• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    植物角質(zhì)降解菌的種屬鑒定、發(fā)酵條件優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)研究

    2016-12-01 09:22:02梁爭(zhēng)文張鐵鷹劉俊麗
    關(guān)鍵詞:胞外酯酶產(chǎn)酶

    梁爭(zhēng)文 張鐵鷹* 李 爽 劉俊麗

    (1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100193;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,蘭州730070)

    ?

    植物角質(zhì)降解菌的種屬鑒定、發(fā)酵條件優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)研究

    梁爭(zhēng)文1張鐵鷹1*李 爽1劉俊麗2

    (1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100193;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,蘭州730070)

    本試驗(yàn)旨在通過(guò)角質(zhì)降解菌株X8P的種屬鑒定、發(fā)酵條件優(yōu)化和酶學(xué)性質(zhì)研究,探討降解植物表面角質(zhì)層,進(jìn)一步改善動(dòng)物對(duì)植物纖維利用的可能新方案。試驗(yàn)通過(guò)形態(tài)觀察和16S rDNA測(cè)序鑒定菌株X8P種屬,并對(duì)其產(chǎn)酶所需碳源、氮源、發(fā)酵溫度與時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,其發(fā)酵液經(jīng)硫酸銨鹽析沉淀獲得其胞外蛋白粗酶,并對(duì)其粗酶催化的適宜pH和pH穩(wěn)定性、溫度和溫度穩(wěn)定性,以及有機(jī)溶劑、表面活性劑和金屬離子對(duì)其活性的影響進(jìn)行研究。結(jié)果表明:1)菌株X8P經(jīng)形態(tài)觀察和分子鑒定為東方醋桿菌(Acetobacterorientalis)。2)菌株X8P適宜產(chǎn)酶發(fā)酵條件為溶菌肉湯(LB)培養(yǎng)基中37 ℃發(fā)酵4 d,1%橄欖油和1%葡萄糖明顯促進(jìn)菌株產(chǎn)酶,而1%可溶性淀粉明顯抑制菌株產(chǎn)酶。3)該菌株胞外粗酶催化適宜pH和溫度分別為6.5和45 ℃,且表現(xiàn)出一定pH穩(wěn)定性,但在有機(jī)溶劑中不穩(wěn)定,僅甘油中可保留全部活性,在二甲基亞砜(50%)中活性可保留66%。吐溫(Tween)-20(1 mmol/L)、Tween-80(1 mmol/L)和聚乙二醇辛基苯基醚(1和10 mmol/L)可使菌株X8P粗酶活性提高3%~35%。金屬離子鉀離子(K+)、錳離子(Mn2+)(1和10 mmol/L)可使菌株X8P粗酶活性提高2%~20%。由此可見(jiàn),菌株X8P具有一定的產(chǎn)角質(zhì)酶潛力和應(yīng)用前景,可進(jìn)一步深入研究。

    角質(zhì);角質(zhì)酶;角質(zhì)降解菌;發(fā)酵條件優(yōu)化;酶學(xué)性質(zhì)

    植物葉片和籽實(shí)表面均覆蓋有角質(zhì)層,厚度約為0.1 μm[1-2]。角質(zhì)層主要組成成分為角質(zhì),此外還含有約0.6%蠟質(zhì)、0.9%果膠、1.3%蛋白質(zhì)、2.0%非纖維多糖、灰塵及雜質(zhì)等組分[3]。角質(zhì)層化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,且耐酸堿、耐氧化,這可能使反芻動(dòng)物瘤胃中和豬、兔等單胃動(dòng)物后腸微中生物及其酶與飼料原料纖維的有效接觸減少,也可能使黏附在植物纖維顆粒上的微生物數(shù)量減少,從而影響動(dòng)物消化道對(duì)植物纖維材料的降解[4]。近年來(lái),食品加工副產(chǎn)品如酒糟、麩皮、玉米皮等越來(lái)越多用于豬、禽飼糧中。這些原料富含角質(zhì),可能是限制動(dòng)物尤其是單胃動(dòng)物后腸微生物對(duì)纖維降解的主要障礙之一。破壞植物角質(zhì)層,會(huì)使其滲透性增加,機(jī)械強(qiáng)度降低[5]。

    角質(zhì)降解菌產(chǎn)生的角質(zhì)酶可水解角質(zhì)層屏障,利于其侵染植物。經(jīng)角質(zhì)酶處理的植物性飼料亦同樣利于動(dòng)物消化道內(nèi)微生物及酶快速與植物內(nèi)部組織結(jié)合,增加表面微生物及酶的活性,提高纖維降解速率。因此,采用生物技術(shù)手段破壞植物角質(zhì)層可能是提高飼料植物纖維消化利用的關(guān)鍵之一。目前,人們對(duì)真菌角質(zhì)酶的研究最為廣泛,來(lái)自鐮刀菌屬(Fusarium)、炭疽菌屬(Colletotrichum)、鏈核盤(pán)菌屬(Monilinia)等14屬20多種真菌的角質(zhì)酶已得到深入研究[6]。其中茄病鐮孢菌(Fusariumsolanipisi)角質(zhì)酶研究最為透徹,且其三維結(jié)構(gòu)已解析[7]。相反,人們對(duì)細(xì)菌和放線(xiàn)菌角質(zhì)酶了解較少[8],且對(duì)細(xì)菌來(lái)源角質(zhì)酶編碼基因信息了解也十分有限[4]。目前僅對(duì)假單胞菌(Pseudomonas)和嗜熱裂胞菌(Thermobifida)來(lái)源的角質(zhì)酶進(jìn)行了純化和生化特征分析,并獲得其角質(zhì)酶編碼信息[9]。因此,本研究擬通過(guò)對(duì)角質(zhì)降解菌X8P種屬鑒定、發(fā)酵條件優(yōu)化和酶學(xué)性質(zhì)研究,以探討其所產(chǎn)酶特點(diǎn)及在畜牧業(yè)中應(yīng)用潛質(zhì)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    1.1.1 菌株來(lái)源

    菌株X8P為本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

    1.1.2 培養(yǎng)基

    溶菌肉湯(LB)培養(yǎng)基:酵母提取物5 g,胰蛋白胨10 g,氯化鈉10 g,去離子水1 000 mL,自然pH,121 ℃滅菌20 min。

    發(fā)酵培養(yǎng)基:橄欖油10 g,硫酸銨5 g,牛肉膏5 g,酵母粉5 g,蛋白胨10 g,氯化鈉10 g,去離子水1 000 mL,自然pH,121 ℃滅菌20 min。

