海南民族習(xí)用香藥兩用降真香的原植物品種鑒定

張丹雁，高世軍，張 雷，張靖年，莫 偉

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006；2.江蘇天士力帝益藥業(yè)有限公司，江蘇淮安 223003；3.廣州市合贏醫(yī)藥科技有限公司，廣東廣州 510410)

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海南民族習(xí)用香藥兩用降真香的原植物品種鑒定

張丹雁1，高世軍1，張 雷2，張靖年1，莫 偉3

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006；2.江蘇天士力帝益藥業(yè)有限公司，江蘇淮安 223003；3.廣州市合贏醫(yī)藥科技有限公司，廣東廣州 510410)

[目的]鑒定海南民族習(xí)用2種香藥兩用藤類降真香的原植物品種，保護(hù)和開發(fā)海南降真香資源。[方法]采用實(shí)地調(diào)研、采訪觀察山區(qū)植物生長(zhǎng)狀況和形態(tài)特征、收集標(biāo)本，用基原鑒定法、性狀鑒定法以及植物DNA條形碼技術(shù)鑒別海南降真香原植物品種。[結(jié)果]海南大葉降真香和海南小葉降真香的藤本植物形態(tài)、香藥材性狀特征及DNA條形碼特征分別與兩粵黃檀DalbergiabenthamiiPrain和斜葉黃檀Dalbergiapinnata(Lour.)Prain相吻合。[結(jié)論]海南民族習(xí)用2種藤類降真香分別來(lái)源于豆科蝶形花亞科黃檀屬植物兩粵黃檀Dalbergiabenthamii和斜葉黃檀Dalbergiapinnata富含樹脂的木材。

降真香；基原鑒定；性狀鑒別；DNA條形碼

降真香又名紫藤香、雞骨香，古代本草《南方草木狀》[1]、《證類本草》[2]、《本草綱目》[3]已有收載。史料[3]和現(xiàn)代文獻(xiàn)[4]記載，降真香早在古代就成為宮廷達(dá)官貴族的熏香原料，同時(shí)古戰(zhàn)場(chǎng)常用作刀傷止血外用藥。海南民間亦視其為珍品，尤其是少數(shù)民族地區(qū)，實(shí)地考察證明，民間認(rèn)為其具有活血化瘀、祛風(fēng)濕、消腫止血及解毒等作用，常用作跌打損傷、刀傷、燙傷、蟲蛇叮咬等外用藥，同時(shí)亦可內(nèi)服作為心血管疾病防治用藥，此外《中國(guó)植物志》斜葉黃檀項(xiàng)下記載其“治風(fēng)濕、跌打、扭挫傷，有消腫止痛之效”[5]。鑒于古今中外及民間有關(guān)降真香香藥兩用的記載和應(yīng)用歷史，海南降真香具有較高的香藥兩用的潛在經(jīng)濟(jì)價(jià)值和應(yīng)用前景。

近幾年來(lái)海南香料及工藝品市場(chǎng)上出現(xiàn)一類被當(dāng)?shù)孛耖g稱為降真香的藤類木質(zhì)香料，經(jīng)筆者實(shí)地考察發(fā)現(xiàn)，該香料按其原植物形態(tài)分為大葉型和小葉型2個(gè)品種，均采自海南各山區(qū)森林中。民間采訪發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)孛癖娪绕涫巧贁?shù)民族將其分別稱為花梨藤和酸豆藤，自古以來(lái)除用作熏香香材外，還常用作創(chuàng)傷外用藥，且泡酒內(nèi)服用于心血管等疾病防治，故降真香又被當(dāng)?shù)孛癖姺Q為“藤總管”。除此以外，現(xiàn)今工藝品市場(chǎng)上還出現(xiàn)了大量以降真香藤材做成的根雕、擺件、佛珠、手串、項(xiàng)鏈、線香及煉制精油等工藝品和熏香用品。然而這些被當(dāng)?shù)孛癖姾凸に囀袌?chǎng)稱為降真香的藤類材質(zhì)究竟來(lái)源于何物種，至今尚未明確。筆者采用實(shí)地調(diào)研、采訪觀察山區(qū)植物生長(zhǎng)狀況和形態(tài)特征、收集標(biāo)本，用基原鑒定法、性狀鑒定法以及植物DNA條形碼技術(shù)鑒別海南降真香原植物品種，以期更好地保護(hù)和開發(fā)海南降真香資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材。海南大葉降真香及海南小葉降真香植物藤本，采自海南省尖峰嶺、霸王嶺及黎母山等山區(qū)；海南大葉降真香木材及海南小葉降真香香料木材，海南降真香協(xié)會(huì)提供；樣品均保存于廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室。

