達(dá)32.86/10萬，居全國甲、乙類法定傳染病第3位，成為我國重要的公共衛(wèi)生和社會問題之一[1]。由于缺乏梅毒疫苗，青霉素成為控制梅毒的主要有效藥物，一般人群青霉素過敏率為8%左右[2]，青霉素類藥物治療后仍有1%～2%的概率會發(fā)生藥物副反應(yīng)[3]。因此選擇對青霉素藥物過敏及治療后有副反應(yīng)的人群選擇合適的替代藥物進(jìn)行梅毒治療顯得尤為重要。動物感染模型的建立有利于對抗梅毒藥物進(jìn)行合理、有效的藥效學(xué)評價，而病理觀察作為重要的評價指標(biāo)之一顯得尤為重要。梅毒的家兔模型與人類的梅毒感染有很多相似之處。將梅毒螺旋體接種于家兔的睪丸中可以獲得大量的梅毒螺旋體[4]，而背部皮內(nèi)接種引起的臨床表現(xiàn)類似于人類一期梅毒硬下疳的表現(xiàn)[5，6]，適合與藥效評價時模擬人類梅毒發(fā)病情況的觀察。因此本研究通過睪丸接種進(jìn)行傳代擴大培養(yǎng)的同時觀察家兔接種不同代數(shù)的菌株后各主要臟器的病理改變，探討接種不同代數(shù)的菌株對兔梅毒模型的影響；利用背部皮膚的接種梅毒螺旋體建立梅毒兔藥效觀察模型，并利用不同的藥物劑量進(jìn)行療效對比，初步觀察不同藥物劑量組治療梅毒后主要臟器的病理改變，初步探索病理在梅毒兔治療效果評價中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 純種新西蘭雄兔購于南京金陵種兔場[scxk(蘇)2012-0003]，體重2.8～3.5 Kg，兔齡3個月左右，飼養(yǎng)于IVC兔籠中，飼料(南京青紫蘭生物科技有限公司)及飲水均不含抗生素。

1.2 菌株 Nichols標(biāo)準(zhǔn)株由美國華盛頓大學(xué)過敏和傳染病實驗室惠贈，傳代保存于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院參比實驗室。

1.3 試劑 10%福爾馬林溶液由1份37%～40%甲醛(西隴化工股份有限公司，廣東汕頭)與9份雙蒸水配置而成。正常家兔血清鹽溶液5(NRS鹽溶液，生理氯化鈉溶液與正常家兔血清混合)為實驗室自制。

1.4 實驗方法

1.4.1 梅毒螺旋體菌懸液制備 將液氮中保存的Nichols標(biāo)準(zhǔn)株的梅毒兔睪丸模型，在37℃孵箱中復(fù)蘇1 h后，將睪丸沿縱線方向切成多個小片，但不完全切開，后放入裝有10 mL 20%的NRS鹽溶液，利用無菌紗布蓋住燒杯后，水平搖晃燒杯使液體與睪丸的切片充分接觸，并用眼科鑷對睪丸切片進(jìn)行充分?jǐn)D壓，從而充分釋放睪丸組織中的梅毒螺旋體。取一定量的菌懸液置于載玻片上，蓋上蓋玻片，置于暗視野顯微鏡下計數(shù)，并利用20%NRS鹽溶液進(jìn)行稀釋后暗視野顯微鏡下每個視野約50個梅毒螺旋體用于睪丸接種組，暗視野顯微鏡下每個視野約120個梅毒螺旋體用于背部皮內(nèi)接種組。

1.4.2 菌懸液的接種 家兔稱重后根據(jù)隨機數(shù)字將其隨機分為睪丸接種組和背部皮內(nèi)接種組。實驗前均進(jìn)行血清學(xué)檢測以排除梅毒螺旋體的感染。睪丸接種組:利用安爾碘消毒雙側(cè)睪丸，雙側(cè)接種，總注射2×107梅毒螺旋體。根據(jù)接種螺旋體菌株的代數(shù)的不同，分為原代組、一代組和二代組。背部皮內(nèi)接種組:背部剃毛后選擇6個點接種，總注射2×107梅毒螺旋體[7，8]。 1.4.3 藥物治療 選擇普魯卡因青霉素和頭孢曲松作為治療藥物，根據(jù)臨床藥物的治療劑量(普魯卡因青霉素80 UI連續(xù)10天；頭孢曲松500 mg連續(xù)10天)和人與動物及各類動物間藥物劑量的換算公式d2＝d1R2/R1(W1/W2)1/3(d為動物的每 kg體重劑量；R為動物體型系數(shù)；W為動物的體重)得家兔的普魯卡因青霉素劑量為3.4 UI/kg，頭孢曲松劑量為21 mg/kg。對比文獻(xiàn)后實驗中選擇推算的劑量的原倍、1/5、1/25和1/125共四組。當(dāng)70%的家兔血清滴度連續(xù)3周無變化時，臀部肌肉注射藥物，連續(xù)10天。

