多糖提取和抗氧化活性評價方法的研究現(xiàn)狀和進(jìn)展

劉 松 董曉芳 佟建明

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193)

?

多糖提取和抗氧化活性評價方法的研究現(xiàn)狀和進(jìn)展

劉 松 董曉芳*佟建明

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193)

作為構(gòu)成生命活動的四大基本物質(zhì)之一，多糖與維持生命所需的多種生理功能密切相關(guān)。隨著研究的進(jìn)行，多糖的抗氧化活性成為眾多學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。本文綜述了多糖的提取和抗氧化活性評價方法的研究現(xiàn)狀和進(jìn)展，以期為多糖的提取和抗氧化活性評價研究提供借鑒。

多糖；提?。豢寡趸钚栽u價

多糖是廣泛存在于自然界的一類天然高分子化合物，一般由10個以上單糖分子之間通過α-或β-糖苷鍵線性或分枝連接組成。作為構(gòu)成生命活動的四大基本物質(zhì)之一，多糖與維持生命所需的多種生理功能密切相關(guān)。20世紀(jì)50年代以來，多糖及其復(fù)合物在細(xì)胞識別、分化、代謝、免疫應(yīng)答、癌變、凋亡、抗氧化等各項生命活動中的功能逐漸引起人們的關(guān)注。抗氧化是多糖重要的生物學(xué)活性之一。目前，關(guān)于多糖提取、抗氧化活性及其作用機(jī)理的研究日趨廣泛和深入。

1 多糖的提取方法

常用的多糖提取方法主要有：水提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、酶解輔助提取法等。

1.1 水提取法

水提取法是一種常用的多糖提取方法，其是利用多糖溶于水的性質(zhì)，采用熱水浸煮或冷水浸提滲濾提取多糖。影響水提取法提取率的因素有：提取溫度、料液比、提取時間及提取次數(shù)。研究人員對多糖水提取法的研究主要集中在對這幾個提取條件的優(yōu)化上，通常采用正交試驗法、響應(yīng)面試驗法優(yōu)化確定上述幾個因素的最佳組合。水提取法對條件要求簡單，便于使用，但在提取多糖的同時也易將蛋白質(zhì)、苷類等水溶性成分提取出來，使得多糖純度不高。此外該法耗時，提取效率不高。已報道的采用熱水提取法的多糖有：虎奶菇多糖[1-2]、蘋果多糖[3-4]、劍麻多糖[5]、靈芝多糖[6-7]、蜀葵種子多糖[8]、擔(dān)子菌多糖[9]、淫羊藿多糖[10-11]、桑黃多糖[12]等。

1.2 超聲波輔助提取法和微波輔助提取法

超聲波輔助提取法主要是利用超聲波產(chǎn)生強(qiáng)烈的空化效應(yīng)、機(jī)械振動、擾動效應(yīng)、乳化、擴(kuò)散、擊碎和攪拌作用等多級效應(yīng)，增大物料分子的運(yùn)動頻率和速度，形成瞬間空化高溫和局部高壓，加速物料中多糖在溶媒的溶出。微波輔助提取法則主要是利用高頻電磁波穿透提取介質(zhì)，使物料細(xì)胞內(nèi)的水分吸收微波能，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部溫度迅速上升，連續(xù)的高溫使細(xì)胞膨脹破裂，加速物料細(xì)胞內(nèi)多糖的自由流出。同時，微波所產(chǎn)生的電磁場可以加速多糖向提取溶劑界面擴(kuò)散的速率，縮短多糖分子由物料內(nèi)部擴(kuò)散到萃取溶劑界面的時間，從而提高提取速率。

超聲波輔助提取法和微波輔助提取法的優(yōu)點(diǎn)在于能利用物理作用加速細(xì)胞壁破碎和多糖的浸出，提高多糖提取的效率，同時還可降低提取溫度，最大限度保證提取的多糖質(zhì)量。但是，與傳統(tǒng)水提取法相比，超聲波輔助提取法和微波輔助提取法提取過程中超聲和微波功率、頻率、處理時間等工藝條件都需要額外優(yōu)化，而且這2種方法是由內(nèi)向外快速傳熱，因而功率過大或時間太長可能會導(dǎo)致多糖的糖苷鍵斷開[13]，對多糖生物學(xué)活性產(chǎn)生不利影響。目前報道的采用超聲波輔助提取法和微波輔助提取法提取的多糖有虎奶菇多糖[2]、古尼蟲草多糖[14]、黨參多糖[15]、銀耳多糖[16]等。

1.3 酶解輔助提取法

酶解輔助提取法是指在多糖的提取時加入一定活性的一種或多種酶來加速細(xì)胞壁的破碎、多糖的浸出，如加入纖維素酶和果膠酶分解細(xì)胞壁、蛋白酶以除去雜蛋白等。使用酶解輔助提取法時，既可以同時使用多種酶(復(fù)合酶法)[17-18]，也可單獨(dú)使用一種酶(單一酶法)[19]。酶解輔助提取法的優(yōu)點(diǎn)在于提取條件溫和、效率較高。但是由于外源酶的加入可能會造成多糖的單糖組成、分子量、多糖結(jié)構(gòu)和構(gòu)象[18]等理化性質(zhì)發(fā)生變化，從而對多糖生物學(xué)活性造成影響。同時，酶解輔助提取法中酶的成本較高，提取條件(尤其是溫度和酸堿度)需要額外優(yōu)化選擇，而且條件要求較高，從而使得酶解輔助提取法的應(yīng)用受到限制。目前已報道的使用酶解輔助提取法提取的多糖有：苜蓿多糖[20]、淫羊藿多糖[11]、黃芪多糖[21]、枸杞多糖[22]等。