1.1.2 試劑。天根植物基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司，DP305]；6×Loading buffer(Thermo，美國(guó))；Goldview(Life Technologies，美國(guó))；Agarse(Life Technologies，美國(guó))；PrimeSTAR?HS Premix(TaKaRa，大連)；DL2000 DNA Marker(Bioteke，北京)；rbcL、matK及ITS2序列引物(由華大基因合成)。

1.1.3 儀器。1-15型臺(tái)式高速離心機(jī)(德國(guó)Sigma有限公司，德國(guó))；JY1000C電泳儀(上海京工實(shí)業(yè)有限公司，中國(guó))；T100型PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)伯樂(lè)有限公司，美國(guó))；Eppendorf Research plus微量移液器(艾本德中國(guó)有限公司，德國(guó))；Precisa XS 125A型電子分析天平(瑞士Precisa有限公司，瑞士)；K-WHS型數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠，中國(guó))；Lab Dancer/MS3型渦旋混合儀(德國(guó)IKA有限公司，德國(guó))；HR-220型掌上離心機(jī)(北京鼎昊源科技有限公司，中國(guó))。

1.2 方法 1.2.1 基原鑒定及性狀鑒定。通過(guò)實(shí)地調(diào)研、采訪觀察山區(qū)植物生長(zhǎng)狀況和形態(tài)特征、收集標(biāo)本，記錄描述海南大葉降真香及海南小葉降真香原植物形態(tài)及香材性狀特征。1.2.2 DNA條形碼鑒別。

1.2.2.1 樣品前處理。將采集得到的新鮮葉片迅速裝入到裝有變色硅膠的密封袋中，以使盡量干燥完全。

1.2.2.3 PCR擴(kuò)增體系及擴(kuò)增反應(yīng)程序。PCR擴(kuò)增體系及擴(kuò)增反應(yīng)程序分別見(jiàn)表1～2。

表1 PCR擴(kuò)增體系

表2 擴(kuò)增反應(yīng)程序

1.2.2.4 電泳檢測(cè)。上樣量分別是DNA模板10 μL、PCR產(chǎn)物5 μL、Marker 3 μL。電泳條件是100 V、400 mA、30 min。

1.2.2.5 測(cè)序及分析。PCR樣品送樣30 μL，正向引物rbcLa-F、KIM-3F和s2F分別送樣15 μL，交由華大基因進(jìn)行測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果使用DNAMAN手動(dòng)切除兩端引物及低質(zhì)量片段，登陸Genebank進(jìn)行在線Blast。

2 結(jié)果與分析

2.1 基源鑒別

2.1.1 海南大葉降真香。木質(zhì)藤本，枝長(zhǎng)，干時(shí)外皮黑色。羽狀復(fù)葉，葉軸、葉柄均略被伏貼微柔毛；小葉2～3對(duì)，近革質(zhì)，卵形或橢圓形，先端鈍，微缺，基部楔形，上面無(wú)毛，下面干時(shí)粉白色，略被伏貼微柔毛(圖1)?；ü诎咨?，每瓣具長(zhǎng)柄，旗瓣橢圓形，先端稍缺，外翻，翼瓣倒卵狀長(zhǎng)圓形，一側(cè)具內(nèi)彎的耳，龍骨瓣近半月形，內(nèi)側(cè)具耳；雄蕊9，子房無(wú)毛，花柱錐狀。莢果薄革質(zhì)，舌狀長(zhǎng)圓形，種子1～2粒，扁腎形?；ㄆ?—3月。

