當歸揮發(fā)油對高血壓模型大鼠血壓及血管炎癥反應的影響

劉倍吟 魏程科 李應東

摘要：目的 觀察當歸揮發(fā)油對高血壓模型大鼠血壓和相關炎癥因子的影響，探討其降壓的作用機制。方法 采用N-硝基-L-精氨酸灌胃建立高血壓大鼠模型。實驗大鼠隨機分為正常組、模型組、陽性藥組和當歸揮發(fā)油高、低劑量組，每組5只。各給藥組給予相應藥物灌胃，連續(xù)8周。采用無創(chuàng)血壓檢測系統(tǒng)檢測給藥前后大鼠尾動脈收縮壓；ELISA檢測大鼠血清內(nèi)皮素-1（ET-1）、血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）、超敏C反應蛋白（CRP）水平；實時熒光定量PCR檢測心臟組織CRP mRNA表達。結果 與正常組比較，模型組收縮壓、ET-1、VCAM-1、CRP水平及其mRNA表達明顯升高（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，各給藥組ET-1、VCAM-1、CRP水平及其mRNA表達明顯降低（P<0.05，P<0.01）。結論 當歸揮發(fā)油可能通過抑制血管炎癥反應起到降壓作用。

關鍵詞：當歸揮發(fā)油；高血壓；炎癥細胞因子；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.11.017

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）11-0071-04

Abstract： Objective To observe the effects of volatile oil of Angelicae Sinensis Radix on blood pressure and related inflammatory cytokines of hypertensive rat models； To investigate the action mechanism of regulating the blood pressure. Methods Wistar male rats were fed with L-NNA to establish hypertensive rat models. Hypertensive rats were randomly divided into normal control group， model group， positive medicine group， volatile oil of Angelicae Sinensis Radix high- and low-dose groups， with 5 rats in each group. Each medication group was given relative medicine for gavage for 8 weeks. Non-invasive blood pressure measurement system was used to observe the systolic pressure of tail artery of rats before and after medication； the levels of ET-1， CRP， and VCAM-1 in serum were detected by the method of ELISA； RT-PCR was used to measure CRP mRNA of heart. Results The levels of systolic blood pressure， ET-1， VCAM-1， CRP and CRP mRNA in model group were significantly higher than those of normal group （P<0.05， P<0.01）； Compared with model group， the levels of ET-1， VCAM-1， CRP and CRP mRNA in model group significantly decreased （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Volatile oil of Angelicae Sinensis Radix can inhibit vascular inflammatory response and then realize the effects of regulating blood pressure.

Key words： volatile oil of Angelicae Sinensis Radix； hypertension； inflammatory cytokines； rats

血管內(nèi)皮功能障礙是高血壓的重要病理機制，其與血管炎癥反應密切相關[1]。已有研究表明，當歸具有減輕炎癥反應、抗氧化、抗血小板凝集、延緩衰老、增強免疫力等藥理作用[2]。當歸揮發(fā)油是當歸的脂溶性成分，主要含有藁本內(nèi)酯、丁烯基苯酞等，可降低兔胸主動脈平滑肌的張力、擴張血管[3]，減輕炎癥反應[4]，而對高血壓發(fā)病過程中血管內(nèi)皮功能及血管炎癥反應的作用，目前尚未見相關報道。據(jù)此，我們采用N-硝基-L-精氨酸（L-NNA）灌胃建立高血壓大鼠模型，觀察當歸揮發(fā)油對大鼠血清內(nèi)皮素-1（ET-1）、血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）、超敏C反應蛋白（CRP）水平及其mRNA表達的影響，揭示其對血壓和炎癥因子的干預作用，探討其降壓的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

雄性13周齡Wistar大鼠30只，體質(zhì)量（240±20）g，SPF級，甘肅中醫(yī)藥大學動物實驗中心，許可證號SCXK（甘）2011-0001。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學SPF級實驗室，室溫（23±2）℃、濕度45%～55%，自由飲水進食。

1.2 藥物

當歸揮發(fā)油（含藁本內(nèi)酯>75%），甘肅岷縣康達藥業(yè)開發(fā)有限責任公司，超臨界CO2萃取，1%吐溫-80助溶，加蒸餾水配成所需濃度；卡托普利片，上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號141005；L-NNA，上海源葉生物有限公司，批號YY10014-100g。