    1.1.3 試劑

    α-乙酸萘酯(α-naphthyl acetate)、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸[2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid,MES],購(gòu)自Sigma公司。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 菌株鑒定

    形態(tài)特征:將菌株X8P劃線(xiàn)于LB平板培養(yǎng)基上培養(yǎng),觀察單菌落形態(tài)。

    16S rDNA序列測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育分析:提取菌株基因組DNA,采用16S rDNA擴(kuò)增通用引物(27 F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,1492 R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′),擴(kuò)增菌株16S rDNA。PCR純化產(chǎn)物測(cè)序由博邁德科技發(fā)展有限公司完成。將測(cè)序結(jié)果在NCBI上用BLAST程序與GenBank中16S rDNA序列進(jìn)行同源性分析,用MEGA5.2中的鄰接(neighbor-joining)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

    1.2.2 菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

    1.2.2.1 制種

    將甘油保存的菌株X8P在LB培養(yǎng)基上劃線(xiàn)活化后,從平板上挑取單菌落到種子培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)制備種子液。

    1.2.2.2 碳源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

    以LB培養(yǎng)基為對(duì)照,分別研究1%橄欖油、堿處理角質(zhì)、角質(zhì)、麩皮、玉米芯、秸稈、蔗糖、葡萄糖和可溶性淀粉等碳源對(duì)菌株X8P胞外酶活性影響。在30 ℃、150 r/min下,發(fā)酵培養(yǎng)4 d,獲得粗酶液。

    1.2.2.3 氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

    在LB培養(yǎng)基和最佳碳源基礎(chǔ)上,分別研究0.5%胰蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、酪蛋白、氯化銨和硫酸銨等氮源對(duì)菌株X8P胞外酶活性影響。在30 ℃、150 r/min下,發(fā)酵培養(yǎng)4 d,獲得粗酶液。

    1.2.2.4 發(fā)酵溫度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

    在LB培養(yǎng)基添加最佳碳源和最佳氮源基礎(chǔ)上,分別研究不同發(fā)酵溫度(25、30、37、40和45 ℃)對(duì)菌株X8P胞外酶活性的影響。150 r/min發(fā)酵培養(yǎng)4 d,獲得粗酶液。

    1.2.2.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

    在單一因素優(yōu)化基礎(chǔ)上,研究發(fā)酵時(shí)間(1、2、3、4、5和6 d)對(duì)菌株X8P胞外酶活性影響。在37 ℃、150 r/min下培養(yǎng)獲得粗酶液。

    上述發(fā)酵條件優(yōu)化每個(gè)處理均為3個(gè)重復(fù)。

    1.2.3 菌株X8P胞外酯酶酶學(xué)性質(zhì)

    1.2.3.1 菌株X8P胞外粗酶液制備及粗純化

    將菌株X8P發(fā)酵粗酶液經(jīng)超濾濃縮、硫酸銨沉淀和透析除鹽,獲得該菌株角質(zhì)酶粗酶。

    1.2.3.2 菌株X8P胞外粗酶適宜pH和pH穩(wěn)定性

    適宜pH測(cè)定:在不同pH(pH 2.5~9.5,每隔0.5設(shè)1個(gè)測(cè)試點(diǎn))測(cè)定菌株粗酶活性,反應(yīng)溫度50 ℃。

    pH穩(wěn)定性測(cè)定:將菌株X8P粗酶液按1∶9的比例與不同pH(pH 2.5~9.5,每隔0.5設(shè)1個(gè)測(cè)試點(diǎn))緩沖液稀釋混勻,將稀釋粗酶液于50 ℃水浴處理30 min后,迅速冰水冷卻(30 min),測(cè)定稀釋液酶活性。

    1.2.3.3 菌株X8P胞外粗酶適宜溫度和溫度穩(wěn)定性

    適宜溫度測(cè)定:將菌株X8P粗酶液適當(dāng)稀釋于50 mmol/L、pH 6.5 MES緩沖液后,分別在30~80 ℃(每隔5 ℃為1個(gè)測(cè)試點(diǎn))下測(cè)定酶活性。

    溫度穩(wěn)定性測(cè)定:將菌株X8P粗酶液分別在不同溫度(0~80 ℃,每隔10 ℃為1個(gè)測(cè)試點(diǎn))處理30 min,緩沖液為50 mmol/L、pH 6.5 MES緩沖液,冰水浴30 min,測(cè)定殘余酶活性。

    1.2.3.4 有機(jī)試劑對(duì)菌株X8P胞外粗酶活性影響

    將甲醇、乙醇、甘油、異丙醇、丙酮、二甲基亞砜、乙腈等有機(jī)試劑分別以50%(v/v)和80%(v/v)終濃度與菌株X8P粗酶液在30 ℃保溫60 min后,迅速冰水浴30 min,測(cè)定殘余酶活性。以未加有機(jī)試劑的對(duì)照酶活性為100%。

    1.2.3.5 表面活性劑和金屬離子對(duì)菌株X8P胞外粗酶活性影響

    表面活性劑影響:將吐溫(Tween)-20、Tween-80、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-100)等表面活性劑(1和10 mmol/L)和菌株X8P粗酶液在30 ℃保溫60 min后,迅速冰水浴30 min,測(cè)定殘余酶活性,以未加表面活性劑對(duì)照酶活性為100%。

    金屬離子影響:將溶于50 mmol/L、pH 6.5 MES緩沖液的1和10 mmol/L金屬離子[鈉離子(Na+)、鎂離子(Mg2+)、錳離子(Mn2+)、鈣離子(Ca2+)、鋇離子(Ba2+)、二價(jià)鐵離子(Fe2+)、鋅離子(Zn2+)、銅離子(Cu2+)、鉀離子(K+)、鎳離子(Ni2+)、三價(jià)鐵離子(Fe3+)]與菌株粗酶液在30 ℃保溫60 min,冰水浴30 min,測(cè)定殘余酶活性。以未加金屬離子對(duì)照酶活性為100%。

    上述酶學(xué)性質(zhì)試驗(yàn)結(jié)果取3次平均值。

    1.2.4 酯酶活性測(cè)定方法

    酯酶活性測(cè)定參照劉春紅等[10]方法,并進(jìn)行少許改進(jìn):移取50 μL酶液, 加入pH 6.5緩沖液800 μL,然后加入50 μL α-乙酸萘酯溶液,50 ℃恒溫水浴反應(yīng)10 min,加入50 μL 3%SDS水溶液終止反應(yīng),再加入50 μL 0.03%固蘭B鹽溶液顯色,混勻計(jì)時(shí)30 s后,再加入50 μL 1∶1(v/v)鹽酸溶液混勻使其顯色穩(wěn)定,將酶液換為蒸餾水作為空白對(duì)照,檢測(cè)并記錄535 nm吸光度數(shù)據(jù),酶活性(U)定義為在以上條件下,每分鐘反應(yīng)生成1.0 μmol/L α-乙酸萘酚所需要酶量。