1.4.4 組織學(xué)觀察 睪丸接種組在兩周后利用空氣注射處死實驗家兔。各選擇原代組、一代組及二代組及陰性對照組各1只進(jìn)行解剖，取家兔心臟的心尖、左側(cè)肝葉、脾臟的左側(cè)、左腎組織。背部皮膚的接種藥效學(xué)評價在藥物治療后12周利用空氣注射處死實驗家兔。選擇陽性對照家兔1只、普魯卡因青霉素和頭孢曲松中間兩個劑量組治療的家兔各1只進(jìn)行解剖，取其心臟的心尖、左側(cè)肝葉、脾臟的左側(cè)、左腎組織。10%福爾馬林溶液充分固定后，送東南大學(xué)病理教研組經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、包埋和切片后厚度4 μm，進(jìn)行HE染色鏡檢。由專業(yè)病理人員在光學(xué)顯微鏡下閱片。

2 實驗結(jié)果

2.1 感染不同接種代數(shù)梅毒螺旋體后家兔主要臟器的病理學(xué)改變 陰性對照組:心、肝、脾、腎各組織內(nèi)無明顯炎細(xì)胞浸潤，未見明顯病變(圖1)。原代組:心肌內(nèi)可見灶性淋巴細(xì)胞散在浸潤；肝匯管區(qū)內(nèi)較多的淋巴細(xì)胞及少許巨噬細(xì)胞浸潤；脾未見明顯病變；腎髓質(zhì)區(qū)有淋巴細(xì)胞浸潤(圖2)。一代組及二代組:心肌內(nèi)可見灶性淋巴細(xì)胞散在浸潤；肝匯管區(qū)內(nèi)較多的淋巴細(xì)胞浸潤；脾未見明顯病變；腎髓質(zhì)區(qū)有淋巴細(xì)胞浸潤。

梅毒螺旋體感染家兔后2周，可引起心、肝和腎這些主要臟器的炎癥改變，但是不引起脾臟的病理改變。一代組及二代組引起的臟器的驗證改變與原代組相似。

2.2 不同藥物不同劑量治療梅毒螺旋體感染的家兔的主要臟器的病理學(xué)改變 陰性對照組:心、肝、脾、腎各組織內(nèi)無明顯的炎性細(xì)胞浸潤，未見明顯病變。陽性對照組(治療前RPR滴度為1∶32，處死前1∶8)病理表現(xiàn)與同上述的原代組表現(xiàn)相似。普魯卡因青霉素治療組:0.68 UI/kg組，治療前RPR滴度1∶4，治療后第7周轉(zhuǎn)陰；0.136 UI/kg組，治療前RPR滴度1∶16，處死前1∶4。兩組病理切片結(jié)果相似:心肌內(nèi)可見灶性淋巴細(xì)胞散在浸潤；肝匯管區(qū)內(nèi)較多的淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤，并侵及小葉間膽管；腎間質(zhì)部分血管周圍有大量淋巴細(xì)胞并伴有少許巨噬細(xì)胞浸潤，還可見灶性間質(zhì)有大量淋巴細(xì)胞浸潤。

圖1 對照組各主要臟器的組織學(xué)表現(xiàn)病理圖

圖2 原代組各主要臟器的組織學(xué)表現(xiàn)病理圖

頭孢曲松治療組:4.2 mg/kg組，治療前RPR滴度1∶16，處死前1∶1；而0.84 mg/kg組，治療前RPR滴度1∶2，治療后第二周轉(zhuǎn)陰；未轉(zhuǎn)陰者心肌內(nèi)無明顯炎細(xì)胞浸潤，未見明顯病變；肝匯管區(qū)內(nèi)較多淋巴細(xì)胞及少許漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤；腎可見腎間質(zhì)少數(shù)血管周圍有少量淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤。轉(zhuǎn)陰后11周者:心、肝、脾、腎各組織內(nèi)無明顯炎細(xì)胞浸潤，未見明顯病變。

