星點(diǎn)設(shè)計(jì)—效應(yīng)面法優(yōu)化蒼艾油包合物—鼻用溫敏原位凝膠制備工藝

黃秋艷 熊磊 汪紅梅 陳柏君 馬云淑 孔淑君 王輝

摘要：目的 采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化蒼艾油包合物-鼻用溫敏原位凝膠的制備工藝。方法 以泊洛沙姆407、泊洛沙姆188用量為考察因素，膠凝溫度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用二次多項(xiàng)式模型描述評(píng)價(jià)指標(biāo)與2個(gè)因素之間的數(shù)學(xué)關(guān)系，以此確定優(yōu)化處方，并加以驗(yàn)證。結(jié)果 根據(jù)二次多項(xiàng)式模型，發(fā)現(xiàn)2個(gè)考察因素與評(píng)價(jià)指標(biāo)之間存在可信的定量關(guān)系，其中泊洛沙姆407、泊洛沙姆188的最佳用量分別為19.37%、2.73%。結(jié)論 采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法得到了基于二次多項(xiàng)式的蒼艾油包合物-鼻用溫敏原位凝膠處方最優(yōu)模型，處方工藝穩(wěn)定可行，實(shí)現(xiàn)了該原位凝膠的處方優(yōu)化。

關(guān)鍵詞：蒼艾揮發(fā)油；包合物；鼻用溫敏原位凝膠；星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.11.021

中圖分類號(hào)：R283.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）11-0086-04

Abstract： Objective To optimize the preparation technology of Cangai volatile oil dextrin inclusion compound/ in situ nasal thermosensitive gel by the central composite design-response surface method. Methods In the design， the investigation factors were the amounts of poloxamer 407 and poloxamer 188， and the evaluation index was the gel temperature. Quadratic models were used to evaluate the mathematic relation between the evaluation index and two investigation indexes to identify the optimum prescription， and then the optimum prescription was verified. Results According to the quadratic models， it was found that there was reliable quantitative relation between the evaluation index and two investigation indexes， among which the optimum dosage was 19.37% for poloxamer 407 and 2.73% for poloxamer 188. Conclusion The optimum model of Cangai volatile oil dextrin inclusion compound/ nasal thermosensitive gel can be obtained from central composite design-response surface method based on quadratic models. This method is reliable and feasible， which can realize the prescription optimization of the in situ gel.

Key words： Cangai volatile oil； dextrin inclusion compound； in situ nasal thermosensitive gel； central composite design-response surface method

蒼艾揮發(fā)油系以熊磊教授預(yù)防上呼吸道感染的臨床效驗(yàn)方為基礎(chǔ)，選用含揮發(fā)油成分較多、氣味清香、抗菌譜廣、抗菌能力強(qiáng)并有一定增強(qiáng)免疫作用的中藥組方[1]。臨床采用鼻腔吸入給藥方式，主要用于肺氣虛證的治療。根據(jù)揮發(fā)油的性質(zhì)及給藥方式的特點(diǎn)，本試驗(yàn)先將其制備成羥丙基-β-環(huán)糊精包合物，以降低其揮發(fā)性，減小刺激性、提高溶解度及穩(wěn)定性。此外，綜合歸納影響鼻腔吸收的因素，為保證其在鼻腔吸收完全，將包合物進(jìn)一步制備成鼻溫敏凝膠（在鼻腔內(nèi)成為半固體狀態(tài)），即能以溶液狀態(tài)給藥后，在鼻腔發(fā)生相轉(zhuǎn)變而形成凝膠[2]，增強(qiáng)了與鼻黏膜的親和力，減少藥物流失，延長藥物的滯留時(shí)間，增加藥物吸收，提高了生物利用度。不僅可以避開肝臟的首過效應(yīng)直接進(jìn)入血液循環(huán)，而且可繞過血腦屏障，直接靶向到腦組織。本試驗(yàn)采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面優(yōu)化法[3]，以蒼艾油中主要成分丁香酚為模型藥物，確定鼻用溫敏原位凝膠的最優(yōu)處方。

1 儀器與試藥

安捷倫1100高效液相色譜儀系統(tǒng)，二極管陣列檢測(cè)器（DAD）；HJ-4B型數(shù)顯恒溫多頭磁力加熱攪拌器（常州國華電器有限公司）；Sartorius BT25S分析天平（賽多利斯儀器有限公司）；DZFZ-6020真空干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；SK3300超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；RCZ-1A溶出試驗(yàn)儀（上海黃海藥檢儀器有限公司）；Elma超聲儀（型號(hào)P180H）；STARTER3100型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)（上海奧豪斯儀器有限公司）。