1.4 多糖的其他提取方法

多糖的提取方法還有堿提取法[1,9]、高壓脈沖電場輔助提取法[23]、超聲波-酶協(xié)同輔助提取法[1]等。多糖的上述幾種提取方法雖有零星研究報道，但實際應(yīng)用尚較少。多糖提取方法的優(yōu)缺點(diǎn)見表1。

表1 多糖提取方法的優(yōu)缺點(diǎn)

2 多糖抗氧化活性的研究進(jìn)展

2.1 體外研究

多糖抗氧化活性體外研究主要是通過使用化學(xué)、生物學(xué)方法對多糖清除自由基能力、抑制脂質(zhì)過氧化和蛋白質(zhì)氧化損傷能力等評價方法來進(jìn)行?？寡趸钚泽w外評價方法簡便、快捷，因此得到廣泛應(yīng)用。不同的抗氧化活性體外評價方法分別基于不同的反應(yīng)原理，但各自存在缺陷，因此在多糖體外抗氧化活性評價過程中僅選用1種評價方法顯得有些不足。因此，在進(jìn)行多糖體外抗氧化能力評價的時候，眾多學(xué)者一致推薦至少采用2種基于不同原理的體外評價方法。

2.1.1 體外化學(xué)方法評價

2.1.1.1 清除自由基活性評價

自由基具有極強(qiáng)的氧化反應(yīng)能力，其能通過氧化作用來攻擊所遇到的任何分子，使機(jī)體內(nèi)的大分子物質(zhì)產(chǎn)生過氧化反應(yīng)，從而引起機(jī)體不可逆損傷。因此多糖的清除自由基能力是評價其抗氧化活性的一個重要方面。

常用的清除自由基活性評價方法有：清除1,1-二苯基-2-苦基肼(1,1-two phenyl-2-bitter base hydrazine，DPPH)自由基活性評價、清除2,2′-聯(lián)氮-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)[2, 2′-azino-two (3-ethyl benzene and thiazole-6-sulfonic acid)，ABTS]自由基活性評價、清除活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)活性評價、清除活性氮自由基(reactive nitrogen species，RNS)活性評價。其中清除ROS活性評價主要包括清除氧化自由基(oxyradical，ROO·)、超氧陰離子自由基(superoxide anion radical，O2-·)和羥基自由基(hydroxyl free radical，OH·)能力評價。清除RNS活性評價包括清除一氧化氮自由基(nitric oxide radical，NO·)和過氧化亞硝鹽離子自由基(pro-oxidant peroxynitrite，ONOO-)能力評價。

Wang等[3]、Zhang等[5]分別對復(fù)合酶輔助提取的苜蓿多糖、熱水提取的劍麻多糖進(jìn)行清除DPPH自由基、羥自由基活性評價，發(fā)現(xiàn)苜蓿多糖和劍麻多糖具有清除DPPH自由基、羥基自由基活性，且具有劑量效應(yīng)。Wang等[3]報道蘋果多糖具有清除DPPH自由基和ABTS自由基活性，且具有劑量效應(yīng)。Cheng等[10-11]發(fā)現(xiàn)淫羊藿多糖具有清除DPPH自由基、羥基自由基和ABTS自由基活性。據(jù)報道，蜀葵多糖[8]、靈芝多糖[24]、蘋果多糖[25]具有清除超氧陰離子自由基活性。

此外，Klaus等[9]、Ma等[26]、Li等[27]、Volpi等[28]分別使用上述1種或幾種方法對擔(dān)子菌多糖、白樺茸多糖、玉米穗多糖、桑葚多糖清除自由基能力進(jìn)行研究，并發(fā)現(xiàn)這幾種多糖都具有一定的體外清除自由基活性。

2.1.1.2 還原能力評價

多糖同樣具有良好的還原能力，因此可以通過測定多糖的還原能力來間接評價其抗氧化活性。目前，應(yīng)用于多糖抗氧化能力評價的主要方法有：三價鐵離子(Fe3+)還原能力評價、二價鐵離子(Fe2+)結(jié)合能力評價、總還原能力評價等。

Chen等[13]、Ma等[26]分別發(fā)現(xiàn)淫羊藿多糖、白化茸多糖具有Fe3+還原能力。Tseng等[7]分別發(fā)現(xiàn)松杉樹芝多糖具有Fe2+結(jié)合能力，從而具有抗氧化活性。Tseng等[7]、Liu等[8]、Dou等[25]和Li等[27]分別通過總還原能力評價發(fā)現(xiàn)松杉樹芝多糖、蜀葵多糖、蘋果多糖和金絲小棗具有一定的還原能力。