    1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

    試驗(yàn)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2007統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行初步整理和統(tǒng)計(jì),并用繪圖軟件Graphpad Prism 5繪制折線(xiàn)圖和柱狀圖。

    2 結(jié) 果

    2.1 菌株鑒定

    菌株X8P單菌落形態(tài):圓形點(diǎn)狀凸起,顏色微黃,黏稠,邊緣平滑,有光澤,不透明,表面光滑無(wú)褶皺。菌株16S rDNA Blast結(jié)果顯示菌株X8P與東方醋桿菌(Acetobacterorientalis)21F-2同源性可達(dá)99%,通過(guò)菌株菌落形態(tài)特征、遺傳距離初步判定并命名為AcetobacterorientalisX8P。

    菌株X8P 16S rDNA序列測(cè)序結(jié)果如下:

    菌株X8P系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖1。

    2.2 菌株X8P產(chǎn)酯酶發(fā)酵條件優(yōu)化

    2.2.1 碳源對(duì)菌株X8P產(chǎn)酯酶的影響

    由圖2可知,1%橄欖油、堿處理角質(zhì)、角質(zhì)、葡萄糖和蔗糖促進(jìn)菌株X8P產(chǎn)酶,橄欖油促進(jìn)作用最明顯,使活性提高11倍左右。1%玉米芯、麩皮和秸稈對(duì)菌株X8P產(chǎn)酶影響不大,而1%可溶性淀粉對(duì)菌株X8P產(chǎn)酶有明顯抑制作用。菌株X8P以橄欖油為適宜碳源。

    2.2.2 氮源對(duì)菌株X8P產(chǎn)酯酶的影響

    由圖3可知,在LB培養(yǎng)基和適宜碳源基礎(chǔ)上,再添加無(wú)機(jī)氮和有機(jī)氮均明顯抑制菌株X8P產(chǎn)酶。

    2.2.3 發(fā)酵溫度對(duì)菌株X8P產(chǎn)酯酶的影響

    由圖4可知,菌株X8P在37 ℃發(fā)酵產(chǎn)酶量最大,室溫不利于產(chǎn)酶,超過(guò)適宜溫度后,產(chǎn)酶量急劇下降。

    2.2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株X8P產(chǎn)酯酶的影響

    由圖5可知,菌株X8P在第1~2天發(fā)酵產(chǎn)酶量較少,自第3天開(kāi)始產(chǎn)酶量急劇增加,至第4天時(shí)達(dá)到最高,此后酶活性呈下降趨勢(shì)。因此,菌株X8P適宜發(fā)酵時(shí)間為4 d。

    圖1 菌株X8P系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

    圖2 碳源對(duì)菌株X8P產(chǎn)酯酶的影響

    圖3 氮源對(duì)菌株X8P產(chǎn)酯酶的影響

    2.3 菌株X8P胞外酯酶粗酶酶學(xué)性質(zhì)

    2.3.1 菌株X8P胞外酯酶粗酶適宜pH和pH穩(wěn)定性

    由圖6可知,菌株胞外粗酶適宜pH 6.5,在pH 4.0以下,酶活性幾乎全部喪失。在堿性環(huán)境時(shí),酶活性急劇喪失。具有一定的pH穩(wěn)定性,在pH 6.5~7.5內(nèi)30 min,活性可保留60%以上。

    2.3.2 菌株X8P胞外酯酶粗酶適宜溫度和溫度穩(wěn)定性

    由圖7可知,菌株酶活性在45 ℃時(shí)最高,動(dòng)物體溫下酶活性約為適宜溫度的80%,具有較好的溫度適應(yīng)性,在30~65 ℃有較高活性(50%以上),超過(guò)65 ℃時(shí),酶活性急劇下降(殘余活性10%左右)。在20~45 ℃處理30 min,酶活性保留50%以上。

    圖4 發(fā)酵溫度對(duì)菌株X8P產(chǎn)酯酶的影響

    圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株X8P產(chǎn)酯酶的影響

    圖6 pH對(duì)菌株X8P胞外酯酶粗酶活性的影響及pH穩(wěn)定性

    圖7 溫度對(duì)菌株X8P胞外酯酶粗酶活性的影響及溫度穩(wěn)定性

    2.3.3 有機(jī)試劑對(duì)菌株X8P胞外酯酶粗酶活性影響

    由圖8可知,菌株X8P粗酶僅在甘油(50%和80%)中保留全部活性,在二甲基亞砜(DMSO)(50%)中活性可保留66%,在其他有機(jī)溶劑中,活性均喪失。

    2.3.4 表面活性劑對(duì)菌株X8P胞外酯酶粗酶酶活性影響

    由圖9可知,SDS強(qiáng)烈抑制菌株酶活性,濃度越高,抑制作用越明顯。Tween-20(1 mmol/L)和Tween-80(1 mmol/L)使菌株酶活促進(jìn)2%~3%,而Tween-20(10 mmol/L)和Tween-80(10 mmol/L)抑制酶活性。Triton-100(1和10 mmol/L)使酶活性提高30%~35%。

    2.3.5 金屬離子對(duì)菌株X8P胞外酯酶粗酶活性的影響

    由圖10可知,K+、Mn2+(1和10 mmol/L)使菌株酶活性提高2%~20%,F(xiàn)e2+和Ni2+對(duì)酶活性影響不大。Zn2+明顯抑制酶活性。Mg2+、Ca2+、Ba2+、Na+、Fe3+、Cu2+(1 mmol/L)使酶活性提高10%~20%,Mg2+、Ca2+、Ba2+、Na+、Fe3+、Cu2+(10 mmol/L)對(duì)酶活性有抑制作用。

    圖8 有機(jī)溶劑對(duì)菌株X8P胞外酯酶粗酶活性的影響

    圖9 表面活性劑對(duì)菌株X8P胞外酯酶粗酶活性的影響

    圖10 金屬離子對(duì)菌株X8P胞外酯酶粗酶活性的影響

    3 討 論

    目前,已知植物角質(zhì)降解菌來(lái)源有真菌、放線(xiàn)菌和細(xì)菌。角質(zhì)降解真菌研究最為廣泛,而角質(zhì)降解細(xì)菌了解不多。本實(shí)驗(yàn)室篩選獲得1株細(xì)菌,經(jīng)鑒定命名為AcetobacterorientalisX8P,目前尚無(wú)關(guān)于醋酸桿菌產(chǎn)角質(zhì)降解酶的報(bào)道。