圖1 海南大葉降真香野外生境Fig.1 Wild habitat of big-leaf Jiangzhenxiang in Hainan

2.1.2 海南小葉降真香。藤狀灌木，枝條略為曲折；奇數(shù)羽狀復(fù)葉有小葉23～25片；葉軸、葉柄及小葉柄均被褐色短柔毛；托葉披針形，被毛；小葉紙質(zhì)，斜長(zhǎng)圓形，先端微凹，基部?jī)蓚?cè)極不對(duì)稱，一側(cè)偏斜呈楔形，另一側(cè)近圓形，嫩葉兩面被褐色短柔毛，老葉上面無(wú)毛，背面青白色；小葉柄短?；ü诎咨v果薄，膜質(zhì)，長(zhǎng)圓狀舌形，干時(shí)褐色有光澤，表面有細(xì)網(wǎng)紋，有種子1～4粒，狹長(zhǎng)而扁，黑褐色(圖2)?；ㄆ?—4月。

圖2 海南小葉降真香野外生境Fig.2 Wild habitat of small-leaf Jiangzhenxiang in Hainan

2.2 性狀鑒別

2.2.1 海南大葉降真香香材。呈不規(guī)則的長(zhǎng)條圓柱形或短柱狀，常彎曲，稍扭曲，皮部刮除。表面見(jiàn)縱向刀刮痕和多數(shù)棕黑色樹脂條斑紋，殘留淺黃棕色至紅棕色木部，偶見(jiàn)隆起的結(jié)節(jié)，年久者見(jiàn)黃色膜狀物(習(xí)稱“黃藥膜”)(圖3a)。質(zhì)堅(jiān)硬，體重，橫切面見(jiàn)外層黑色環(huán)狀樹脂斑向內(nèi)滲透，油潤(rùn)，散在密布導(dǎo)管孔，中部常中空(圖3b)或見(jiàn)紅棕色木部心材(圖3c)，年老者偶見(jiàn)外圍多輪同心環(huán)狀黃色夾層。氣芳香，味辛，微苦，火燒冒黑煙，具香氣，顯油性。

注：a.表面觀；b.斷面觀(空心)；c.斷面觀(實(shí)心)。Note：a.Surface view；b.Section view(hollow)；c.Section view(solid).圖3 海南大葉降真香香材Fig.3 Fragrance ingredient of big-leaf Jiangzhenxiang in Hainan

2.2.2 海南小葉降真香香材。性狀與海南大葉降真香相似，香材表面木紋細(xì)膩，見(jiàn)多數(shù)黑色樹脂條斑，間有淺灰棕色至紅棕色木部(圖4a)，橫切面導(dǎo)管孔細(xì)小，外層見(jiàn)黑色樹脂環(huán)，常中空(圖4b)，實(shí)心油足者見(jiàn)黑色樹脂斑，間有單個(gè)或數(shù)個(gè)淺灰棕色類圓形木質(zhì)部(圖4c)，實(shí)心油少者見(jiàn)淺棕色木部，間有單個(gè)或數(shù)個(gè)黑色樹脂斑塊，表面及斷面極少見(jiàn)黃色膜。質(zhì)地致密堅(jiān)硬，略顯椰香氣。

注：a.表面觀；b.斷面觀(空心)；c.斷面觀(實(shí)心)。Note：a.Surface view；b.Section view(hollow)；c.Section view(solid).圖4 海南小葉降真香香材Fig.4 Fragrance ingredient of small-leaf Jiangzhenxiang in Hainan