2.1.2 體外生物學(xué)評價

2.1.2.1 抑制體外脂質(zhì)過氧化活性評價

研究表明，多糖可以絡(luò)合產(chǎn)生ROS所必需的金屬離子[28]。多糖環(huán)上的醇羥基可與產(chǎn)生羥基自由基等所必需的金屬離子[如Fe2+、二價銅離子(Cu2+)等]絡(luò)合，使其不能產(chǎn)生羥基自由基，而羥基自由基能起動脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)可產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化氫(H2O2)。因此多糖能夠抑制脂質(zhì)過氧化。

Fe2+/抗壞血酸處理小鼠離體肝臟能引起肝臟脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的發(fā)生。目前研究發(fā)現(xiàn)，白化茸多糖[26]、海藻多糖[29]、靈芝多糖[30]、天門冬多糖[31]能抑制Fe2+/抗壞血酸引起的肝臟脂質(zhì)過氧化作用。

研究還發(fā)現(xiàn)，淫羊藿多糖[10]、銀耳多糖[16]能抑制紅細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性。

2.1.2.2 抑制體外蛋白質(zhì)氧化損傷活性評價

蛋白質(zhì)的氧化損傷會造成一系列的生理和病理紊亂[32]。Subramanian等[33]研究發(fā)現(xiàn)，心葉青牛膽多糖可以抑制輻射引起的蛋白質(zhì)損傷。

2.1.3 體外細(xì)胞模型評價

由于細(xì)胞更接近生物體內(nèi)的環(huán)境，因此與體外化學(xué)法和生物學(xué)評價方法相比，采用細(xì)胞為載體來進(jìn)行抗氧化活性的初期篩選、評價，成為多糖抗氧化活性研究一種較好的選擇。

研究者可以根據(jù)抗氧化物質(zhì)的應(yīng)用目的來選擇不同的模型細(xì)胞，以評價抗氧化活性物質(zhì)對生物體內(nèi)某一特定氧化應(yīng)激反應(yīng)的抗氧化能力[34-40]。表2列舉了多糖抗氧化活性研究中常用的細(xì)胞模型及其研究應(yīng)用。

2.2 體內(nèi)評價

上述多糖抗氧化活性的體外評價方法簡便、快捷，但是由于多糖消化、吸收、新陳代謝過程的作用增加了多糖抗氧化能力的不確定性，僅憑此研究結(jié)果不足以準(zhǔn)確評價其抗氧化活性。目前，采用有代表性的氧化應(yīng)激動物模型對多糖抗氧化活性進(jìn)行評價研究已經(jīng)得到了廣泛認(rèn)可。動物機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激時，體內(nèi)高活性分子如ROS和RNS等產(chǎn)生過多，氧化程度超出機(jī)體抗氧化物的清除能力，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致組織損傷的現(xiàn)象。在氧化應(yīng)激過程中，由于受到自由基的氧化脅迫，構(gòu)成細(xì)胞組織的各種物質(zhì)如脂質(zhì)、糖類、蛋白質(zhì)、核糖核酸(DNA或RNA)等大分子物質(zhì)，都會發(fā)生各種程度的氧化反應(yīng)，引起變性、交聯(lián)、斷裂等氧化損傷[34-36]，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞和細(xì)胞死亡，以及機(jī)體組織的損傷和器官的病變甚至癌癥等[37]。

表2 多糖抗氧化活性研究中常用的細(xì)胞模型及其研究應(yīng)用

研究發(fā)現(xiàn)，多糖抗氧化活性主要體現(xiàn)在對肝臟、腎臟等氧化自由基集中產(chǎn)生的器官蛋白質(zhì)損傷、脂質(zhì)過氧化、DNA或RNA氧化損傷的抑制、自由基的清除、抗氧化物(如抗氧化酶系統(tǒng)等)的保護(hù)、線粒體正常膜電位的維持等方面。

多糖抗氧化活性評價常用的動物模型包括D-半乳糖模型、轉(zhuǎn)基因動物模型、高脂血癥模型、脂肪酸氧化應(yīng)激模型、輻射損傷模型等試驗動物整體性地處于氧化應(yīng)激狀態(tài)的全身性的氧化應(yīng)激模型(也稱非特異性的氧化應(yīng)激模型)，另外還包括針對試驗動物的某些特定組織器官進(jìn)行氧化損傷的局部器官性的氧化應(yīng)激模型(也稱為特異性的氧化應(yīng)激模型)，如：四氯化碳(CCl4)-肝損傷模型、環(huán)孢靈-A誘導(dǎo)的肝或腎損傷氧化應(yīng)激模型、鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病(胰腺損傷)氧化損傷模型及蛋氨酸和膽堿缺乏肝損傷模型等。表3列舉了多糖抗氧化活性研究常用的動物模型及其研究應(yīng)用。

2.3 細(xì)胞模型和動物模型評價常用方法和指標(biāo)

