谷氨酸對脂多糖刺激斷奶仔豬腸道能量代謝的影響

秦 琴 王秀英 吳歡聽 朱惠玲 劉玉蘭

(武漢輕工大學(xué)動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點實驗室，武漢430023)

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谷氨酸對脂多糖刺激斷奶仔豬腸道能量代謝的影響

秦 琴 王秀英 吳歡聽 朱惠玲 劉玉蘭*

(武漢輕工大學(xué)動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點實驗室，武漢430023)

本試驗旨在研究谷氨酸(Glu)對脂多糖(LPS)刺激斷奶仔豬腸道能量代謝的影響。選擇24頭斷奶仔豬分為4個組，分別為對照組、LPS組、LPS+1.0% Glu組和LPS+2.0% Glu組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)1頭豬。于試驗第28天，試驗組豬注射100 μg/kg BW LPS，對照組注射等量的生理鹽水，4 h后屠宰，取腸道樣品待測。結(jié)果表明：1)與對照組相比，LPS刺激導(dǎo)致斷奶仔豬空腸三磷酸腺苷(ATP)、腺苷酸池(TAN)含量和能荷(EC)顯著降低(P<0.05)，一磷酸腺苷(AMP)/ATP值顯著升高(P<0.05)；與LPS組相比，LPS+2.0% Glu組顯著提高了空腸ATP、二磷酸腺苷(ADP)和TAN含量(P<0.05)。2)與對照組相比，LPS刺激導(dǎo)致斷奶仔豬回腸檸檬酸合成酶和α-酮戊二酸脫氫酶系活性極顯著降低(P<0.01)，空腸α-酮戊二酸脫氫酶系活性有降低趨勢(P=0.092)；與LPS組相比，除LPS+1.0% Glu組回腸檸檬酸合成酶活性顯著降低(P<0.05)外，Glu對空腸和回腸三羧酸循環(huán)關(guān)鍵酶活性無顯著影響(P>0.05)。3)與對照組相比，LPS刺激導(dǎo)致空腸過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(PGC1α)及回腸沉默信號調(diào)控因子1(Sirt1)和PGC1α的mRNA表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)；與LPS組相比，LPS+2.0% Glu組有提高空腸PGC1α(P=0.067)和回腸Sirt1(P=0.053)mRNA表達(dá)量的趨勢，LPS+1.0% Glu組有提高回腸Sirt1 mRNA表達(dá)量的趨勢(P=0.070)。由此可見，Glu可以改善LPS刺激導(dǎo)致的腸道能量損耗狀態(tài)。

谷氨酸；脂多糖；斷奶仔豬；腸道；能量代謝

腸道是機(jī)體消化吸收的主要場所，也是阻止外界病原體和致癌物等有害物質(zhì)對機(jī)體造成損害的生理屏障[1]。腸道需要很高的能量來維持其健康和功能[2]。而在應(yīng)激狀態(tài)下，機(jī)體能量代謝紊亂，三磷酸腺苷(ATP)含量明顯降低，細(xì)胞功能障礙或死亡，導(dǎo)致腸道結(jié)構(gòu)功能的損傷[3]。脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性菌膜結(jié)構(gòu)物質(zhì)。LPS刺激可導(dǎo)致能量供應(yīng)不足，引起腸道損傷[4]。谷氨酸(Glu)是一種酸性非必需氨基酸，對幼年動物的生長發(fā)育十分重要，與腸黏膜的生長代謝息息相關(guān)[5-6]。Stoll等[7]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中90% Glu可在豬腸道中被代謝，是腸道主要的能源物質(zhì)。Glu的碳骨架分解后可形成α-酮戊二酸，α-酮戊二酸可以進(jìn)入三羧酸(TCA)循環(huán)氧化分解產(chǎn)生能量[8]。另外，Glu是精氨酸家族氨基酸，可以轉(zhuǎn)化為該家族其他氨基酸，如天冬氨酸、谷氨酰胺和精氨酸等，進(jìn)一步在動物體內(nèi)發(fā)揮作用[9]。但是，目前關(guān)于Glu在腸道能量代謝方面的研究很少，且其發(fā)揮作用的分子機(jī)理尚不清楚。因此，本試驗通過給斷奶仔豬注射LPS建立免疫應(yīng)激模型[10]，研究Glu對斷奶仔豬腸道能量代謝的影響，旨在為Glu緩解LPS刺激導(dǎo)致的斷奶仔豬腸道損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