2.3 DNA提取及PCR擴(kuò)增結(jié)果 海南大葉降真香及海南小葉降真香DNA模板電泳條帶均呈彌散狀(圖5a)，表明所提取DNA模板存在一定程度的降解；海南大葉降真香及海南小葉降真香PCR均擴(kuò)增出單一清晰的目標(biāo)條帶，ITS2序列約500 bp，rbcL序列約為600 bp，MatK序列約為450 bp(圖5b)，表明PCR體系及擴(kuò)增條件對(duì)模板DNA擴(kuò)增效果理想，特異性高，適用于該試驗(yàn)降真香香材模板DNA的PCR擴(kuò)增研究。

注：M為Marker D2000；1為海南小葉降真香DNA模板；2為海南大葉降真香DNA模板；3為海南小葉降真香ITS2 PCR產(chǎn)物；4為海南大葉降真香rbcL PCR產(chǎn)物；5為海南大葉降真香MatK PCR產(chǎn)物。Note：M.Marker D2000；1.DNA template of small-leaf Jiangzhenxiang in Hainan；2.DNA template of big-leaf Jiangzhenxiang in Hainan；3.PCR products of small-leaf Jiangzhenxiang ITS2 in Hainan；4.PCR products of big-leaf Jiangzhenxiang rbcL in Hainan；5.PCR products of big-leaf Jiangzhenxiang MatK in Hainan.圖5 DNA模板(a)PCR產(chǎn)物(b)電泳圖譜Fig.5 Electrophoretogram of PCR products(b)of DNA template(a)

2.4 測(cè)序結(jié)果及分析

2.4.1 海南大葉降真香。剪切后rbcL序列：ATTATAAA TTGACTTATTATACTCCTGACTATGAAACGAAAGATACTGATATCTTGGCCGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCTCCTGAAGAAGCGGGTGCCGCGGTAGCTGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACCGTTTGGACCGATGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACAACATCGAGCCCGTTGCTGGAGAAGAAAATCAATATATTGCTTATGTAGCTTATCCCTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTAGGTAATGTATTTGGGTTCAAGGCCCTGCGTGCCCTACGTCTGGAAGATTTGCGAATCCCTACTTCTTATATTAAAACTTTCCAAGGTCCGCCTCACGGTATCCAAGTTGAAAGAGATAAATTAAACAAGTATGGCCGTCCCCTATTGGGATGTACTATTAAACCGAAATTGGGGTTATCCGCTAAGAATTACGGTCGAGCAGTTTATGAATGTCTCCGCGGTGGATTGAATTTTACAAA，在線Blast結(jié)果與兩粵黃檀Dalbergiabenthamii的同源性為99%，e-value：0。目標(biāo)序列GeneBank登陸號(hào)：KM510238.1。

剪切后matK序列：TATCCGCAAAAATCGGTTAATAATA TCAAAATCGGATGAATCGGCCCAAACAGGCTTACTAATGGGATGCCCTAATATATTACAAAATTTCGCTTTAGCCAAAGATCTAATTAAAGGAATAATTGGAACTATTGTATCAAGCTTTTTCATAAAAATTTCAATTAAAAATGAATTTTCTAGCATTTGATTCCGGACCACTGAAAAATTTAGCCGCACATTTGAAAAATAGCCCCCCCAAAAAAAATGAAATGAATGCTCGGATAATAATGGATTTATATGGATCGTTCCAGGTTGAAACCAAACATCAAAATGACATTGCCAAAAATAAATGAAATAGTGTTTCCATTTATTCATCAAAAAAGGCGCATTCTTTGAAGCCAAAATGGCTTTTCCTTGATATCTAACATAATGAATCAAAGGATCCTTGAAAAATGATAAGGTAAACAAAAAATTCTTAAAAAAAACTTCCACAAAATGTTCGATTTTTGCATAAAAATAAATTCCCTCAAAAATAACGATAAAAGAGTTTAATCGTAAATAAAAGGATCTCTTACGTAAAAAAAGGAAAATGGATTCGTGTTCACATACATAAAAATTATATAGGAACAAGAGAATTCTTGGATTACTTTTTGAAAAAGTAGAAAT CAGTTTTTTTTTAGTAATAATACTATTCCAATTACAATACTCATAAATAAACAATCTTAATAAATGAAGGAGGGGGATCTTTCACCCAGTATCGAAGACTTTGAACCAAGATTCATTAGGAGAACTGGTTTA，在線Blast結(jié)果與兩粵黃檀Dalbergiabenthamii的同源性為97%，e-value：0。目標(biāo)序列GeneBank Accession：KM521278.1。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[6]，相似性高于95%時(shí)，可判斷為同源。樣品rbcl序列及matK序列同GenBank中兩粵黃檀Dalbergiabenthamii同源性均高于95%，表明樣品為兩粵黃檀Dalbergiabenthamii。