    角質(zhì)降解菌所產(chǎn)角質(zhì)酶為高度誘導(dǎo)酶[11],其產(chǎn)酶量受發(fā)酵條件和培養(yǎng)基成分影響較大[5,12]。在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),菌株X8P在37 ℃發(fā)酵4 d,酶活性達(dá)到最高,這與前人研究結(jié)果[5,12-13]一致。Yang等[13]研究發(fā)現(xiàn),太瑞斯梭孢殼(Thielaviaterrestris)CAU709適宜產(chǎn)酶溫度50 ℃。Fett等[5]研究的銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)1499A和DAR41352發(fā)酵24~48 h達(dá)到最大活性。這與本試驗(yàn)結(jié)果不同,可能是菌株差異所致。油脂常被用作發(fā)酵產(chǎn)酯酶的碳源[14-15]。橄欖油作為碳源可強(qiáng)烈誘導(dǎo)菌株X8P產(chǎn)酶,其酯酶活性增加11倍左右??扇苄缘矸垡种凭闤8P產(chǎn)酶,這與之前報(bào)道結(jié)果[16]一致。葡萄糖促進(jìn)菌株X8P產(chǎn)酶,這與以往多數(shù)報(bào)道結(jié)果[11,15-16]不同。Sebastian等[17]發(fā)現(xiàn),在發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)充添加葡萄糖不會(huì)抑制谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumsp)產(chǎn)角質(zhì)酶,說(shuō)明葡萄糖是否抑制菌株產(chǎn)酯酶仍需探討。此外,角質(zhì)水解產(chǎn)物可誘導(dǎo)菌株X8P產(chǎn)酶,這與真菌類(lèi)似[11,17-18]。添加無(wú)機(jī)氮和有機(jī)氮均對(duì)菌株X8P產(chǎn)酶有明顯抑制作用。Kleeberg等[16]發(fā)現(xiàn),礦物質(zhì)培養(yǎng)基中添加蛋白胨時(shí),嗜熱放線(xiàn)菌(Thermobifidafusca)DSM 43793生物量增加,但聚酯膜降解酶未增加。所以添加無(wú)機(jī)氮和有機(jī)氮抑制菌株X8P產(chǎn)酶的可能原因是LB培養(yǎng)基中氮源物質(zhì)已可滿(mǎn)足菌株X8P發(fā)酵產(chǎn)酶,額外添加的氮源使菌株X8P持續(xù)生長(zhǎng)傳代,使同時(shí)期時(shí)處于產(chǎn)酶階段微生物量減少,從而導(dǎo)致酶產(chǎn)量降低。

    酶蛋白適宜pH和pH穩(wěn)定性是其重要性質(zhì)之一。目前,文獻(xiàn)報(bào)道的大部分角質(zhì)酶適宜pH均在6.0~10.0內(nèi)[7,18-20]。本研究發(fā)現(xiàn),菌株X8P胞外粗酶適宜pH 6.5,這與來(lái)源于Thermobifidafusca和花粉角質(zhì)酶適宜pH一致[16-17],在pH 4.5~8.5之間,菌株X8P酶活性可保留50%以上。此外,菌株X8P胞外粗酶在pH 6.5~7.5內(nèi)30 min,酶活性可保留60%以上。菌株X8P胞外粗酶適宜溫度45 ℃,與已知角質(zhì)酶適宜溫度一致[7,19-20],在30~60 ℃均有較高活性(50%以上),在0~50 ℃處理30 min,酶活性保留60%以上。不同來(lái)源角質(zhì)酶溫度穩(wěn)定性存在一定差異。Fett等[11]發(fā)現(xiàn)通高溫放線(xiàn)菌(Thermoactinomycesvulgaris)NRRL B-16117角質(zhì)酶在50~60 ℃條件下1 h,酶活性幾乎不變,在70 ℃半衰期30 min,而真菌Fusariumsolanipisi角質(zhì)酶在40 ℃條件下85 h、60 ℃條件5 min,活性喪失50%[20]。這說(shuō)明角質(zhì)酶的溫度穩(wěn)定性與菌種來(lái)源存在較大關(guān)系。

    本試驗(yàn)中,菌株X8P粗酶在甘油(50%和80%)中可保留全部活性,在DMSO(50%)中活性保留66%,在其他有機(jī)溶劑中,活性全部喪失,這與已有文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果[15,21]一致。SDS強(qiáng)烈抑制菌株X8P粗酶活性,這與已有文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果[21-22]一致。酶蛋白活性易受金屬離子影響。本研究發(fā)現(xiàn),K+、Mn2+(1和10 mmol/L)使菌株X8P粗酶活性提高2%~20%,F(xiàn)e2+和Ni2+對(duì)粗酶活性影響不大。Zn2+明顯抑制粗酶活性。Mg2+、Ca2+、Ba2+、Na+、Fe3+、Cu2+(1 mmol/L)使粗酶活性提高10%~20%,Mg2+、Ca2+、Ba2+、Na+、Fe3+、Cu2+(10 mmol/L)對(duì)粗酶活性有抑制作用。Sebastian等[23]研究表明,Ca2+、Mg2+和Cu2+等金屬離子及螯合物不會(huì)影響細(xì)菌和真菌角質(zhì)酶的活性,而會(huì)影響花粉角質(zhì)酶的活性[17]。

    4 結(jié) 論

    ① 角質(zhì)降解菌X8P經(jīng)鑒定為AcetobacterorientalisX8P,其適宜發(fā)酵條件為37 ℃、發(fā)酵4 d,1%橄欖油強(qiáng)烈促進(jìn)菌株X8P產(chǎn)酶,1%可溶性淀粉抑制菌株X8P產(chǎn)酶。

    ② 菌株胞外粗酶適宜溫度45 ℃,適宜pH 6.5,且具有一定的pH穩(wěn)定性,在甘油(50%和80%)中可保留全部活性,而在DMSO(50%)中活性可保留66%,Triton-100、K+、Mn2+(1和10 mmol/L)及Mg2+、Ca2+、Ba2+、Na+、Fe3+、Cu2+(1 mmol/L)對(duì)菌株X8P粗酶活性有部分促進(jìn)作用。

    [1] LIN T S,KOLATTUKUDY P E.Isolation and characterization of a cuticular polyester (cutin) hydrolyzing enzyme fromPhytopathogenicfungi[J].Physiological Plant Pathology,1980,17(1):1-15.