1.3 主要試劑與儀器

ET-1、CRP、VCAM-1 ELISA試劑盒，上海源葉生物科技有限公司；Trizol RNA提取試劑，Invitrogen公司；Reverse Transcription System、qPCR Master Mix試劑盒，Promega公司；TMC203型BP-98A動物無創(chuàng)血壓測定系統(tǒng)，日本東芝公司；多功能酶標儀，瑞士Tecan Infinite；超微量紫外可見分光光度計，美國Quawell；Sorvall Fresco低溫高速離心機，美國索福公司；實時熒光定量PCR儀，美國BIO-RAD公司；JY600電泳儀，北京君意東方電子設備有限公司；Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)，美國BIO-RAD公司。

2 實驗方法

2.1 造模

30只雄性Wistar大鼠適應性飼養(yǎng)7 d，于第6日14：00測定收縮壓，每只大鼠測量3次，取平均值。隨機取5只大鼠作為正常對照組，其余25只大鼠第7日10：00每日灌胃L-NNA 490 mg/kg，連續(xù)28 d，于第7、14、21、28日14：00測量收縮壓，每只大鼠測量3次，取平均值，以平均收縮壓≥180 mm Hg為造模成功標準。停藥后正常飼養(yǎng)5 d，14：00測定收縮壓，每只大鼠測量3次，取其平均值，結果20只大鼠造模成功。

2.2 分組及給藥

造模前隨機選取5只Wistar大鼠作為正常組；造模后將成模大鼠按體質(zhì)量、收縮壓分為模型組、陽性藥組、當歸揮發(fā)油高劑量組（中藥高劑量組）、當歸揮發(fā)油低劑量組（中藥低劑量組），每組5只。陽性藥組每日予卡托普利藥液25 mg/kg灌胃，相當于臨床成人日用量的10倍；中藥高劑量組每日予含當歸揮發(fā)油10%當歸揮發(fā)油乳劑15 mL/kg灌胃，相當于成人日用當歸原藥材30 g的20倍；中藥低劑量組每日予含當歸揮發(fā)油5%當歸揮發(fā)油乳劑15 mL/kg灌胃，相當于成人日用當歸原藥材30 g的10倍；模型組和正常組予等容量生理鹽水灌胃。每日1次，連續(xù)8周。

2.3 大鼠血壓觀察

用BP-98A動物無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)測定安靜狀態(tài)下大鼠尾動脈收縮壓，于給藥第0、5、15、25、35、45、55、60日14：00測量血壓，每只大鼠測量3次，取其平均值。

2.4 標本采集

第61日乙醚麻醉大鼠，腹主動脈取血10 mL，靜置30 min，4000 r/min離心10 min，分離血清；取心臟組織，液氮冷凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 ELISA檢測血清內(nèi)皮素-1、血管細胞黏附分子-1、超敏C反應蛋白水平

按試劑盒說明設置標準品孔和樣本孔，每組3個復孔，標準品稀釋成5個梯度（濃度為0的標準品S0號視為空白孔），每孔50 μL；樣本孔先加待測樣本10 μL，后加樣本稀釋液40 μL；除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶標記的檢測抗體100 μL，封板膜封住反應孔，37 ℃水浴60 min；棄液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次；每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min；每孔加入終止液50 μL，15 min內(nèi)，于450 nm波長處測定各孔OD值。以標準品濃度為橫坐標，對應OD值為縱坐標，繪制標準曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值，各樣本濃度×5即為樣本實際濃度。

2.6 RT-PCR檢測心臟組織超敏C反應蛋白基因表達

2.6.1 提取總RNA 稱取心臟組織1.8 g，置于4 mL無酶EP管內(nèi)，各加1.5 mL預冷PBS，用組織勻漿器勻漿；4 ℃、3000 r/min離心10 min，棄上清液；各加1 mL Trizol，混勻；轉(zhuǎn)移到1.5 mL無菌管中，冰上靜置5 min；各加0.2 mL氯仿，劇烈振蕩15 s，冰上靜置2 min，4 ℃、13 500 r/min離心15 min，取上清液至新的離心管中；各加入等體積異丙醇，輕輕混勻，冰上靜置10 min，4 ℃、13 500 r/min 離心10 min，棄上清液；向沉淀中緩慢輕輕加入-20 ℃預冷的75%乙醇1 mL，小心清洗沉淀；4 ℃、13 500 r/min離心10 min；棄上清液，室溫干燥5 min，各加40 μL 1‰DEPC水溶解沉淀；紫外分光光度法測定總RNA，用1‰DEPC水調(diào)整總RNA至相同濃度500 ng/μL。

