5-ALA-PDT法在HPV11.HaCaT細胞模型中的應用

宋莎莎 孫 洋 李新宇 王永芳

·論著·

5-ALA-PDT法在HPV11.HaCaT細胞模型中的應用

宋莎莎 孫 洋 李新宇 王永芳

目的: 確定光動力療法(5-ALA-PDT)對攜帶HPV11全基因組的HaCaT細胞(HPV11. HaCaT)模型的影響。方法: HPV11.HaCaT細胞培養(yǎng)傳代后分別用不同濃度5-ALA(0.375、0.75、1.5、3 mM)，或不同劑量紅光(10、20、40 J/cm2)，或不同濃度5-ALA結(jié)合不同劑量紅光處理。用MTT法檢測細胞增殖，實時熒光定量PCR測定HPV11早期基因E5、E6和E7mRNA的表達。結(jié)果: 0.75mM以上濃度的5-ALA聯(lián)合20或40 J/cm2紅光，細胞存活率均在50%以下(P＜0.01)。0.375mM 5-ALA聯(lián)合20 J/cm2紅光能明顯降低HPV11 E6和E7mRNA表達，相對表達量為0.28和0.26(P＜0.01)，而0.75mM 5-ALA聯(lián)合20 J/cm2紅光處理對HPV11 E6和E7mRNA表達影響不明顯，相對表達量為0.85和1.46(P＞0.05)，但以上兩種處理條件對HPV11 E5 mRNA的表達均無明顯影響。結(jié)論: 5-ALAPDT法應用于HPV11.HaCaT細胞模型能抑制HPV11.HaCaT細胞增殖，并能降低該細胞中HPV11 E6、E7mRNA的表達。

HPV11.HaCaT； 尖銳濕疣； 光動力療法； 細胞增殖； 早期基因

人乳頭瘤病毒(Human papilloma virus，HPV)是在鱗狀上皮復制的雙鏈環(huán)狀DNA病毒，可通過與感染皮膚接觸傳播。根據(jù)HPV致惡性程度的不同，分為高危型(如 HPV16、HPV18等)和低危型(如HPV6、HPV11等)兩類。因高危型HPV的致癌性，基礎和臨床研究較多，相對而言低危型HPV的研究較少。尖銳濕疣(Condyloma acuminatum，CA)是我國性傳播疾病中位居第三位的疾病[1]，主要由低危型HPV(90%以上為HPV6/11)感染引起，以皮膚、黏膜部位出現(xiàn)疣狀增生性病變?yōu)樘卣鳌Ｄ壳芭R床上CA的治療主要通過激光、冷凍、手術或局部用藥，以去除肉眼所見的疣體為主，而直接針對病原體本身的抗HPV藥物尚無，這亦是HPV潛伏感染以及CA容易復發(fā)的原因之一。由于HPV高度的種屬特異性以及其生長周期與宿主細胞分化狀態(tài)的密切相關性，迄今為止，HPV不能在動物體成功接種和生長，也無法在體外組織培養(yǎng)系統(tǒng)中繁殖，這是制約HPV深入研究以及抗HPV藥物研發(fā)的重要因素。近年來，隨著細胞和分子生物學技術的發(fā)展，已經(jīng)出現(xiàn)了數(shù)種含高危型HPV的轉(zhuǎn)化細胞系或人工構建的細胞模型供研究者應用，而因為低危型HPV的E6、E7基因不具備轉(zhuǎn)化活性和永生化能力，病毒基因在體外宿主細胞中較難穩(wěn)定維持，因此低危型HPV的體外感染模擬系統(tǒng)研究的較少。本課題組在以往研究中成功構建了攜帶HPV11全基因組的HaCaT角質(zhì)形成細胞(HPV11. HaCaT)[2]，并證明在一定傳代次數(shù)以及凍存、復蘇后，細胞中HPV11游離型基因組穩(wěn)定維持，病毒基因能正常復制和表達[3，4]，且經(jīng)raft培養(yǎng)后證實所構建的重組細胞系統(tǒng)能支持HPV11的完整生命周期[5]。為了進一步探討所構建的HPV11.HaCaT細胞作為抗HPV11藥效學模型應用的可能性，我們亦采用了有治療CA線索的藥物或化合物進行了初步嘗試并獲得了相應的結(jié)果[4]。本研究中我們將通過5-氨基-4 -酮戊酸鹽介導的光動力療法(aminolevulinicaid photodynamic therapy，5-ALA-PDT)在HPV11.HaCaT細胞模型上的應用，觀察它對攜帶病毒基因組細胞生長增殖的影響，以及對HPV11早期基因E5、E6和E7 mRNA表達的影響，以進一步考證HPV11.HaCaT細胞作為藥效學模型應用的可行性，5-ALA-PDT在臨床上已用于治療CA，并取得明顯療效[6]。