多糖抗氧化活性的評價研究多集中在氧化應(yīng)激標(biāo)志物、抗氧化酶和抗氧化物的分析、細(xì)胞內(nèi)鈣、線粒體膜電位和線粒體凋亡分析等方面。根據(jù)氧化應(yīng)激的物質(zhì)種類，氧化應(yīng)激的定量評價方法主要有蛋白質(zhì)氧化損傷標(biāo)志物檢測、脂質(zhì)過氧化標(biāo)志物檢測、DNA或RNA損傷檢測以及活性氧消除系統(tǒng)酶和抗氧化物質(zhì)檢測等。研究證明，多糖在緩解蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸氧化損傷，調(diào)節(jié)機(jī)體抗氧化酶和抗氧化物水平，抑制細(xì)胞凋亡等抗氧化層面具有較好的活性。

2.3.1 蛋白質(zhì)氧化損傷分析

氧化應(yīng)激過程中，自由基對蛋白質(zhì)的損傷作用包括蛋白質(zhì)肽鏈斷裂、蛋白質(zhì)分子相互間交聯(lián)聚合、蛋白質(zhì)氨基酸發(fā)生氧化脫氨反應(yīng)、氧自由基攻擊蛋白質(zhì)還原性基團(tuán)、脂類氧化裂解所產(chǎn)生的丙二醛(MDA)與蛋白質(zhì)上的氨基產(chǎn)生分子間的交聯(lián)等。目前對于蛋白質(zhì)氧化損傷的檢測指標(biāo)主要有2個：蛋白質(zhì)羰基生成(羰基化)和二酪氨酸的生成(蛋白質(zhì)中酪氨酸硝基化)[59-62]。相比之下，試驗研究中以測定蛋白質(zhì)羰基水平居多。

Josephine等[56]通過測定蛋白質(zhì)羰基化水平，發(fā)現(xiàn)馬尾藻多糖能降低環(huán)孢靈-A誘導(dǎo)的肝損傷大鼠蛋白質(zhì)氨?；潭?，降低蛋白質(zhì)氧化損傷，緩解氧化應(yīng)激。

2.3.2 脂質(zhì)過氧化分析

脂質(zhì)過氧化為ROS與生物膜的磷脂、酶和膜受體相關(guān)的多不飽和脂肪酸的側(cè)鏈及核酸等大分子物質(zhì)起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，形成脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，如：MDA、4-羥基壬烯醛(HNE)，從而使細(xì)胞膜的流動性和通透性發(fā)生改變，最終導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變[63-64]。HNE和MDA是2個強(qiáng)毒力的脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物，常被作為判斷脂質(zhì)過氧化的指標(biāo)。試驗研究中以測定MDA含量較為常見。

表3 多糖抗氧化活性研究常用的動物模型及其研究應(yīng)用

通過測定脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA含量，Jia等[38]研究發(fā)現(xiàn)絞股藍(lán)多糖能降低β淀粉樣肽(Aβ)誘導(dǎo)的CP12細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平；Li等[48]發(fā)現(xiàn)刺五加多糖能降低輻射引起的氧化應(yīng)激大鼠脂質(zhì)過氧化水平；Yu等[50]發(fā)現(xiàn)甘遂多糖能降低游泳疲勞引起的氧化應(yīng)激小鼠的脂質(zhì)過氧化程度；Josephine等[56]發(fā)現(xiàn)馬尾藻多糖能降低環(huán)孢靈-A誘導(dǎo)的肝損傷大鼠脂質(zhì)過氧化程度。

2.3.3 DNA或RNA損傷分析

自由基可以直接攻擊生物大分子DNA或RNA誘發(fā)DNA或RNA氧化損傷[65-66]，其中以鳥嘌呤8位碳原子氧化后形成8-羥基-[脫氧]鳥嘌呤(8-OHdG/8-OHG)最為常見。另外，還有一些嘌呤或者嘧啶堿基直接脫去的反應(yīng)，因此形成了核酸中無嘌呤(apurinic)和脫嘧啶(apyrimidinic)位點(diǎn)，統(tǒng)簡稱AP位點(diǎn)。除了上述氧化損傷外，DNA雙鏈斷裂(DSBs)是細(xì)胞內(nèi)多種類型的DNA損傷中最危險、最嚴(yán)重的一種。試驗研究中多采用測定8-OHdG含量的方法評價DNA損傷。另外，彗星試驗(comet assay)也是應(yīng)用較多的DNA損傷評價方法。彗星試驗又稱單細(xì)胞凝膠電泳檢測技術(shù)(single cell gel electrophoresis assay，SCGE)是近年發(fā)展起來的在單細(xì)胞水平上定量檢測DNA損傷的靈敏方法。其原理為：變性切離的DNA片段在電場的影響下從細(xì)胞核中移出，而完整的超螺旋DNA仍然保持在細(xì)胞核內(nèi)。因而，通過凝膠電泳會形成完整的DNA的細(xì)胞染色體為“頭”，松散和斷裂的DNA為“尾”的“彗星拖尾”(comet tail)現(xiàn)象。DNA損傷越嚴(yán)重尾部和總彗星熒光百分比(tail DNA%)越高。

Josephine等[56]發(fā)現(xiàn)馬尾藻多糖能降低環(huán)孢靈-A誘導(dǎo)的肝損傷大鼠8-OHdG含量，緩解DNA損傷。Tsai等[40]通過測定H2O2誘導(dǎo)的張氏肝細(xì)胞8-OHdG含量，發(fā)現(xiàn)樟枝多糖可以降低其DNA損傷。另外，Tsai等[40]還通過彗星試驗研究證實，樟枝多糖可以降低H2O2誘導(dǎo)的張氏肝細(xì)胞DNA氧化損傷。