2.4.2 海南小葉降真香。剪切后ITS2序列：GCGGGGACTC GAGTCTTTGACGCAGTTGCGCCCGAAGCCATTAGGCCAAGGGCACGCCTGCCTGGGTGTCATTGACCGTTGCCCCAGCCCCCCGTGCCCGTGGCCGGGGAGCGGGGCGAATGCTGGCTTCCCGTGAGCGCCGCCTCGCGGTTGGCTGAAAATTGGGTTCGTGGTGGACGAAGCGCCATGACAGACGGTGGTTGAGCGAGTTCTCGAGGCCAGTCATGCGCGCGGCCTCCACCAGCTGCGTGCCCAGTGACCCGCGGGCGATCGCCCATGACGCGACCTCAGGTCAGGCGGGGCTACCCGCTGAGTTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACTAACGAGGATTCCCCTAGTAACGGCGAGCGAA CCGGGAAGAGCCCACCATGAGAATCGGTCGCCACTGGCGTCTGAATTGTAGTCTGAA，在線Blast結(jié)果與斜葉黃檀Dalbergiapinnata的同源性為99%，e-value：1e-101，目標(biāo)序列GeneBank Accession：KP092715.1。樣品ITS2序列同斜葉黃檀Dalbergiapinnata同源性高于95%，表明樣品為斜葉黃檀。

3 結(jié)論與討論

結(jié)合降真香藤莖形態(tài)、香材外觀性狀特征及植物DNA條形碼特征，2種藤類降真香的原植物均來(lái)源于豆科蝶形花亞科黃檀屬，其中大葉降真香為兩粵黃檀DalbergiabenthamiiPrain，小葉降真香為斜葉黃檀Dalbergiapinnata(Lour.)Prain?！吨袊?guó)植物志》對(duì)于兩粵黃檀的拉丁名記載為DalbergiabenthamiPrain，其種加詞benthami系拼寫錯(cuò)誤，新版Flora of China已更正為DalbergiabenthamiiPrain，故該研究采用更正后的名稱。

試驗(yàn)結(jié)果表明目前海南工藝品市場(chǎng)上經(jīng)營(yíng)流通和民間所用的香用商品降真香為豆科蝶形花亞科黃檀屬植物兩粵黃檀Dalbergiabenthamii及斜葉黃檀Dalbergiapinnata富含樹脂的木材?，F(xiàn)今中醫(yī)藥文獻(xiàn)收載、期刊報(bào)道以及中藥市場(chǎng)也有一種叫降真香的中藥，與海南降真香名字相符，但前者為喬木類藥用降真香，其來(lái)源于蕓香科山油柑屬山油柑Acronychiapedunculata(L.)Miq.心材[7]，后者為藤類香用降真香，其來(lái)源于豆科黃檀屬兩粵黃檀和斜葉黃檀，因此香用藤類降真香商品名稱與現(xiàn)今中藥市場(chǎng)上所用喬木類中藥降真香實(shí)為同名異物，應(yīng)予以區(qū)別。