1 材料和方法

1.1 材料 HPV11.HaCaT細胞由本實驗室在前期研究中通過環(huán)化HPV11全長DNA后經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至HaCaT角質(zhì)形成細胞中構建而成[2]。DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)。新生牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)。5-ALA(上海復旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司，含量100.0%，批號140401)。四甲基偶氮唑鹽(MTT，美國Sigma公司)。Trizol(美國Invitrgen公司)。PrimeScriptTMRTMaster Mix(日本TaKa-Ra公司)。PCR引物(上海生工生物工程有限公司合成，具體序列見表1)。SYBR?Select Master Mix(美國Applied Biosystems公司)。細胞培養(yǎng)板(美國Corning公司)。7300型實時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)。酶聯(lián)免疫檢測儀(Thermo公司)。LED治療儀(LEB-IB，武漢亞格光電技術有限公司)。M92C型激光功率測試儀(北京光電技術研究所)。

表1 熒光PCR引物序列

1.2 細胞培養(yǎng)與傳代 HPV11.HaCaT細胞培養(yǎng)于含10%新生牛血清DMEM中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱生長。細胞達80%融合時用含0.02%EDTA的0.25%胰酶消化，用培養(yǎng)基調(diào)整為2×104/孔密度接種96孔細胞培養(yǎng)板，或按1×106/孔接種6孔板，培養(yǎng)過夜。

1.3 分組及處理 分為空白組(無任何處理)、單純5 -ALA(0.375、0.75、1.5、3 mM)處理組、單純紅光(10、20、40 J/cm2)處理組、不同濃度5-ALA分別結(jié)合不同劑量紅光處理組。細胞培養(yǎng)24 h后吸除培養(yǎng)基，按設定的分組加入用2%新生牛血清DMEM培養(yǎng)基配制的不同濃度5-ALA，避光培養(yǎng)24 h，用無菌PBS漂洗1次，加入少量PBS后接受不同劑量紅光照射。照射完畢后去除孔內(nèi)PBS，加入含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4 MTT法檢測細胞增殖 培養(yǎng)結(jié)束后，96孔板加5mg/mLMTT液，20μL孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)基，加入150μL/孔DMSO，避光震蕩混勻15 min使藍紫色沉淀充分溶解，在酶標儀下以550 nm波長測定吸光度。

1.5 熒光定量PCR檢測HPV11E5、E6和E7 mRNA表達 用Trizol提取細胞總RNA。將總RNA反轉(zhuǎn)錄為第1鏈cDNA，得到的cDNA進行實時熒光定量PCR測定。擴增體系為cDNA 1.5μL，上下游引物各0.8μL，SYBR?Select Master Mix 10μL，無核酶水6.9 μL，總體積為20μL。擴增條件為50℃2 min；95℃2 min；95℃15 s，58℃15 s，72℃1min，40個循環(huán)，并添加熔解曲線以確保擴增產(chǎn)物的特異性。每個樣品設3個復孔，同時設內(nèi)參(β-actin)對照，結(jié)果通過△△Ct法分析。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，P＜0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 5-ALA-PDT應用后對HPV11.HaCaT細胞增殖的影響 單純給予0.375、0.75、1.5、3 mM 5-ALA后，HPV11.HaCaT細胞的增殖不受影響，細胞存活率均在95%以上；單純用 10、20、40 J/cm2紅光處理HPV11.HaCaT細胞，細胞的存活率亦在92%以上。以上各組的OD550 nm值與空白組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。但將不同濃度5-ALA聯(lián)合不同劑量的紅光處理HPV11.HaCaT細胞后，發(fā)現(xiàn)5-ALA在0.75 mM以上濃度時聯(lián)合20或40 J/cm2紅光，細胞存活率明顯降低，均低于50%，其OD550 nm值與單純給予同濃度5-ALA組或單純給予同劑量紅光處理組相比，有明顯差異(均P＜0.01)。見圖1。