    [2] KOLATTUKUDY P E.Biopolyester membranes of plants:cutin and suberin[J].Science,1980,208(4447):990-1000.

    [3] DEGANI O,GEPSTEIN S,DOSORETZ C G.Potential use of cutinase in enzymatic scouring of cotton fiber cuticle[J].Applied Biochemistry and Biotechnology,2002,102/103(1/2/3/4/5/6):277-289.

    [4] INGLIS G D,YANKE L J,SELINGER L B.Cutinolytic esterase activity of bacteria isolated from mixed-plant compost and characterization of a cutinase gene fromPseudomonaspseudoalcaligenes[J].Canadian Journal of Microbiology,2011,57(11):902-913.

    [5] FETT W F,GERARD H C,MOREAU R A,et al.Screening of nonfilamentous bacteria for production of cutin-degrading enzymes[J].Applied and Environmental Microbiology,1992,58(7):2123 -2130.

    [6] 張效寧,冉琴琴,張學(xué)俊.角質(zhì)酶的研究與應(yīng)用進(jìn)展[J].中國(guó)釀造,2013,32(11):11-17.

    [7] KOSCHORRECK K,LIU D,KAZENWADEL C,et al.Heterologous expression,characterization and site-directed mutagenesis of cutinase CUTAB1 fromAlternariabrassicicola[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2010,87(3):991-997.

    [8] FETT W F,GéRARD H C,MOREAU R A,et al.Cutinase production byStreptomycesspp[J].Current Microbiology,1992,25(3):165-171.

    [10] 劉春紅,馮志彪.以α-乙酸萘酯為底物植物酯酶活力測(cè)定條件的優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技,2008(6):145-147,151.

    [11] FETT W F,WIJEY C,MOREAU R A,et al.Production of cutinolytic esterase by filamentous bacteria[J].Letters in Applied Microbiology,2000,31(1):25-29.

    [12] KLEEBERG I,HETZ C,KROPPENSTEDT R M,et al.Biodegradation of aliphatic-aromatic copolyesters byThermomonosporafuscaand other thermophilic compost isolates[J].Applied and Environmental Microbiology,1998,64(5):1731-1735.

    [13] YANG S Q,XU H B,YAN Q J,et al.A low molecular mass cutinase ofThielaviaterrestrisefficiently hydrolyzes poly(esters)[J].Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology,2013,40(2):217-226.

    [14] SHARMA R,CHISTI Y,BANERJEE U C.Production,purification,characterization,and applications of lipases[J].Biotechnology Advances,2001,19(8):-662.

    [15] CASTRO-OCHOA D,PEA-MONTE C,GONZLEZ-CANTO A,et al.Ancut2,an extracellular cutinase fromAspergillusnidulansinduced by olive oil[J].Applied Biochemistry and Biotechnology,2012,166(5):1275-1290.

    [16] KLEEBERG I,WELZEL K,VANDENHEUVEL J,et al.Characterization of a new extracellular hydrolase fromThermobifidafuscadegrading aliphatic-aromatic copolyesters[J].Biomacromolecules,2005,6(1):262-270.

    [17] SEBASTIAN J,CHANDRA A K,KOLATTUKUDY P E.Discovery of a cutinase-producing Pseudomonas sp. cohabiting with an apparently nitrogen-fixingCorynebacteriumsp. in the phyllosphere[J].Journal of Bacteriology,1987,169(1):131-136.

    [18] FETT W F,WIJEY C,MOREAU R A,et al.Production of cutinase byThermomonosporafuscaATCC 27730[J].Journal of Applied Microbiology,1999,86(4):561-568.

    [19] KWON M A,KIM H S,YANG T H,et al.High-level expression and characterization ofFusariumsolanicutinase inPichiapastoris[J].Protein Expression and Purification,2009,68(1):104-109.

    [20] CHENG S,TONG X,WOODARD R W,et al.Identification and characterization of bacterial cutinase[J].The Journal of Biological Chemistry,2008,283(38):25854-25862.

    [21] OUYANG L M,LIU J Y,QIAO M,et al.Isolation and biochemical characterization of two novel metagenome-derived esterases[J].Applied Biochemistry and Microbiology,2006,169(1) :15-28.

    [22] PARK Y,CHOI S,LEE H.A carboxylesterase from the thermoacidophilic archaeonSulfolobussolfataricusP1;purification,characterization,and expression[J].Biochimica et Biophysica Acta (BBA):General Subjects,2006,1760(5):820-828.

    [23] SEBASTIAN J,KOLATTUKUDY P E.Purification and characterization of cutinase from a fluorescentPseudomonasputidabacterial strain isolated from phyllosphere[J].Archives of Biochemistry and Biophysics,1988,263(1):77-85.

    *Corresponding author, associate professor, E-mail: zhty999@163.com

    (責(zé)任編輯 武海龍)

    Identification, Fermentation Conditions Optimization and Enzymatic Properties of Cutin Degrading Bacteria

    LIANG Zhengwen1ZHANG Tieying1*LI Shuang1LIU Junli2

    (1. State Key Laboratory of Animal Nutrition, Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Science, Beijing 100193, China; 2. College of Animal Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

    The present study was designed to identify the cutin degrading strain X8P, their fermentation conditions and enzymatic properties were also explored, to investigate the degradation of plant cuticular surface, and to improve the possible new schemes for the utilization of plant fiber. The strain X8P was identified by morphology observation and 16S rDNA sequencing, and the optimal fermentation conditions of carbon source, nitrogen source, fermentation temperature and fermentation time for enzyme production were investigated. After precipitating crude extracellular enzyme protein by ammonium sulfate, we studied the optimum pH and pH stability and temperature and temperature stability of crude extracellular enzyme, and the effect of organic solvents, surfactants and metal ions on crude enzyme. The results showed as follows: 1) the strain X8P was successfully identified asAcetobacterorientalisby colony morphological characteristic observing and 16S rDNA sequencing. 2) The optimal fermentation conditions of the strain X8P were temperature 37 ℃ and fermentation time for 4 days in the lysogeny broth (LB) medium. The LB medium supplemented with 1% olive oil and glucose was significantly promoted enzyme production, and supplemented with 1% soluble starch inhibited the enzyme production. 3) The optimum temperature and pH of the strain X8P’s extracellular esterase with good pH stability were 45 ℃ and pH 6.5. In tested organic solvents, the enzyme exhibited part of cutinolytic esterase activity only in dimethyl sulfoxide (DMSO)(50%). Tween-20 (1 mmol/L), Tween-80 (1 mmol/L) and Triton-100 (1 and 10 mmol/L) could improve the extracellular enzyme activity as 3% to 35%. Metal ions such as K+, Mn2+(1 and 10 mmol/L) could improve extracellular enzyme activity as 2% to 20%. Therefore, the strain X8P has certain enzyme potential and application prospects, worthy of further study.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(11):3567-3575]

    cutin; cutinase; cutin degrading bacteria; fermentation conditions optimization; enzymatic properties