2.3.4 ROS、抗氧化酶和抗氧化物分析

需氧細(xì)胞在代謝過程中產(chǎn)生一系列的ROS，過多的ROS對細(xì)胞是有害的。細(xì)胞內(nèi)存在的各種活性酶及抗氧化劑在機(jī)體細(xì)胞抵御氧化損傷、維持氧化和抗氧化的平衡中起了重要作用，如：氧自由基酶類將活性氧簇轉(zhuǎn)化為低毒性物質(zhì)[67]、抗氧化物質(zhì)的解毒作用[68]等。其中，機(jī)體內(nèi)多種氧自由基酶類發(fā)揮了重要的作用。主要的抗氧化酶類有：堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase，GR)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)。SOD是體內(nèi)超氧陰離子的主要清除者，將其催化分解為H2O2，但H2O2也具有氧化損傷作用，CAT將其轉(zhuǎn)化為氧氣(O2)和水(H2O)。同時H2O2也可通過GSH-Px的催化和還原型谷胱甘肽(GSH)反應(yīng)生成H2O，同時生成氧化型谷胱甘肽。另外，機(jī)體內(nèi)GSH、維生素C、維生素E等非酶類抗氧化物質(zhì)也在維持氧化和抗氧化的平衡中起了重要作用。

此外，多糖能夠作為氫質(zhì)子或電子的供給體，直接猝滅或抑制自由基，終止自由基的連鎖反應(yīng)，發(fā)揮抗氧化功能?？赡芡緩揭皇嵌嗵潜旧砜梢葬尫懦鲶w積小、親合性很強(qiáng)的氫質(zhì)子，捕捉高勢能的極活潑的自由基使之轉(zhuǎn)變?yōu)榉腔钚曰蜉^為穩(wěn)定的化合物，另一個途徑可能是通過電子轉(zhuǎn)移直接給出電子而清除自由基。

眾多研究發(fā)現(xiàn)，樟枝多糖[40]、枸杞多糖[43]、刺五加[48]、甘遂多糖[50]、馬尾藻多糖[56]、枸杞多糖[57]等具有促進(jìn)機(jī)體GSH-Px、GR、SOD等抗氧化酶類生成的作用。Ma等[43]發(fā)現(xiàn)枸杞多糖能抵制飼喂高脂飼糧引起的氧化應(yīng)激小鼠肝臟內(nèi)非酶抗氧化物質(zhì)GSH、維生素C和維生素E含量的下降，緩解小鼠氧化應(yīng)激。此外，Jia等[38]研究發(fā)現(xiàn)，絞股藍(lán)多糖能降低Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞ROS含量。Tsai等[40]研究證實，樟枝多糖能降低H2O2誘導(dǎo)的張氏肝細(xì)胞ROS含量。

2.3.5 細(xì)胞內(nèi)鈣、線粒體膜電位和線粒體凋亡分析

過強(qiáng)的氧化應(yīng)激會引起細(xì)胞內(nèi)鈣水平升高，導(dǎo)致線粒體膜電位降低，進(jìn)而會激活線粒體凋亡通路。通過細(xì)胞內(nèi)鈣水平、線粒體膜電位測定和蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)等手段，Berridge等[68]發(fā)現(xiàn)，絞股藍(lán)多糖能通過降低細(xì)胞內(nèi)鈣水平、維持線粒體正常膜電位、降低B淋巴細(xì)胞瘤基因-2(Bax/Bcl-2)表達(dá)、減少線粒體細(xì)胞色素C釋放、抑制細(xì)胞凋亡蛋白酶(caspase-3,CPP3)來緩解PC12細(xì)胞由于Aβ誘導(dǎo)的氧化損傷[38]。

3 小 結(jié)

綜上所述，多糖的不同提取方法各有優(yōu)劣，在多糖提取中應(yīng)根據(jù)實際情況選擇合適的提取方法。同時，多糖的抗氧化機(jī)理復(fù)雜，在進(jìn)行多糖抗氧化活性評價研究時應(yīng)將體外評價和體內(nèi)評價方法結(jié)合起來，有層次、有目的地研究才能清楚的了解多糖抗氧化活性的機(jī)制、有效的提取和利用多糖。

[1] WU G H,HU T,HUANG Z L,et al.Characterization of water and alkali-soluble polysaccharides fromPleurotustuber-regiumsclerotia[J].Carbohydrate Polymers,2013,96(1):284-290.

[2] ZHANG M,ZHANG L N,CHEUNG P C K,et al.Molecular weight and anti-tumor activity of the water-soluble polysaccharides isolated by hot water and ultrasonic treatment from the sclerotia and mycelia ofPleurotustuber-regium[J].Carbohydrate Polymers,2004,56(2):123-128.

[3] WANG X,Lü X.Characterization of pectic polysaccharides extracted from apple pomace by hot-compressed water[J].Carbohydrate Polymers,2014,102:174-184.

[4] YANG X B,YANG S,GUO Y R,et al.Compositional characterisation of soluble apple polysaccharides,and their antioxidant and hepatoprotective effects on acute CCl4-caused liver damage in mice[J].Food Chemistry,2013,138(2/3):1256-1264.