2.2 5-ALA-PDT應用后對HPV11.HaCaT細胞中HPV 11早期基因E5、E6和E7 mRNA表達的影響根據(jù)以上細胞增殖試驗的結(jié)果，0.375和0.75 mM濃度5-ALA聯(lián)合20 J/cm2紅光照射時，HPV11.HaCaT細胞的存活率分別為99%和87%，我們選擇了這兩個濃度的5-ALA并聯(lián)合20 J/cm2紅光照射處理，進行HPV11早期基因表達試驗。結(jié)果顯示，0.375 mM 5-ALA聯(lián)合20 J/cm2紅光處理后明顯降低HPV11 E6和E7 mRNA表達(相對表達量為0.28和0.26)，與單純給予0.375 mM 5-ALA處理組或單純用20 J/cm2紅光照射組比較，均有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。而0.75 mM 5-ALA+20 J/cm2紅光處理后，HPV11 E6和E7 mRNA表達(相對表達量為0.85和1.46)并未出現(xiàn)明顯降低(P＞0.05)。此外，以上兩種聯(lián)合處理條件對HPV11 E5 mRNA的表達均無影響(相對表達量均大于1)。見圖2。

圖1 不同濃度的5-ALA聯(lián)合不同劑量的紅光照射對HPV11.HaCaT細胞增殖的影響

圖2 5-ALA-PDT對HPV 11早期基因E5、E6和E7mRNA表達的影響

3 討論

尖銳濕疣的高復發(fā)率一直是臨床治療中的棘手問題。深入探討HPV與宿主免疫間的相互關聯(lián)以及研發(fā)直接針對病原體的抗HPV藥物將有益于突破這一難點，而其中建立HPV的體外模擬感染系統(tǒng)并將其轉(zhuǎn)化為抗HPV的藥效學體外模型具有重要意義。前期研究中我們構建了攜帶HPV11全基因組的角質(zhì)形成細胞，為了探討該體外模擬感染的細胞模型向抗HPV11藥效學模型轉(zhuǎn)化的可行性，需要用已知陽性治療藥物進行考核，而目前市場上尚無直接針對HPV的藥物，因此我們選擇了有CA治療線索的藥物進行初步探索并獲得了一定的結(jié)果[4]。本研究中我們選擇5-ALA-PDT作為探針，進一步探討HPV11.HaCaT細胞用于測試抗HPV11藥效的可行性。PDT法是自二十世紀七十年代末迅速發(fā)展起來的一種針對增生性病變組織的選擇性治療技術，近年來國內(nèi)外亦將此應用于治療非腫瘤性疾病如尖銳濕疣、鮮紅斑痣、銀屑病、類風濕性關節(jié)炎等，并取得一定療效。5-ALA及其衍生物是第二代新型光敏劑，是人體血紅蛋白生物合成的前體物質(zhì)，其本身并無光毒作用，在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化成內(nèi)源性光敏劑原卟啉IX，經(jīng)特定波長光源激發(fā)后產(chǎn)生光動力學反應，產(chǎn)生單線態(tài)氧和自由基等毒性因子，進而殺傷增殖旺盛的細胞。5-ALA-PDT法治療尖銳濕疣具有組織選擇性好、安全性高、不良反應少、復發(fā)率低及患者依從性好等特點，該方法在治療尖銳濕疣中對HPV本身的作用并不清楚。5-ALA -PDT法包括三個要素:光敏劑、照射光和氧。由于活體組織本身有一定含氧量，因此光敏劑濃度和照射光的劑量成為影響PDT療效的關鍵因素。我們將不同濃度的5-ALA、不同劑量的紅光以及兩者聯(lián)合應用于HPV11.HaCaT細胞后，結(jié)果表明，單純用不同濃度的5-ALA處理或單純用不同劑量的紅光照射對HPV11.HaCaT細胞的生長無明顯影響。而用0.75 mM以上濃度的5-ALA聯(lián)合20 J/cm2或40 J/cm2紅光照射時，可明顯降低HPV11.HaCaT細胞的存活率，提示此種條件下5-ALA-PDT法能達到抑制感染細胞增殖的效果。