    2016-05-01

    梁爭(zhēng)文(1991—),男,河南洛陽(yáng)人,碩士研究生,動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)專(zhuān)業(yè)。E-mail: 13126664873@163.com

    *通信作者:張鐵鷹,副研究員,碩士生導(dǎo)師,E-mail: zhty999@163.com

    10.3969/j.issn.1006-267x.2016.11.025

    S811.6

    A

    1006-267X(2016)11-3567-09

    猜你喜歡
    胞外酯酶產(chǎn)酶
    硝化顆粒污泥胞外聚合物及信號(hào)分子功能分析
    生物膜胞外聚合物研究進(jìn)展
    地黃梓醇和乙酰膽堿酯酶作用的分子動(dòng)力學(xué)模擬
    蜈蚣草化學(xué)成分及抑制乙酰膽堿酯酶生物活性研究
    新的藥根堿三唑的合成與抗菌以及乙酰膽酯酶抑制活性評(píng)價(jià)
    水華期間藻類(lèi)分層胞外聚合物與重金屬的相互作用機(jī)制研究
    纖維素酶發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化探討
    一株降解β-胡蘿卜素細(xì)菌的分離鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化
    南大西洋熱液區(qū)沉積物可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性分析和產(chǎn)酶活性鑒定
    二咖啡??鼘幩崤c人血漿阿司匹林酯酶的分子對(duì)接
    中成藥(2014年9期)2014-02-28 22:28:55
    男女视频在线观看网站免费| 黄色日韩在线| 国产一级毛片在线| 日本三级黄在线观看| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 免费少妇av软件| 麻豆成人av视频| 最近中文字幕2019免费版| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 国产真实伦视频高清在线观看| 国产 一区精品| 成人午夜高清在线视频| 国产一区二区三区av在线| 国产精品福利在线免费观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 色综合亚洲欧美另类图片| 少妇的逼好多水| 日韩av在线大香蕉| 亚洲四区av| 干丝袜人妻中文字幕| 又爽又黄a免费视频| 国产淫语在线视频| 中国美白少妇内射xxxbb| 久久久久久久久久人人人人人人| 麻豆久久精品国产亚洲av| av免费观看日本| av免费在线看不卡| 18禁在线播放成人免费| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 嫩草影院精品99| 日日撸夜夜添| www.av在线官网国产| 国产成人a区在线观看| 五月玫瑰六月丁香| 亚洲丝袜综合中文字幕| 国产在视频线精品| 综合色丁香网| 丰满人妻一区二区三区视频av| freevideosex欧美| 日本-黄色视频高清免费观看| 久久久欧美国产精品| 中文在线观看免费www的网站| 欧美激情在线99| 日韩精品青青久久久久久| 免费电影在线观看免费观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲av.av天堂| 97超视频在线观看视频| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 日日啪夜夜撸| 高清日韩中文字幕在线| 亚洲内射少妇av| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 亚洲,欧美,日韩| 一个人看视频在线观看www免费| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产黄频视频在线观看| 久久国产乱子免费精品| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 亚洲欧洲国产日韩| 久久久成人免费电影| 亚洲乱码一区二区免费版| 国产老妇女一区| 18禁动态无遮挡网站| 青春草国产在线视频| 国产av国产精品国产| 亚洲av成人av| 精品久久久久久久久av| 国产黄a三级三级三级人| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 中国美白少妇内射xxxbb| 精品一区二区三区视频在线| av在线蜜桃| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产不卡一卡二| 又爽又黄a免费视频| 亚洲精品成人久久久久久| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲av男天堂| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产精品久久久久久久电影| 免费高清在线观看视频在线观看| 91aial.com中文字幕在线观看| 免费电影在线观看免费观看| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 搡老乐熟女国产| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 男女视频在线观看网站免费| 91在线精品国自产拍蜜月| 在线观看免费高清a一片| 18禁在线播放成人免费| 亚洲四区av| 亚洲av不卡在线观看| 欧美潮喷喷水| www.av在线官网国产| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 成年女人看的毛片在线观看| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 22中文网久久字幕| 天堂中文最新版在线下载 | 能在线免费观看的黄片| 亚洲真实伦在线观看| 日日干狠狠操夜夜爽| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 久久久久免费精品人妻一区二区| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产午夜精品一二区理论片| 欧美日本视频| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 日本-黄色视频高清免费观看| 久久99蜜桃精品久久| 草草在线视频免费看| 在线免费观看的www视频| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 午夜爱爱视频在线播放| 国产精品伦人一区二区| 男女那种视频在线观看| 国产成人一区二区在线| 亚洲成色77777| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 欧美区成人在线视频| 国产成人精品久久久久久| 亚洲精品aⅴ在线观看| 日本与韩国留学比较| 免费av毛片视频| 精品一区在线观看国产| av国产久精品久网站免费入址| 青春草国产在线视频| 免费看av在线观看网站| 欧美 日韩 精品 国产| 免费黄频网站在线观看国产| 免费人成在线观看视频色| 99久久精品一区二区三区| 高清视频免费观看一区二区 | av.