L-Glu：有效成分>99.1%，武漢阿米諾科技有限公司提供。

L-丙氨酸：有效成分>99.5%，武漢阿米諾科技有限公司提供。

LPS：大腸桿菌血清型O55：B5，Sigma公司提供，注射時用生理鹽水溶解，配成濃度500 μg/mL。注射時按照0.2 mL/kg BW(即100 μg/kg BW)進(jìn)行處理。

1.2 試驗動物與設(shè)計

選擇24頭健康、體況相近[平均體重(7.02±0.21) kg]的杜×長×大斷奶仔豬，按體重相近原則隨機(jī)分為4組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)1頭豬。試驗采用單因子設(shè)計，4個組分別為：1)對照組(生理鹽水+基礎(chǔ)飼糧)；2)LPS組(LPS+基礎(chǔ)飼糧)；3)LPS+1.0% Glu組(LPS+基礎(chǔ)飼糧+1.0% Glu)；4)LPS+2.0% Glu組(LPS+基礎(chǔ)飼糧+2.0% Glu)。參照NRC(1998)仔豬營養(yǎng)需要量配制基礎(chǔ)飼糧，其組成及營養(yǎng)水平見表1。各組的飼糧用丙氨酸進(jìn)行等氮處理。試驗期為28 d。在正式試驗第28天，試驗組豬注射100 μg/kg BW LPS，對照組豬注射等量的生理鹽水。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗在動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點實驗室進(jìn)行。每個豬欄的大小為1.20 m×1.10 m。豬舍的室內(nèi)溫度維持在25～27 ℃。試驗采用粉料飼喂，飼養(yǎng)過程中讓仔豬自由采食和飲水，并定期進(jìn)行免疫和驅(qū)蟲。

1.4 腸道樣品采集與處理

試驗第28天，注射LPS或生理鹽水4 h后，屠宰仔豬，剖開腹腔從腸系膜處取下小腸。在空腸和回腸各段中部各取10 cm左右的一段，然后立即放入冰塊中。將10 cm腸段用剪刀沿腸系膜縱向剖開，4 ℃生理鹽水輕輕沖洗干凈，然后使用濾紙吸干水分，再用載玻片輕輕刮取腸黏膜，分裝在1.5 mL無菌凍存管中，并立即放入液氮中速凍，后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱中凍存。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供 Premix provided the following per kg of the diet：VA 12 000 IU，VB11.5 mg，核黃素 riboflavin 4 mg，煙酸 nicotinic acid 40 mg，氯化膽堿 choline chloride 400 mg，葉酸 folic acid 700 μg，VB63 mg，VB1218 μg，VD32 500 IU，VE 30 IU，VK33 mg，泛酸 pantothenic acid 15 mg，生物素 biotin 100 μg，Mn 20 mg，Se 0.36 mg，Zn 80 mg，Cu 25 mg，F(xiàn)e 83 mg，I 0.48 mg。

2)消化能為計算值，其余為實測值。DE was a calculated value, while the others were measured values.

1.5 檢測指標(biāo)及方法

1.5.1 小腸黏膜腺苷酸含量測定

采用反相高效液相色譜法測定。將腸黏膜從液氮中取出，稱取0.1～0.2 g組織，加入2 mL預(yù)冷的1.5 mol/L高氯酸，冰浴勻漿，4 ℃、3 000 r/min離心5 min。取上清液1 mL，緩慢加入0.4 mL 2 mol/L碳酸鉀溶液中和，4 ℃、3 000 r/min再離心5 min，取上清液-80 ℃凍存待測。

采用Waters Breeze高效液相色譜系統(tǒng)。色譜柱采用Waters XTerra MS C18(5 μm×4.6 mm×150 mm)；流動相：50 mmol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液：色譜級甲醇(體積比)=77∶23，用磷酸調(diào)至pH=7.0；流速：1.0 mL/min；柱溫：20 ℃；紫外檢測器，檢測波長：260 nm；進(jìn)樣量：10 μL。采用外標(biāo)法定量測定ATP、二磷酸腺苷(ADP)和一磷酸腺苷(AMP)含量。標(biāo)準(zhǔn)品也在相同的色譜條件下測定。

腺苷酸池(TAN)=ATP+ADP+AMP；

能荷(EC)=(ATP+1/2 ADP)/

(ATP+ADP+AMP)。

1.5.2 小腸黏膜檸檬酸合酶、α-酮戊二酸脫氫酶系和異檸檬酸脫氫酶活性測定

酶活性的測定參照Pi等[11]的方法，采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法進(jìn)行測定。豬檸檬酸合酶(#45126)、α-酮戊二酸脫氫酶系(#45157)和異檸檬酸脫氫酶(#45234)ELISA檢測試劑盒生產(chǎn)廠家為上海源葉生物科技有限公司。