泊洛沙姆407（P407，Pluronic F-127，德國BASF公司，批號(hào)50011254），泊洛沙姆188（P188，Pluronic F-68，德國BASF公司，批號(hào)50011388），丁香酚（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)110725-201213），羥丙基-β-環(huán)糊精（TCI化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號(hào)CAS 128446-35-5），娃哈哈純凈水，色譜級(jí)甲醇，其他試劑與試藥均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溫敏型空白原位凝膠的制備

精密量取所需純化水，置冰水浴中，放在磁力攪拌器上，邊攪拌邊緩緩加入準(zhǔn)確稱量的P407和P188，分散均勻后，放入4 ℃冰箱中，直至充分溶脹，得澄清透明的空白原位凝膠。

2.2 蒼艾油包合物-溫敏原位凝膠的制備

精密稱取一定量蒼艾油包合物粉末，以適量純水溶解，緩緩滴加到正在攪拌的空白原位凝膠中，即得。

2.3 攪拌子法測(cè)定膠凝溫度

取儲(chǔ)存于冰箱中不同濃度的泊洛沙姆凝膠液于西林瓶中，插入溫度計(jì)，置于可加熱的磁力攪拌器上，以1 ℃/min緩慢升溫，磁力攪拌子完全停止轉(zhuǎn)動(dòng)的溫度即膠凝溫度（Tgel），平行測(cè)定3次，取平均值。

2.4 泊洛沙姆407和泊洛沙姆188含量范圍的確定

按“2.1”項(xiàng)下方法，分別制備15%、20%、25%、30% P407溶液及25%、30%、35%、40% P188溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定，結(jié)果見圖1。

經(jīng)初步考察，確定P407和P188的含量范圍分別為15%～25%和0%～15%。

2.5 處方優(yōu)化與評(píng)價(jià)

分別制備不同濃度的P407和P188空白凝膠，觀察濃度與Tgel的關(guān)系，根據(jù)初步考察結(jié)果，采用P407百分含量（X1）和P188百分含量（X2）作為考察因素，確定其范圍。根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)的原理，每因素設(shè)置5個(gè)水平，用代碼值±α、±1、0來表示，對(duì)于二因素的星點(diǎn)設(shè)計(jì)α=1.414。因素水平見表1。利用Design-Expert8.0.6軟件對(duì)各影響因素及評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行二次多項(xiàng)式的數(shù)學(xué)模型擬合。試驗(yàn)安排及結(jié)果見表2，回歸模型校驗(yàn)結(jié)果見表3。

以P407和P188百分含量為自變量，Tgel為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸，以擬合優(yōu)度（R2）及置信度（P）作為模型判定標(biāo)準(zhǔn)?；貧w方程為：Tgel=133.417 45-7.695 01X1+1.350 23X2-0.110 67X1X2+0.135 68X12+0.118 08X22（R2=0.990 5，P<0.000 1）。由模型方差分析可以看出，總模型方程高度顯著，模型的擬合情況良好，回歸方程的代表性較好，能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)實(shí)際情況。其校正決定系數(shù)（Radj）為0.983 7，表明此模型能解釋98.37%效應(yīng)值變化，因此該模型擬合程度良好，誤差較小，僅有約2%不能由此模型進(jìn)行解釋，因此該模型是適合的，可以用此模型對(duì)Tgel進(jìn)行分析與預(yù)測(cè)。由此可得P407與P188交互作用的響應(yīng)面圖（見圖2）。最終由軟件分析得到最優(yōu)處方：P407為19.37%，P188為2.73%。

3 制劑學(xué)評(píng)價(jià)

3.1 體外釋放度試驗(yàn)

3.1.1 色譜條件 Agilent C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；流動(dòng)相：甲醇-水（65∶35）；檢測(cè)波長：280 nm；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 ?L。

3.1.2 線性關(guān)系考察 精密稱取丁香酚對(duì)照品適量于棕色容量瓶中，加甲醇混勻，制成一定濃度的母液備用。分別吸取丁香酚儲(chǔ)備液適量，加甲醇稀釋成0.04、0.08、0.12、0.16、0.24、0.4、0.8、1.2 mg/mL系列濃度。按“3.1.1”項(xiàng)下色譜條件，各進(jìn)樣10 μL分析。以峰面積積分值為縱坐標(biāo)、對(duì)照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=0.926 2X-13.989（r2=0.999 9），結(jié)果表明，丁香酚進(jìn)樣量在0.08～2.4 μg范圍內(nèi)，與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