在线天堂| 国产有黄有色有爽视频| 插逼视频在线观看| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产精品一及| 精品久久久久久久久av| 97热精品久久久久久| 国产中年淑女户外野战色| 免费少妇av软件| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| av国产免费在线观看| 国产男人的电影天堂91| 日本av手机在线免费观看| 午夜免费激情av| 91精品国产九色| 99热这里只有是精品50| 国产精品不卡视频一区二区| 国产在线一区二区三区精| 午夜精品一区二区三区免费看| 天堂影院成人在线观看| 免费看日本二区| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 成人鲁丝片一二三区免费| 亚洲av免费高清在线观看| 国产精品久久视频播放| 国产片特级美女逼逼视频| 国产精品熟女久久久久浪| 在线 av 中文字幕| 99久国产av精品| 欧美成人精品欧美一级黄| 赤兔流量卡办理| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 久久久久久久久久人人人人人人| 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产av在哪里看| 亚洲国产精品专区欧美| 国产精品一及| 久久精品综合一区二区三区| 777米奇影视久久| 97在线视频观看| 亚洲精品久久午夜乱码| 久久久久九九精品影院| 亚洲国产欧美人成| 久久久久久久午夜电影| 高清av免费在线| 亚洲高清免费不卡视频| 久热久热在线精品观看| 日本三级黄在线观看| 中国美白少妇内射xxxbb| 亚洲三级黄色毛片| 久久鲁丝午夜福利片| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 国产美女午夜福利| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 一二三四中文在线观看免费高清| 欧美高清成人免费视频www| 亚洲三级黄色毛片| 国产色婷婷99| 欧美高清成人免费视频www| 久久久久久久久久人人人人人人| 亚洲av中文av极速乱| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产不卡一卡二| 久久99热这里只有精品18| 嫩草影院精品99| 久久97久久精品| 日日干狠狠操夜夜爽| 人妻系列 视频| 日本一本二区三区精品| 高清在线视频一区二区三区| 亚洲欧美成人精品一区二区| 白带黄色成豆腐渣| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲内射少妇av| 国产免费视频播放在线视频 | 天堂av国产一区二区熟女人妻| 99热这里只有精品一区| 在线播放无遮挡| 欧美三级亚洲精品| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 久久久久网色| 国产一级毛片在线| 波多野结衣巨乳人妻| 欧美日韩在线观看h| 综合色丁香网| 嘟嘟电影网在线观看| 欧美+日韩+精品| 91av网一区二区| 国产高清有码在线观看视频| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 久久久久久久久久久免费av| 精华霜和精华液先用哪个| 一夜夜www| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 国产成人精品福利久久| 久久这里只有精品中国| 一级毛片我不卡| 成年女人在线观看亚洲视频 | 欧美人与善性xxx| 欧美bdsm另类| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 国产毛片a区久久久久| 精品久久久久久久久亚洲| 两个人视频免费观看高清| 91精品国产九色| 插逼视频在线观看| 国产黄a三级三级三级人| 最后的刺客免费高清国语| 别揉我奶头 嗯啊视频| 国产又色又爽无遮挡免| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 久久99精品国语久久久| 免费大片18禁| 国产精品蜜桃在线观看| 99热这里只有是精品50| 国产精品久久久久久久电影| 少妇被粗大猛烈的视频| 欧美性感艳星| 一本久久精品| 日本一本二区三区精品| 国内精品美女久久久久久| 日韩欧美三级三区| 成人av在线播放网站| 最近最新中文字幕大全电影3| 国产老妇女一区| 国产av不卡久久| 丰满少妇做爰视频| 丝袜喷水一区| 日本熟妇午夜| 国产av在哪里看| 亚州av有码| 最近2019中文字幕mv第一页| 青春草视频在线免费观看| 日韩av不卡免费在线播放| 免费高清在线观看视频在线观看| 69av精品久久久久久| 精品人妻一区二区三区麻豆| 精品人妻偷拍中文字幕| 边亲边吃奶的免费视频| 岛国毛片在线播放| 免费观看a级毛片全部| 青春草亚洲视频在线观看| 免费观看的影片在线观看| 国产在线一区二区三区精| 免费观看av网站的网址| 777米奇影视久久| 日韩一区二区三区影片| 国产欧美日韩精品一区二区| 人体艺术视频欧美日本| 午夜福利网站1000一区二区三区| 日韩av不卡免费在线播放| www.色视频.com| or卡值多少钱| 搡老妇女老女人老熟妇| 51国产日韩欧美| 国产在线一区二区三区精| 99视频精品全部免费 在线| 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲精品色激情综合| 成年人午夜在线观看视频 | 亚洲国产成人一精品久久久| 看免费成人av毛片| 国产 一区精品| 久久久成人免费电影| 亚洲av一区综合| 精品久久久精品久久久| 国产av码专区亚洲av| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 国内精品一区二区在线观看| 午夜精品在线福利| 国产在视频线精品| av黄色大香蕉| 国产色婷婷99| 在线a可以看的网站| 国产一区二区三区av在线| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲四区av| 丝瓜视频免费看黄片| 一个人看的www免费观看视频| ponron亚洲| 亚洲av免费在线观看| 国产在视频线精品| 乱码一卡2卡4卡精品| 欧美最新免费一区二区三区| 欧美bdsm另类| 免费看美女性在线毛片视频| 一级av片app| 日本三级黄在线观看| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 国产精品国产三级专区第一集| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 春色校园在线视频观看| 观看免费一级毛片| 国产一级毛片七仙女欲春2| 日韩三级伦理在线观看| 麻豆成人午夜福利视频| 午夜免费男女啪啪视频观看| 22中文网久久字幕| 99九九线精品视频在线观看视频| 久热久热在线精品观看| 国产精品99久久久久久久久| 亚洲精品亚洲一区二区| 青青草视频在线视频观看| 麻豆av噜噜一区二区三区| 一个人看视频在线观看www免费| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 免费看美女性在线毛片视频| 久久草成人影院| 免费看光身美女| 黄片无遮挡物在线观看| 免费看美女性在线毛片视频| 嘟嘟电影网在线观看| 秋霞伦理黄片| 亚洲电影在线观看av| 久久久久精品久久久久真实原创| 69av精品久久久久久| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产成人精品久久久久久| 国产成人精品婷婷| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 91精品一卡2卡3卡4卡| 久久久午夜欧美精品| 偷拍熟女少妇极品色| 国产乱人偷精品视频| 91久久精品电影网| 青青草视频在线视频观看| 国产乱来视频区| 免费少妇av软件| freevideosex欧美| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 久久久久性生活片| 免费看光身美女| 亚洲欧洲国产日韩| 国产免费视频播放在线视频 | 少妇高潮的动态图| 男女边摸边吃奶| 国产成人精品婷婷| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲国产成人一精品久久久| 免费人成在线观看视频色| 最近2019中文字幕mv第一页| 中文资源天堂在线| 亚洲综合色惰| 免费在线观看成人毛片| 99视频精品全部免费 