1.5.3 小腸黏膜能量代謝相關(guān)信號分子mRNA表達(dá)量的測定

基因mRNA表達(dá)量的測定參照陳逢[12]的方法，采用實時定量PCR(real-time PCR)法測定，試劑均購自大連寶生物工程有限公司。根據(jù)已發(fā)表的豬的基因序列，利用Primer premier 6.0軟件設(shè)計real-time PCR引物(表2)，并由大連寶生物工程有限公司合成。本試驗中，各基因擴(kuò)增效率均接近100%。另外，本試驗以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因，各基因mRNA表達(dá)量采用2-ΔΔCT相對定量法計算[13]。各基因的mRNA相對表達(dá)量通過歸一化法，以相對于對照組的表達(dá)量表示。

表2 基因的引物序列

1.6 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析和LSD多重比較。統(tǒng)計結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。以P≤0.01為差異極顯著標(biāo)準(zhǔn)，0.01

2 結(jié)果與分析

2.1 Glu對LPS刺激斷奶仔豬腸道黏膜腺苷酸含量的影響

由表3可知，與對照組相比，LPS組空腸ATP、TAN含量和EC顯著降低(P<0.05)，AMP/ATP值顯著升高(P<0.05)；與LPS組相比，LPS+2.0% Glu組空腸ATP、ADP和TAN含量顯著升高(P<0.05)。

表3 Glu對LPS刺激斷奶仔豬腸道黏膜腺苷酸含量的影響

P1：對照組vs. LPS組 Control group vs. LPS group；P2：LPS組vs. LPS+1.0% Glu組 LPS group vs. LPS+1.0% Glu group；P3：LPS組vs. LPS+2.0% Glu組 LPS group vs. LPS+2.0% Glu group。下表同 The same as below。

2.2 Glu對LPS刺激斷奶仔豬腸道黏膜TCA循環(huán)關(guān)鍵酶活性的影響

由表4可知，與對照組相比，LPS組回腸檸檬酸合成酶和α-酮戊二酸脫氫酶系活性極顯著降低(P<0.01)，空腸α-酮戊二酸脫氫酶系活性有降

低趨勢(P=0.092)；與LPS組相比，除LPS+1.0% Glu組回腸檸檬酸合成酶活性顯著降低(P<0.05)外，飼糧添加Glu對LPS刺激斷奶仔豬空腸和回腸TCA循環(huán)關(guān)鍵酶活性均無顯著影響(P>0.05)。

表4 Glu對LPS刺激斷奶仔豬腸道黏膜TCA循環(huán)關(guān)鍵酶活性的影響

2.3 Glu對LPS刺激斷奶仔豬腸道能量黏膜代謝相關(guān)信號分子mRNA表達(dá)量的影響

由表5可知，與對照組相比，LPS組空腸過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(PGC1α)及回腸沉默信號調(diào)控因子1(Sirt1)和PGC1α的mRNA表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)；與LPS組相比，LPS+2.0% Glu組空腸PGC1α(P=0.067)和回腸Sirt1(P=0.053)的mRNA表達(dá)量有升高趨勢，LPS+1.0% Glu組回腸Sirt1的mRNA表達(dá)量有升高趨勢(P=0.070)。

表5 Glu對LPS刺激斷奶仔豬腸道黏膜能量代謝相關(guān)信號分子mRNA表達(dá)量的影響

3 討 論

ATP是一種不穩(wěn)定的高能化合物，它的3個磷酸基團(tuán)中包含2個高能分子磷酸酐鍵，水解時轉(zhuǎn)化成ADP釋放出大量能量，是各種機(jī)體活動的直接能量來源，當(dāng)?shù)孜锎x產(chǎn)生ATP的速度未能趕上其利用速度，就會增加細(xì)胞內(nèi)ADP的濃度，2分子的ADP在腺苷酸激酶作用下轉(zhuǎn)化成1分子ATP和1分子AMP[8]。TAN是一個能量媒介系統(tǒng)，其大小反映了線粒體的氧化呼吸活性和生成高能磷酸化合物的能力，同時反映了細(xì)胞的能量儲備[14]。EC反映了高能磷酸鍵在ATP、ADP和AMP之間的相互轉(zhuǎn)換，EC的正常維持取決于細(xì)胞高能化合物合成和分解之間的動態(tài)平衡，細(xì)胞能量產(chǎn)生不足或消耗增加時，均會影響EC水平[15]。ATP的產(chǎn)生減少或利用增加，會使細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP值增加，而AMP/ATP值的增加可激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)，從而引起一系列反應(yīng)來恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)的能量平衡[16]。