[5] ZHANG X H,LIU L N,LIN C W.Isolation,structural characterization and antioxidant activity of a neutral polysaccharide fromSisalwaste[J].Food Hydrocolloids,2014,39:10-18.

[6] LAI L S,YANG D H.Rheological properties of the hot-water extracted polysaccharides in Ling-Zhi (Ganodermalucidum)[J].Food Hydrocolloids,2007,21(5/6):739-746.

[7] TSENG Y H,YANG J H,MAU J L.Antioxidant properties of polysaccharides fromGanodermatsugae[J].Food Chemistry,2008,107(2):732-738.

[8] LIU F,LIU W H,TIAN S G.Artificial neural network optimization ofAlthaearoseaseeds polysaccharides and its antioxidant activity[J].International Journal of Biological Macromolecules,2014,70:100-107.

[9] KLAUS A,KOZARSKI M,NIKSIC M,et al.Antioxidative activities and chemical characterization of polysaccharides extracted from the basidiomyceteSchizophyllumcommune[J].LWT-Food Science and Technology,2011,44(10):2005-2011.

[10] CHENG H R,FENG S L,SHEN S A,et al.Extraction,antioxidant and antimicrobial activities ofEpimediumacuminatumFranch.polysaccharide[J].Carbohydrate Polymers,2013,96(1):101-108.

[11] CHENG H R,FENG S L,JIA X J,et al.Structural characterization and antioxidant activities of polysaccharides extracted fromEpimediumacuminatum[J].Carbohydrate Polymers,2013,92(1):63-68.

[12] WANG Z B,PEI J J,MA H L,et al.Effect of extraction media on preliminary characterizations and antioxidant activities ofPhellinuslinteuspolysaccharides[J].Carbohydrate Polymers,2014,109:49-55.

[13] CHEN R Z,LI S Z,LIU C M,et al.Ultrasound complex enzymes assisted extraction and biochemical activities of polysaccharides fromEpimediumleaves[J].Process Biochemistry,2012,47(12):2040-2050.

[14] ZHU Z Y,PANG W,LI Y Y,et al.Effect of ultrasonic treatment on structure and antitumor activity of mycelial polysaccharides fromCordycepsgunnii[J].Carbohydrate Polymers,2014,114 :12-20.

[15] ZOU Y F,CHEN X F,YANG W Y,et al.Response surface methodology for optimization of the ultrasonic extraction of polysaccharides fromCodonopsispilosulaNannf. var.modestaL. T. Shen[J].Carbohydrate Polymers,2011,84(1):503-508.

[16] YAN Y L,YU C H,CHEN J,et al.Ultrasonic-assisted extraction optimized by response surface methodology,chemical composition and antioxidant activity of polysaccharides fromTremellamesenterica[J].Carbohydrate Polymers,2011,83(1):217-224.

[17] YIN X L,YOU Q H,JIANG Z H.Optimization of enzyme assisted extraction of polysaccharides fromTricholomamatsutakeby response surface methodology[J].Carbohydrate Polymers,2011,86(3):1358-1364.

[18] ZHU Y,LI Q,MAO G H,et al.Optimization of enzyme-assisted extraction and characterization of polysaccharides fromHericiumerinaceus[J].Carbohydrate Polymers,2014,101:606-613.

[19] LI S N,HAN D D,ROW K H,et al.Optimization of enzymatic extraction of polysaccharides from some marine algae by response surface methodology[J].Korean Journal of Chemical Engineering,2012,29(5):650-656.

[20] WANG S P,DONG X F,TONG J M.Optimization of enzyme-assisted extraction of polysaccharides from alfalfa and its antioxidant activity[J].International Journal of Biological Macromolecules,2013,62:387-396.

[21] CHEN H G,ZHOU X,ZHANG J Z.Optimization of enzyme assisted extraction of polysaccharides fromAstragalusmembranaceus[J].Carbohydrate Polymers,2014,111:567-575.

[22] ZHANG J,JIA S Y,LIU Y,et al.Optimization of enzyme-assisted extraction of theLyciumbarbarumpolysaccharides using response surface methodology[J].Carbohydrate Polymers,2011,86(2):1089-1092.

[23] ZHAO W Z,YU Z P,LIU J B,et al.Optimized extraction of polysaccharides from corn silk by pulsed electric field and response surface quadratic design[J].Journal of the Science of Food and Agriculture,2011,91(12):2201-2209.

[24] CHEN X P,CHEN Y,LI S B,et al.Free radical scavenging ofGanodermalucidumpolysaccharides and its effect on antioxidant enzymes and immunity activities in cervical carcinoma rats[J].Carbohydrate Polymers,2009,77(2):389-393.

[25] DOU J,MENG Y H,LIU L,et al.Purification,characterization and antioxidant activities of polysaccharides from thinned-young apple[J].International Journal of Biological Macromolecules,2015,72:31-40.

[26] MA L S,CHEN H X,ZHU W C,et al.Effect of different drying methods on physicochemical properties and antioxidant activities of polysaccharides extracted from mushroomInonotusobliquus[J].Food Research International,2013,50(2):633-640.