在线| 视频中文字幕在线观看| 夜夜爽夜夜爽视频| 精品人妻视频免费看| 国产精品久久久久久av不卡| 成人午夜精彩视频在线观看| 日本wwww免费看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 久久鲁丝午夜福利片| 欧美精品国产亚洲| 久久精品夜色国产| www.av在线官网国产| 国产精品人妻久久久影院| 午夜爱爱视频在线播放| 国产精品一区二区在线观看99 | 天堂√8在线中文| 婷婷色av中文字幕| 成人亚洲精品一区在线观看 | 禁无遮挡网站| 国产大屁股一区二区在线视频| 国产乱人视频| av一本久久久久| 欧美成人午夜免费资源| 国产有黄有色有爽视频| 综合色丁香网| 国产精品嫩草影院av在线观看| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国产一区有黄有色的免费视频 | 国产一区二区三区av在线| 婷婷色综合www| 少妇高潮的动态图| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 国产成人午夜福利电影在线观看| 777米奇影视久久| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 亚洲天堂国产精品一区在线| 十八禁网站网址无遮挡 | 天堂av国产一区二区熟女人妻| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产 一区精品| 午夜老司机福利剧场| 国产一区有黄有色的免费视频 | 一级毛片电影观看| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 99视频精品全部免费 在线| 国产高清国产精品国产三级 | 91av网一区二区| 一本一本综合久久| 美女被艹到高潮喷水动态| 2022亚洲国产成人精品| 爱豆传媒免费全集在线观看| 午夜爱爱视频在线播放| 搞女人的毛片| 床上黄色一级片| 国产亚洲一区二区精品| 精品国产露脸久久av麻豆 | 天美传媒精品一区二区| 欧美3d第一页| 亚洲经典国产精华液单| 黑人高潮一二区| 在线免费观看不下载黄p国产| 成年女人在线观看亚洲视频 | videos熟女内射| 国产精品一区二区性色av| 97超视频在线观看视频| av女优亚洲男人天堂| 啦啦啦啦在线视频资源| 三级经典国产精品| 国产男人的电影天堂91| 亚洲国产色片| 成年女人在线观看亚洲视频 | 免费大片黄手机在线观看| 男人舔女人下体高潮全视频| 一级黄片播放器| 伊人久久精品亚洲午夜| 男女啪啪激烈高潮av片| 精品人妻视频免费看| 男人和女人高潮做爰伦理| 欧美人与善性xxx| 日韩强制内射视频| 韩国高清视频一区二区三区| 亚洲人成网站在线播| 日本黄大片高清| 淫秽高清视频在线观看| 国产免费又黄又爽又色| 亚洲欧洲国产日韩| 美女高潮的动态| freevideosex欧美| 在现免费观看毛片| 特级一级黄色大片| 国产一区亚洲一区在线观看| 韩国高清视频一区二区三区| 午夜福利高清视频| 精品一区二区三区视频在线| 九九在线视频观看精品| 国产免费视频播放在线视频 | 美女主播在线视频| 国产视频内射| av在线蜜桃| 亚洲国产最新在线播放| 欧美+日韩+精品| 夫妻午夜视频| 国产一区有黄有色的免费视频 | 亚洲人成网站高清观看| 日本午夜av视频| 国产乱来视频区| 在线天堂最新版资源| 在线观看美女被高潮喷水网站| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 99热网站在线观看| 亚洲图色成人| 亚洲国产精品sss在线观看| 免费看日本二区| 蜜臀久久99精品久久宅男| 能在线免费看毛片的网站| 内射极品少妇av片p| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 极品教师在线视频| 久久久久久九九精品二区国产| 色播亚洲综合网| 午夜免费男女啪啪视频观看| 婷婷六月久久综合丁香| 秋霞在线观看毛片| 日本-黄色视频高清免费观看| 成人无遮挡网站| 人妻一区二区av| av又黄又爽大尺度在线免费看| 91精品国产九色| 男的添女的下面高潮视频| 嫩草影院入口| 国产伦一二天堂av在线观看| 麻豆国产97在线/欧美| 好男人视频免费观看在线| 久久草成人影院| 精品人妻偷拍中文字幕| 毛片女人毛片| 亚洲成人av在线免费| or卡值多少钱| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产精品av视频在线免费观看| 日本黄色片子视频| 亚洲电影在线观看av| 国产精品久久久久久av不卡| 成人亚洲精品一区在线观看 | 男插女下体视频免费在线播放| 国产成人freesex在线| 一级a做视频免费观看| 国产日韩欧美在线精品| av免费在线看不卡| 亚洲久久久久久中文字幕| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产91av在线免费观看| 国产 亚洲一区二区三区 | 午夜福利成人在线免费观看| 婷婷六月久久综合丁香| 别揉我奶头 嗯啊视频| 日韩伦理黄色片| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产精品无大码| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 午夜福利高清视频| 热99在线观看视频| 久热久热在线精品观看| 91av网一区二区| 国产单亲对白刺激| 美女大奶头视频| 99久国产av精品| 亚洲精品日韩av片在线观看| 女人被狂操c到高潮| 我要看日韩黄色一级片| 亚洲成人一二三区av| 日韩一本色道免费dvd| 美女内射精品一级片tv| 成人亚洲精品一区在线观看 | 成人午夜高清在线视频| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 亚洲av免费在线观看| 午夜久久久久精精品| 777米奇影视久久| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 男女下面进入的视频免费午夜| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲怡红院男人天堂| 亚洲天堂国产精品一区在线| 亚洲国产精品专区欧美| 又爽又黄无遮挡网站| 男的添女的下面高潮视频| 在线 av 中文字幕| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产片特级美女逼逼视频| 九九在线视频观看精品| 色播亚洲综合网| 天天一区二区日本电影三级| 亚洲av一区综合| 欧美+日韩+精品| 国产高清国产精品国产三级 | 日韩强制内射视频| 国产午夜精品一二区理论片| 2018国产大陆天天弄谢| 久久这里有精品视频免费| 午夜激情久久久久久久| 精品久久久噜噜| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 亚洲av电影不卡..在线观看| 成人国产麻豆网| 亚洲国产精品国产精品| 免费电影在线观看免费观看| 午夜激情久久久久久久| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产男人的电影天堂91| 日韩欧美一区视频在线观看 | 欧美精品国产亚洲| 天堂网av新在线| av免费在线看不卡| 国产成人a区在线观看| 亚洲av成人av| 亚洲人成网站在线观看播放| 少妇的逼好多水| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 99九九线精品视频在线观看视频| 欧美+日韩+精品| 最近中文字幕高清免费大全6| 亚洲最大成人中文| 色播亚洲综合网| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 大片免费播放器 马上看| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 国产色爽女视频免费观看| 高清av免费在线| 18+在线观看网站| 超碰av人人做人人爽久久|