本試驗中LPS刺激導(dǎo)致斷奶仔豬空腸ATP、TAN含量和EC顯著降低，AMP/ATP值顯著升高，這與Pi等[11]研究結(jié)果類似。王巖等[17]研究表明，LPS刺激可以影響線粒體內(nèi)細(xì)胞色素氧化酶系統(tǒng)，阻礙呼吸鏈的傳遞，導(dǎo)致能量合成代謝障礙，ATP合成減少。本試驗中，飼糧中添加2.0% Glu后，空腸ATP、ADP和TAN含量顯著升高。Watford[18]研究表明，Glu的代謝為腸道完整性和功能維持提供了大量的ATP。Blachier等[19]研究表明，Glu在腸上皮細(xì)胞內(nèi)谷氨酸脫氫酶的作用下被氧化，首先與草酰乙酸通過轉(zhuǎn)氨基作用產(chǎn)生α-酮戊二酸和天冬氨酸，α-酮戊二酸進(jìn)入線粒體參加TCA循環(huán)，進(jìn)而產(chǎn)生ATP。以上結(jié)果及分析表明，Glu可緩解LPS刺激導(dǎo)致的能量代謝障礙，促進(jìn)能量生成，增加能量代謝能力和儲備能力。

檸檬酸合成酶、異檸檬酸脫氫酶和α-酮戊二酸脫氫酶系是TCA循環(huán)的3個限速酶，調(diào)節(jié)著生物體的能量代謝和生物合成等重要生命活動[20]。檸檬酸合成酶可決定乙酰輔酶A進(jìn)入TCA循環(huán)的速率，是研究能量代謝狀態(tài)的重要指標(biāo)[21]。異檸檬酸脫氫酶存在于線粒體和胞質(zhì)中，催化異檸檬酸生成α-酮戊二酸[22]。α-酮戊二酸脫氫酶系存在于線粒體基質(zhì)內(nèi)，可催化α-酮戊二酸酸氧化脫羧生成琥珀酰輔酶A，同時生成還原型輔酶Ⅰ(NADH)[23]。

本試驗中LPS刺激導(dǎo)致空腸α-酮戊二酸脫氫酶系活性有降低趨勢，回腸檸檬酸合成酶和α-酮戊二酸脫氫酶系活性極顯著降低，這與石海峰[24]的研究一致。飼糧添加Glu對檸檬酸合成酶、異檸檬酸脫氫酶和α-酮戊二酸脫氫酶系活性無顯著影響，其原因一方面可能是因為飼糧中添加Glu后腸道ATP含量顯著升高，而這3種TCA循環(huán)限速酶含量受到ATP的抑制[20]；另一方面，Glu可能不是通過影響酶活性來提高TCA循環(huán)的反應(yīng)速率，而是通過轉(zhuǎn)化為TCA循環(huán)的中間體α-酮戊二酸，進(jìn)而改善腸道的能量代謝水平。研究表明，α-酮戊二酸可以作為腸黏膜能量代謝底物[25]，飼糧添加α-酮戊二酸有助于改善LPS刺激后腸黏膜細(xì)胞的能量代謝[26]。

AMPK是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，廣泛存在于真核細(xì)胞生物中，能感知細(xì)胞能量代謝狀態(tài)的改變，維持機(jī)體的能量代謝平衡[27]。當(dāng)ATP的產(chǎn)生減少或利用增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP值增加時，AMPK可被激活，從而有助于ATP再生和抑制ATP消耗，維持能量平衡[28]。此外，AMPK的活化可激活其下游Sirt1活性[29]。Sirt1是一種核蛋白，能通過增強(qiáng)肝臟糖異生、降低脂質(zhì)積累和參與胰腺的胰島素分泌使機(jī)體ATP的含量上升[30]。同時，Sirt1可介導(dǎo)其下游靶點PGC1α發(fā)生去乙酰化，影響PGC1α的活性，最終調(diào)控線粒體和脂質(zhì)代謝基因[31]。而PGClα是一種核轉(zhuǎn)錄輔激活因子，參與調(diào)節(jié)線粒體生物反應(yīng)和葡萄糖脂肪代謝等生物反應(yīng)[32]。