[27] LI J W,LIU Y F,FAN L P,et al.Antioxidant activities of polysaccharides from the fruiting bodies ofZizyphusJujubacv.Jinsixiaozao[J].Carbohydrate Polymers,2011,84(1):390-394.

[28] VOLPI N,TARUGI P.Influence of chondroitin sulfate charge density,sulfate group position,and molecular mass on Cu2+-mediated oxidation of human low-density lipoproteins: effect of normal human plasma-derived chondroitin sulfate[J].Journal of Biological Chemistry,1999,125(2):297-304.

[29] DE SOUZA M C R,MARQUES C T,DORE C M G,et al.Antioxidant activities of sulfated polysaccharides from brown and red seaweeds[J].Journal of Applied Phycology,2007,19(2):153-160.

[30] LEE J M,KWON H,JEONG H,et al.Inhibition of lipid peroxidation and oxidative DNA damage byGanodermalucidum[J].Phytotherapy Research,2001,15(3):245-249.

[31] 李志孝,黃成鋼,蔡育軍,等.天門冬多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)及體外抗氧化活性[J].藥學(xué)學(xué)報,2000,35(5):358-362.

[32] STADTMAN E R,BERLETT B S.Reactive oxygen-mediated protein oxidation in aging and disease[J].Chemical Research in Toxicology,1997,10(5):485-494.

[33] SUBRAMANIAN M,CHINTALWAR G J,CHATTOPADHYAY S.Antioxidant properties of aTinosporacordifoliapolysaccharide against iron-mediated lipid damage and γ-ray induced protein damage[J].Redox Report,2002,7(3):137-143.

[34] HALLIWELL B,GUTTERIDGE J M C.Free radicals in biology and medicine[M].New York:Oxford University Press,1998:105-107.

[35] DEAN R T,GIESEG S,DAVIES M J.Reactive species and their accumulation on radical damaged proteins[J].Trends in Biochemical Science,1993,18(11):437-441.

[36] ARUOMA O I.Free radicals,oxidative stress,and antioxidants in human health and disease[J].Journal of the American Oil Chemists’ Society,1998,75(2):199-212.

[37] VALKO M,IZAKOVIC M,MAZUR M,et al.Role of oxygen radicals in DNA damage and cancer incidence[J].Molecular and Cellular Biochemistry,2004,266(1/2):37-56.

[38] JIA D,RAO C G,XUE S X,et al.Purification,characterization and neuroprotective effects of a polysaccharide fromGynostemmapentaphyllum[J].Carbohydrate Polymers,2015,122:93-100.

[39] LI S P,ZHAO K J,JI Z N,et al.A polysaccharide isolated fromCordycepssinensis,a traditional Chinese medicine,protects PC12 cells against hydrogen peroxide-induced injury[J].Life Sciences,2003,73(19):2503-2513.

[40] TSAI M C,SONG T Y,SHIH P H,et al.Antioxidant properties of water-soluble polysaccharides fromAntrodiacinnamomeain submerged culture[J].Food Chemistry,2007,104(3):1115-1122.

[41] HASSAN S,EL-TWAB S A,HETTA M,et al.Improvement of lipid profile and antioxidant of hypercholesterolemic albino rats by polysaccharides extracted from the green algaUlvalactucaLinnaeus[J].Saudi Journal of Biological Sciences,2011,18(4):333-340.

[42] ZHAO S,RONG C B,LIU Y,et al.Extraction of a soluble polysaccharide fromAuriculariapolytricha and evaluation of its anti-hypercholesterolemic effect in rats[J].Carbohydrate Polymers,2015,122:39-45.

[43] MA M,LIU G H,YU Z H,et al.Effect of theLyciumbarbarumpolysaccharides administration on blood lipid metabolism and oxidative stress of mice fed high-fat diet in vivo[J].Food Chemistry,2009,113(4):872-877.

[44] 葛霞,陳婷婷,蔡教英,等.青錢柳多糖抗氧化活性的研究[J].中國食品學(xué)報,2011,11(5):59-64.

[45] QIAO D L,KE C L,HU B,et al.Antioxidant activities of polysaccharides fromHyriopsiscumingii[J].Carbohydrate Polymers,2009,78(2):199-204.

[46] KE C L,QIAO D L,GAN D,et al.Antioxidant acitivityinvitroandinvivoof the capsule polysaccharides fromStreptococcusequisubsp.zooepidemicus[J].Carbohydrate Polymers,2009,75(4):677-682.

[47] 黨月蘭.紅毛五加多糖對實驗性肝損傷的保護(hù)作用[J].中國中藥雜志,1997,22(3):176-178.

[48] LI X L,ZHOU A G.Preparation of polysaccharides fromAcanthopanaxsenticosusand its inhibition against irradiation-induced injury of rat[J].Carbohydrate Polymers,2007,67(2):219-226.

[49] WEI W S,TAN J Q,GUO F,et al.Effects ofCoriolusversicolorpolysaccharides on superoxide dismutase activities in mice[J].Acta Pharmacologica Sinica,1996,17(2):174-178.