由于GeneBank中未見(jiàn)有兩粵黃檀Dalbergiabenthamii的ITS2序列的上傳記錄，因此該試驗(yàn)對(duì)兩粵黃檀Dalbergiabenthamii采取了rbcL+matK方式加以鑒別，對(duì)斜葉黃檀Dalbergiapinnata采取了ITS2方式鑒別，試驗(yàn)結(jié)果證明，2種方法均有較高的準(zhǔn)確率。電泳圖可見(jiàn)樣品基因組DNA呈微弱涂布狀條帶，表明DNA已提取出來(lái)，但DNA降解嚴(yán)重，質(zhì)量不佳。PCR產(chǎn)物呈單一、明亮條帶，表明ITS2、MatK、rbcL序列對(duì)于基因組DNA降解嚴(yán)重的樣品仍有較高的擴(kuò)增成功率。

[1] 嵇含.南方草木狀[M].北京：中華書局，1985:14.

[2] 唐慎微.重修政和經(jīng)史證類備用本草[M].廣州：人民衛(wèi)生出版社，1957:310.

[3] 李時(shí)珍，李經(jīng)緯，李振吉，等.《本草綱目》校注[M].沈陽(yáng)：遼海出版社，2001：1185.

[4] 梁居紅，杜麗敏，麥有專，等.海南霸王嶺的斜葉檀野生資源調(diào)查[J].熱帶林業(yè)，2015，43(3)：34-35.

[5] 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志：第40卷[M].北京：科學(xué)出版社，1979：101.

[6] 陳士林.中國(guó)藥典中藥材DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列[M].北京：科學(xué)出版社，2015.

[7] 謝宗萬(wàn).全國(guó)中草藥匯編：下[M].2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1978：443.

科技論文寫作規(guī)范——數(shù)字

公歷世紀(jì)、年代、年、月、日、時(shí)刻和各種計(jì)數(shù)和計(jì)量，均用阿拉伯?dāng)?shù)字。年份不能簡(jiǎn)寫，如1990年不能寫成90年，文中避免出現(xiàn)“去年”、“今年”等寫法。小于1的小數(shù)點(diǎn)前的零不能省略，如0.2456不能寫成.2456。小數(shù)點(diǎn)前或后超過(guò)4位數(shù)(含4位數(shù))，從小數(shù)點(diǎn)向左右每3位空半格，不用“，”隔開。如18 072.235 71。尾數(shù)多的(5位以上)的數(shù)字和小數(shù)點(diǎn)后位數(shù)多的小數(shù)，宜采用×10n(n為正負(fù)整數(shù))的寫法。數(shù)字應(yīng)正確地寫出有效數(shù)字，任何一個(gè)數(shù)字，只允許最后一位存在誤差。

Identification of Original Plant Varieties of National Jiangzhenxiang Conventionally Used as Medicine and Incense in Hainan

ZHANG Dan-yan1, GAO Shi-jun1, ZHANG Lei2et al

(1.School of Chinese Material Medica, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou, Guangdong 510006；2.Jiangsu Tasly Diyi Pharmaceutical Co.,Ltd.,Huaian, Jiangsu 223003)

[Objective] To identify two varieties origins of Jiangzhenxiang vines which were conventionally used as medicine and incense in Hainan Province, and to provide basis for protection and development of Jiangzhenxiang resources in Hainan. [Method] Field research, interview and observation were used to investigate the plant growth condition and morphological characteristics of mountain plants, and to collect the plant samples. Then, germplasm origin identification method, character identification method and plant DNA barcode technology were used to identify the original plant varieties of Jiangzhenxiang in Hainan. [Result] The morphological characteristics, macroscopic characters and DNA barcode information of big-leaf Jiangzhenxiang liana and small-leaf Jiangzhenxiang liana in Hainan were accordant withDalbergiabenthamiiandDalbergiapinnata, respectively. [Conclusion] The two varieties Jiangzhenxiang liana conventionally used in Hainan are respectivelyDalbergiabenthamiiandDalbergiapinnata.

Jiangzhenxiang; Germplasm origin identification; Morphological identification; DNA barcode

張丹雁(1964-)，女，遼寧開原人，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥鑒定、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及GAP研究。

2016-08-12

S 567

A

0517-6611(2016)29-0147-04