2.6.2 cDNA反轉(zhuǎn)錄 冰上配制10 μL反轉(zhuǎn)錄反應體系[2 μL MgCl2，2 μL 5×Reaction Buffer，1 μL PCR Nucleotide Mix，0.25 μL Oligo（dT）15 Primer，0.5 μL Go Script Reverse Transcriptase，0.25 μL Ribonuclease Inhibitor，3 μL RNase Free Water，1 μL總RNA樣本]，反應條件：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃、60 min；CRP反應引物、GAPDH內(nèi)參基因由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，見表1。

2.6.3 RT-PCR擴增 冰上配制20 μL PCR反應體系[12.5 μL qPCR Master Mix，0.25 μL CxR Reference Dye，4.25 μL Nuclease-Free Water，2 μL引物，1 μL模板DNA]，反應條件：94 ℃、2 min，94 ℃、30 s，58 ℃、30 s，72 ℃、1 min，72 ℃、5 min，35個循環(huán)，4 ℃保存。反應及數(shù)據(jù)采集在CFX-96系統(tǒng)上進行，記錄CRP與內(nèi)參基因GAPDH達到熒光設定值所需循環(huán)數(shù)（Ct值），每個樣品中CRP的相對mRNA表達采用2-ΔΔCt法計算。

2.6.4 瓊脂糖凝膠電泳 1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用Bio-Rad Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)分析，確認目的片段是否表達。

3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 結果

4.1 當歸揮發(fā)油對模型大鼠血壓的影響

與正常組比較，模型組大鼠收縮壓明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組相關時點收縮壓明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）。結果見表2。

4.2 當歸揮發(fā)油對模型大鼠血清內(nèi)皮素-1、血管細胞黏附分子-1及超敏C反應水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清ET-1、VCAM-1及CRP水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清ET-1、VCAM-1及CRP水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結果見表3。

4.3 當歸揮發(fā)油對模型大鼠心臟組織超敏C反應蛋白基因表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠心臟組織CRP mRNA表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組CRP mRNA表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）。結果見表4、圖1。

5 討論

高血壓是慢性血管炎癥反應性疾病，血管功能障礙是高血壓的重要病理特征。研究表明，在高血壓發(fā)展過程中，循環(huán)系統(tǒng)促炎癥細胞因子增多，血管炎癥反應與血管功能障礙密切相關[5]。本實驗結果表明，給予L-NNA后，抑制一氧化氮（NO）合成，使血管內(nèi)皮收縮，增加血管張力，血壓升高，持續(xù)性引起NO合成減少，則會導致血壓持續(xù)升高。因此，本實驗選擇L-NNA建立高血壓模型。

CRP觸發(fā)炎癥反應，可以誘導大鼠血管平滑肌細胞分泌腫瘤壞死因子-α，并且受P38MAPK-Toll樣受體4（TLR4）信號通路調(diào)控。炎癥因子產(chǎn)生增多，可以破壞內(nèi)皮功能，引起收縮性因子分泌增多，同時血管內(nèi)皮功能紊亂后又可活化巨噬細胞表面TLR4，進一步激活核因子-κB使炎癥因子增多。因此，高血壓血管內(nèi)皮損傷與炎癥反應相互影響。通過干預炎癥反應，可以減輕炎性因子對高血壓患者帶來的負效應。

VCAM-1屬于免疫球蛋白超家族，在炎癥反應、腫瘤發(fā)展及免疫損傷時，VCAM-1表達增多，介導炎癥反應[6]。

綜上所述，本實驗探討當歸揮發(fā)油對高血壓模型大鼠血壓的影響，結果顯示當歸揮發(fā)油可以降低血壓，降低模型大鼠血清ET-1、CRP、VCAM-1的表達，RT-PCR結果顯示，CRP mRNA表達給藥后下調(diào)，進一步明確當歸揮發(fā)油可以降低高血壓炎癥因子的表達，抑制血管炎癥反應，這可能是其降壓的潛在機制，其具體機制還有待進一步研究。

參考文獻：

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