[50] YU F R,LU S Q,YU F H,et al.Protective effects of polysaccharide from Euphorbia kansui (Euphorbiaceae) on the swimming exercise-induced oxidative stress in mice[J].Canadian Journal of Physiology and Pharmacology,2006,84(10):1071-1079.

[51] CHI A P,KANG C Z,ZHANG Y,et al.Immunomodulating and antioxidant effects of polysaccharide conjugates from the fruits ofZiziphusJujubeon Chronic Fatigue Syndrome rats[J].Carbohydrate Polymers,2015,122:189-196.

[52] JIANG C X,XIONG Q P,GAN D,et al.Antioxidant activity and potential hepatoprotective effect of polysaccharides fromCyclinasinensis[J].Carbohydrate Polymers,2013,91(1):262-268.

[53] 陳春英,丁玉強(qiáng),ELMAHADI E A,等.箬葉多糖對小鼠實驗性四氯化碳致肝損傷的作用[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,1996,10(3):237-238.

[54] 楊云,胡筱希,周凌凌,等.龍葵多糖對CCl4致急性肝損傷小鼠的保護(hù)作用研究[J].中成藥,2014,36(12):2602-2605.

[55] JOSEPHINE A,VEENA C K,AMUDHA G,et al.Evaluating the effect of sulphated polysaccharides on cyclosporine a induced oxidative renal injury[J].Molecular and Cellular Biochemistry,2006,287(1/2):101-108.

[56] JOSEPHINE A,NITHYA K,AMUDHA G,et al.Role of sulphated polysaccharides fromSargassumWightiiin Cyclosporine A-induced oxidative liver injury in rats[J].BMC Pharmacology,2008,8(1):4.

[57] LI X M.Protective effect ofLyciumbarbarumpolysaccharides on streptozotocin-induced oxidative stress in rats[J].International Journal of Biological Macromolecules,2007,40(5):461-465.

[58] JIA J,ZHANG X,HU Y S,et al.Evaluation of in vivo antioxidant activities ofGanodermalucidumpolysaccharides in STZ-diabetic rats[J].Food Chemistry,2009,115(1):32-36.

[59] DAVIES K J.Protein damage and degradation by oxygen radicals.Ⅰ.General aspects[J].The Journal of Biological Chemistry,1987,262(20):9895-9901.

[60] DAVIES K J,DELSIGNORE M E,LIN S W.Protein damage and degradation by oxygen radicals.Ⅱ.Modification of amino acids[J].The Journal of Biological Chemistry,1987,262(20):9902-9907.

[61] DAVIES K J,DELSIGNORE M E.Protein damage and degradation by oxygen radicals.Ⅲ.Modification of secondary and tertiary structure[J].The Journal of Biological Chemistry,1987,262(20):9908-9913.

[62] DAVIES K J,LIN S W,PACIFICI R E.Protein damage and degradation by oxygen radicals.Ⅳ.Degradation of denatured protein[J].The Journal of Biological Chemistry,1987,262(20):9914-9920.

[63] RICE-EVANS C,BURDON R.Free radical-lipid interactions and their pathological consequences[J].Progress in Lipid Research,1993,32(1):71-110.

[64] HALLIWELL B,GUTTERRIDGE J M C.Lipid peroxidation,oxygen radicals,cell damage,and antioxidant therapy[J].The Lancet,1984,323(8391):1396-1397.

[65] IMLAY J A,LINN S.DNA damage and oxygen radical toxicity[J].Science,1988,240(4857):1302-1309.

[66] COTGREAVE I A,MOLDEUS P,ORRENIUS S.Host biochemical defense mechanisms against prooxidants[J].Annual Review of Pharmacology and Toxicology,1988,28(1):189-212.

[67] ARUOMA O I.Characterization of drugs as antioxidant prophylactics[J].Free Radical Biology and Medicine,1996,20(5):675-705.

[68] BERRIDGE M J,LIPP P,BOOTMAN M D.Signal transduction.The calcium entry pas de deux[J].Science,2000,287(5458):1604-1605.

*Corresponding author, associate professor, E-mail: xiaofangd1124@sina.com

(責(zé)任編輯 武海龍)

Research Status and Progress of Extraction and Antioxidant Activity Evaluation Methods of Polysaccharides

LIU Song DONG Xiaofang*TONG Jianming

(Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China)

As one of the four essential substances that constitute the life activity, polysaccharides is closely related to the various physiological functions needed to maintain life. With the development of its research, the antioxidant activity of polysaccharides has become a research hotspot. In this paper, the research status and progress of extraction and antioxidant activity evaluation methods of polysaccharides were summarized which could be referenced in the extraction and antioxidant activities research of polysaccharides.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(11)：3391-3399]

polysaccharides; extraction; antioxidant activity evaluation

2016-04-20

“十二五”國家科技支撐計劃課題(2013BAD10B04)；國家蛋雞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項經(jīng)費(fèi)(CARS-41-K16)；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程(ASTIP-IAS08)

劉 松(1991—)，男，山東日照人，碩士研究生，從事蛋雞營養(yǎng)與飼料添加劑研究。E-mail: liusong7@yeah.net

*通信作者：董曉芳，副研究員，碩士生導(dǎo)師，E-mail: xiaofangd1124@sina.com

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.11.004

S852.2

A

1006-267X(2016)11-3391-09