普魯卡因青霉素治療RPR滴度轉(zhuǎn)陰后6周家兔的心、肝及腎臟的炎癥仍存在；頭孢曲松治療RPR滴度轉(zhuǎn)陰后11周家兔的心、肝及腎臟無明顯炎細(xì)胞浸潤，未見明顯病變。

3 討論

梅毒螺旋體不易在體外培養(yǎng)，但可在猿猴、白鼠、倉鼠、豚鼠和家兔體內(nèi)得到很好的繁殖。大量研究顯示家兔是研究梅毒很好的模型，經(jīng)睪丸接種可以對梅毒螺旋體進(jìn)行擴大培養(yǎng)，而經(jīng)背部皮膚接種可以很好的模擬人感染梅毒后一期的臨床癥狀[8]。梅毒感染初期組織學(xué)特征是單核細(xì)胞浸潤，在感染第6天，即有淋巴細(xì)胞浸潤，13天達(dá)高峰，隨之巨噬細(xì)胞出現(xiàn)，病灶中浸潤的淋巴細(xì)胞以T細(xì)胞為主。大約經(jīng)6～8周，大量螺旋體進(jìn)入血液循環(huán)，向全身播散。研究顯示在家兔感染大量的梅毒螺旋體(2×107)，3～4周即可引起全身炎癥損害[9]，在本研究中顯示接種梅毒螺旋體后2周所有睪丸接種組的家兔均出現(xiàn)心、肝、腎的炎癥反應(yīng)。但在原代組和一代組及二代組之間沒有差異，而本研究組對原代梅毒螺旋體接種家兔2周后，原代組血清RPR的滴度比一代和二代的滴度低[7]，這可能與病理的改變的量化效果較差，因此不能夠敏感的反應(yīng)之間的不同有關(guān)。

背部皮膚接種梅毒螺旋體組經(jīng)藥物治療后較長一段時間內(nèi)，其主要器官的炎癥未能完全清除，其中RPR未能轉(zhuǎn)陰及RPR轉(zhuǎn)陰6周其主要器官的炎癥仍然存在，而RPR轉(zhuǎn)陰11周后，其主要器官方才無明顯炎性細(xì)胞浸潤，未見明顯病變。提示梅毒感染后血清RPR滴度轉(zhuǎn)陰后可能需要很長一段時間(6～11周)其心肝腎的炎癥反應(yīng)才能完全清除。因此病理觀察可以進(jìn)一步了解疾病的發(fā)生發(fā)展情況，但是缺乏量化的指標(biāo)，反應(yīng)不夠靈敏，且需要組織切片，操作復(fù)雜，對于動物的損傷較大，因此在進(jìn)行梅毒兔藥效學(xué)模型建立過程中無需增加病理學(xué)的數(shù)據(jù)，但在治愈轉(zhuǎn)陰后通過病理切片的觀察可以進(jìn)一步驗證能更好地了解治愈的效果。

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Pathological changes ofm ajor organs in New Zealand rabbitmodels inoculated w ith Treponema pallidum

HAN Yan，LIU Hongye，YIN Yueping，GONG Kuanglong，ZHONGMingying，ZHU Xiaoyu，SHIMeiqin.
Institute of Dermatology，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Nanjing 210042，China

Objective:To investigate the pathological changes ofmajor organs in rabbitmodels inoculated with Treponema pallidum which has different continuous passages and is treated with different drugs and doses. M ethods:One New Zealand rabbitwas selected to bedissected.The heart，liver，spleen and kidney from primary，first and second generation group and negative control group in testis-inoculated groups were used for the pathological examination.In dorsal skin-inoculated groups，these organswere taken from one rabbitselected from positive control group，two doses of procaine benzylpenicillin and ceftriaxone sodium groups.After fixed by 10%formalin solution，these organs were dehydrated，paraffine-embedded and sliced for HE staining.Results:After infected with Treponema pallidum for two weeks，the heart，liver，and kidney tissue of the rabbitwere infiltrated within flammatory cells，but no pathological changeswere observed in spleen tissue. And also there were no significant difference in the inflammatory changes of the organs between the three passages of Treponema pallidum.After treated with drugs for12 weeks，somemajor organs of the rabbitwere infiltrated with inflammatory cells，butno obvious infiltration of inflammatory cellswere observed in these tissue of the infected rabbit treated with ceftriaxone sodium after the RPR titerwas negative for 11 weeks.Conclusion: Pathologic observation is not essential for pharmacological evaluation，but the results can verify the efficacy of the treatment.

Treponema pallidum；New Zealand rabbit；infected models；pathologic change

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病醫(yī)院，南京，210042

尹躍平，E-mail:Yinyp@ncstdlc.org