本試驗中，LPS刺激導(dǎo)致斷奶仔豬空腸PGC1α及回腸Sirt1和PGC1α的mRNA表達(dá)量極顯著降低。羅麗麗等[33]研究發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡過程中Sirt1的表達(dá)受到抑制。而Glu緩解了LPS刺激導(dǎo)致的空腸PGC1α和回腸Sirt1的mRNA表達(dá)量的降低，表明Glu可以調(diào)節(jié)腸道能量代謝相關(guān)信號通路。Glu是精氨酸家族氨基酸，可以轉(zhuǎn)化為該家族其他氨基酸，如天冬氨酸、谷氨酰胺和精氨酸等，進(jìn)一步在動物體內(nèi)發(fā)揮作用[9]。Kang等[34]研究表明，飼糧添加天冬氨酸可增加肝臟Sirt1的mRNA表達(dá)量。Glu可能可以通過轉(zhuǎn)化為天冬氨酸來提高腸道Sirt1的mRNA表達(dá)量，進(jìn)一步激活下游PGC1α，從而促進(jìn)ATP的產(chǎn)生。本試驗中LPS刺激和飼糧添加Glu對空腸和回腸AMPKα1和AMPKα2的mRNA表達(dá)量均無顯著影響，其原因可能是試驗中仔豬腸道能量變化幅度未能達(dá)到AMPK感受范圍。有研究表明，細(xì)胞中ATP的變化水平需達(dá)到一定的閾值才能使AMPK活化[35]。

4 結(jié) 論

Glu緩解了LPS刺激導(dǎo)致的斷奶仔豬腸道能量代謝障礙，其可能是通過影響腸道能量代謝相關(guān)調(diào)控因子Sirt1和PGC1α的mRNA表達(dá)量，進(jìn)而促進(jìn)腸黏膜能量的產(chǎn)生。

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[35] WIJESEKARA N,TUNG A,THONG F,et al.Muscle cell depolarization induces a gain in surface GLUT4 via reduced endocytosis independently of AMPK[J].American Journal of Physiology,2006,290(6):E1276-E1286.

*Corresponding author, professor, E-mail: yulanflower@126.com

(責(zé)任編輯 田艷明)

Effects of Glutamate on Intestinal Energy Metabolism in the Lipopolysaccharide-Challenged Weaned Piglets

QIN Qin WANG Xiuying WU Huanting ZHU Huiling LIU Yulan*

(Hubei Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)

This study was aimed to investigate the effects of glutamate (Glu) on intestinal energy metabolism in the lipopolysaccharide (LPS)-challenged weaned piglets. Twenty-four weaned pigs were assigned to four groups as control group, LPS group, LPS+1.0% Glu group and LPS+2.0% Glu group with 6 replicates each and 1 pig in per replicate. On the 28thday of the trial, the piglets in the experimental groups were injected with 100 μg/kg BW LPS, and the piglets in the control group were injected with the same amount of 0.9% NaCl solution. At 4 h post-injection, pigs were slaughtered and intestinal samples were collected for further analysis. The results showed as follows: 1) LPS challenge significantly decreased ATP and total adenine nucleotide (TAN) contents and energy charge (P<0.05), but significantly increased the ratio of AMP to ATP (P<0.05) in jejunum compared with the control group; LPS+2.0% Glu group significantly increased the contents of ATP, ADP and TAN (P<0.05) in jejunum compared with LPS group. 2) Compared with the control group, LPS challenge had a tendency to decrease the alpha-oxoglutarate dehydrogenase complex activity (P=0.092) in jejunum and extremely significantly decreased the activities of citrate synthase and alpha-oxoglutarate dehydrogenase complex (P<0.01) in ileum; compared with LPS group, Glu had no significant effects on the activities of tricarboxylic acid cycle key enzymes (P>0.05) in jejunum and ileum, except for the citrate synthase activity in ileum was significantly reduced in LPS+1.0% Glu group (P<0.05). 3) LPS challenge extremely significantly decreased the mRNA expressions of peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1α (PGC1α) in jejunum and silent information regulator 1 (Sirt1) andPGC1αin ileum (P<0.01) compared with the control group; compared with LPS group, LPS+2.0% Glu group had a tendency to increase the mRNA expressions ofPGC1αin jejunum (P=0.067) andSirt1 in ileum (P=0.053), while LPS+1.0% Glu group had a tendency to increase theSirt1 mRNA expression in ileum (P=0.070). These results indicate that dietary supplementation of Glu can improve energy loss status in LPS injured intestine.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(11)：3618-3625]

glutamate; lipopolysaccharide; weaned piglets; intestine; energy metabolism

2016-05-03

湖北省教育廳優(yōu)秀中青年科技創(chuàng)新團(tuán)隊項目(T201508)

秦 琴(1992—)，女，湖北仙桃人，碩士研究生，從事豬營養(yǎng)生理機(jī)能調(diào)控的研究。E-mail: 944103932@qq.com

*通信作者：劉玉蘭，教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail: yulanflower@126.com

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.11.031

S828

A

1006-267X(2016)11-3618-08