HPV病毒基因組中的早期基因控制著病毒的轉(zhuǎn)錄、復制以及宿主細胞的增生或惡性轉(zhuǎn)化，其中E5、E6、E7為癌基因。高危型HPV的E5、E6、E7基因分別通過干擾宿主細胞周期蛋白以及與p53和pRb的結(jié)合在致癌機制中起著關鍵作用[7]。雖然在低危型HPV感染的細胞中，E6和E7蛋白與宿主細胞p53和pRb結(jié)合的親和力較高危型低[8]，但低危型HPV的E5、E6、E7基因在病毒的致病和免疫逃逸等方面亦發(fā)揮著重要作用。我們選擇HPV11 E5、E6、E7 mRNA的表達作為指標，觀察5-ALA-PDT應用于HPV11. HaCaT細胞模型后對HPV11的影響。實驗中我們選擇了對細胞存活影響較小的條件，即5-ALA濃度為0.375和0.75 mM，紅光照射劑量為20 J/cm2，觀察5-ALA-PDT對上述三種基因mRNA表達的影響。結(jié)果表明，0.375 mM 5-ALA聯(lián)合20 J/cm2的紅光照射能顯著抑制HPV11 E6和E7 mRNA表達，提示5-ALAPDT臨床治療尖銳濕疣有效可能與其能抑制HPV11 E6和E7基因表達有關。實驗中也發(fā)現(xiàn)，在0.75 mM 5-ALA聯(lián)合20 J/cm2紅光照射后對HPV11 E6和E7 mRNA表達并未顯示明顯抑制作用，提示選擇合適的光敏劑濃度可能對抑制病毒早期基因表達有一定影響，需要深入探討。5-ALA-PDT法在我們的細胞模型中也未觀察到對HPV11 E5 mRNA表達有明顯的降低作用，提示該方法在臨床治療CA中發(fā)揮的作用可能與抑制HPV11 E5基因表達無明顯關聯(lián)，這亦需要進一步考證。

以上研究表明，5-ALA-PDT法應用于我們前期構建的HPV11.HaCaT細胞后，能表現(xiàn)出對HPV11感染細胞增殖的有效抑制，以及對HPV11 E6、E7mRNA表達的明顯降低，這一方面提示了HPV11.HaCaT細胞模型用于測試抗HPV11藥效的可能性，同時亦證明5-ALA-PDT法有效治療尖銳濕疣可能與其能抑制病毒感染細胞的增殖以及降低早期基因表達有關，其他確切機制尚待進一步研究。

(志謝:上海復旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司提供5-ALA樣品和LED治療儀，特此感謝!)

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(收稿:2016-06-30)

The app lication of 5-ALA-PDT in HPV11.HaCaT cellmodel

SONG Shasha，SUN Yang，LIXinyu，WANG Yongfang.
Institute of Dermatology，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Nanjing 210042，China

Objective:To determine the impactof 5-ALA-PDT on the HPV11.HaCaT cellmodel(HaCaT keratinocytes harboring human papillomavirus type 11 episome).Methods:Cultured HPV11.HaCaT cells were treated with 5-ALA(0.375、0.75、1.5、3 mM)，red light irradiation(10、20、40 J/cm2)，or different concentration of 5-ALA combined with different dose of red light irradiation.The effects on cells proliferation were examined by MTT assay.The alterations of HPV11 E5，E6 and E7 mRNA expression level were examined by real-time fluorescence quantitative PCR.Results:When 5-ALA concentration was higher than 0.75 mM and combined with 20 or 40 J/cm2red light irradiation，the survival rate of the cells was less than 50% (P＜0.01).When 0.375 mM 5-ALA combined with 20 J/cm2red light irradiation，the expression of HaCaT keratinocyteswas significantly reduced，with relative expression rates of 0.28 and 0.26(P＜0.01).0.75mM 5 -ALA combined with 20 J/cm2red light irradiation did not inhibit the expression of HPV11 E6 and E7mRNA，with relative expression rates of 0.85 and 1.46(P＞0.05).However，the two kinds of treatmentmentioned above did notaffect the expression of HPV11 E5mRNA.Conclusion:5-ALA-PDT can effectively impacton the HPV11.HaCaT cell model，such as the proliferation of the HPV11.HaCaT cells and the expression of HPV11 E6 and E7 mRNA.

HPV11.HaCaT；condyloma acuminatum；Photodynam ic therapy；cell proliferation；early genes

中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院皮膚病研究所藥物研究室，210042

李新宇，E-mail:xinyusli609@163.com