3.1.3 專屬性考察 取丁香酚對(duì)照品溶液、凝膠釋放溶液、空白凝膠溶液適量，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，在該色譜條件下，峰形及分離度均良好，見圖3。

3.1.4 實(shí)驗(yàn)方法 按最優(yōu)處方制備3批蒼艾油包合物-鼻用溫敏原位凝膠，對(duì)其進(jìn)行體外釋放度試驗(yàn)考察。即按照釋放度測(cè)定法（2010年版《中華人民共和國藥典》二部附錄ⅩD第三法），精密稱取蒼艾油包合物-鼻用溫敏原位凝膠5 g（含蒼艾油1.205 ?g），放入處理好的透析袋中，將袋兩端扎緊。以200 mL人工鼻液[3]（精密稱取磷酸二氫鉀13.6 g，加去離子水1 L溶解，用0.1 mol/L溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8）為釋放介質(zhì)，轉(zhuǎn)速150 r/min，溫度（37±1）℃，依法操作，于0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、30 h分別移取5 mL釋放液經(jīng)0.45 ?m濾膜過濾備用，并及時(shí)補(bǔ)充同溫度的釋放介質(zhì)5 mL，采用HPLC測(cè)定溶出液中的藥物濃度，計(jì)算累積釋放百分率（Q）。以體外累積釋放率（%）為縱坐標(biāo)，取樣時(shí)間（h）為橫縱標(biāo)，繪制釋放曲線。按“3.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，所得3批蒼艾油包合物-鼻用溫敏原位凝膠累積釋放度見表4、圖4、圖5。將所得到的釋放曲線進(jìn)行零級(jí)釋放、一級(jí)釋放及Higuchi方程模型擬合，結(jié)果見表5?？梢?，其方程與一級(jí)釋放模型擬合相關(guān)性最好。

3.2 均一性考察

分別取25 ℃及34 ℃下放置2周的蒼艾油包合物-鼻用溫敏原位凝膠適量，2500 r/min離心15 min，觀察是否出現(xiàn)分層現(xiàn)象。結(jié)果表明二者離心后未見分層，且外觀透明、均一。

3.3 pH值測(cè)定

取34 ℃下蒼艾油包合物-鼻用溫敏原位凝膠適量于燒杯中，用實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定，多次測(cè)量得到該凝膠劑的平均pH值為6.91。鼻用制劑的pH值應(yīng)在5.5～7.5之間[4]，故本制劑符合要求。

3.4 膠凝溫度測(cè)定

取“3.1.2”項(xiàng)下3批蒼艾油包合物-鼻用溫敏原位凝膠，按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行膠凝溫度測(cè)定，結(jié)果見表6。

4 討論

本研究利用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法得到了蒼艾油包合物-鼻用溫敏原位凝膠的最優(yōu)處方，且驗(yàn)證試驗(yàn)表明，按照最優(yōu)處方制備的原位凝膠在34 ℃即從溶液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榘牍腆w狀態(tài)。從體外釋放曲線可以看出，制備的凝膠在24 h左右釋放了約90%的藥量，通過3種模型擬合后，發(fā)現(xiàn)其釋藥過程符合一級(jí)釋藥模型，具有一定程度的緩釋作用。此外，其他制劑學(xué)評(píng)價(jià)（包括對(duì)均一性、pH值的考察）表明，該制劑符合鼻用凝膠劑的要求。實(shí)驗(yàn)操作中，為減少誤差的產(chǎn)生，在制備凝膠時(shí)，應(yīng)盡量控制于同一臺(tái)磁力攪拌器上，采用同一型號(hào)、尺寸一致的轉(zhuǎn)子，相同的轉(zhuǎn)速以及同一規(guī)格的具塞三角瓶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。此外，與制備空白凝膠時(shí)不同，制備含藥凝膠時(shí)，在相同處方條件下，隨著藥物加入量的增加，膠凝溫度會(huì)隨之升高?？赡苁怯糜谥苽淠z的包合物粉末存放時(shí)間過久，以致出現(xiàn)藥物（揮發(fā)油）“泛出”，后加入到空白凝膠中，由于溫度的改變，使溶解度發(fā)生變化，從而整個(gè)體系的Tgel升高。在綜合考慮膠凝溫度及黏度后，確定了最優(yōu)處方：P407為19.37%，P188為2.73%。

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