沈撫灌渠中好氧型石油降解細菌分離純化及降解能力檢測

任春英, 王海勝, 卜 寧, 趙洪新,3,4

(1. 沈陽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 沈陽 100034; 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 研究生院, 北京 100081;3. 浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 杭州 310018; 4. 浙江省植物次生代謝重點實驗室, 杭州 310018)

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沈撫灌渠中好氧型石油降解細菌分離純化及降解能力檢測

任春英1,2, 王海勝2, 卜 寧1, 趙洪新1,3,4

(1. 沈陽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 沈陽 100034; 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 研究生院, 北京 100081;3. 浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 杭州 310018; 4. 浙江省植物次生代謝重點實驗室, 杭州 310018)

分離和純化環(huán)境中的石油降解菌,開發(fā)其降解石油的功能,用于石油污染地土壤的環(huán)境治理,是不會帶來二次污染的生物清除石油污染方法之一,對石油污染環(huán)境的生態(tài)治理具有重要意義。流過各種工業(yè)廢水的沈撫灌渠環(huán)境中,富集著大量具有降解各種污染物的微生物。從流經(jīng)撫順石油井區(qū)的灌區(qū)水底泥中取樣,在無機鹽培養(yǎng)基中,以添加1%的原油為唯一碳源,分離得到5株以石油為唯一碳源的細菌,石油降解率分析表明,5株菌都具有一定的石油降解能力,其石油降解率依次為:sf-5>sf-4>sf-1>sf-3>sf-2,特別是sf-5菌株在培養(yǎng)15 d時的石油降解活性最高,是一株極具開發(fā)潛力的石油降解菌。

石油降解菌; 石油降解率; 生理生化; 沈撫灌渠

0 引 言

沈撫灌渠始建于1965年,目的是解決沈陽和撫順二市的工業(yè)廢水對渾河的污染,凈化渾河水質(zhì),并充分利用污水灌溉農(nóng)田。開通時接納的是生活污水和少量工業(yè)廢水,其中工業(yè)廢水主要是石化工業(yè)廢水,其中含有氨、氮等物質(zhì),有利于植物生長,但是隨著工業(yè)的迅猛發(fā)展和人口的急劇增加,沈撫灌渠還承接了來自撫順石化公司和撫順特殊鋼股份有限公司等石化、冶金17家企業(yè)的工業(yè)廢水,污染成分急劇增多,種類復(fù)雜,達幾十種,主要有石油類、揮發(fā)酚、硫化物和氰化物等,而且嚴重超標[1-3]。特別是石油污染物,結(jié)構(gòu)復(fù)雜不易降解,不僅對環(huán)境造成嚴重的污染,還直接危害到人類的生命健康和動植物的生存。

國外20世紀40年代就開始了對降解石油微生物的開發(fā)利用[4],而我國在這方面的研究,開始于20世紀70年代,起步較晚,且對石油降解微生物的基礎(chǔ)研究主要集中在微生物對原油和芳烴的降解效率[5],微生物對芳烴物質(zhì)的降解機理[6]以及利用降解微生物對石油污染的土壤進行模擬性修復(fù)試驗上[7]。

上世紀,處理石油污染的方法主要是物理方法和化學(xué)方法,但在清除石油污染物時又帶來了二次污染,如焚燒石油會產(chǎn)生大量的有害氣體,導(dǎo)致污染進一步的擴散和轉(zhuǎn)移;化學(xué)修復(fù)劑的大量使用,不僅價格昂貴,更使得二次污染的情況更加凸顯。相比物理和化學(xué)清除石油污染的方法,微生物降解具有更大優(yōu)勢。一方面微生物資源豐富,能降解石油的微生物共有70個屬,其中細菌28個屬,絲狀真菌30個屬,酵母12個屬,共200多種微生物[8-10]。其次,污染物可以在原地被降解,對環(huán)境干擾較少,無二次污染[11]。

因此,該實驗從沈撫灌渠底泥中分離純化石油降解菌,利用土壤環(huán)境中微生物降解烴類的能力,以期將來用于清除沈撫灌區(qū)中的石油污染,改善沈撫灌渠的土壤環(huán)境條件,提供微生物資源。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基配方(1 L):牛肉膏3 g,蛋白胨10 g, NaCl 5 g,pH 7.3±0.1。

無機鹽培養(yǎng)基配方(1 L):NaCl 1%、MgSO4.7H2O 0.12 g、CaCl2.2H2O 0.061 g、NaHCO34.2 g、NH4Cl 0.85 g、K2HPO4 0.48 g, FeSO4.7H2O 0.021 g、N (CH2COOH)20.015 g、酵母粉 0.2～0.3 g、葡萄糖2 g。用5 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0,定容,高壓滅菌后添加1%的原油,磁力攪拌均勻后備用,固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和固體無機鹽培養(yǎng)基添加1.5～2.0%的瓊脂;葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基和乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、蒸餾水1 000 mL,1.6%溴鉀酚紫乙醇溶液(pH值7.6 )1～2 mL,每支試管5～10 mL培養(yǎng)基,另配制20%糖溶液(葡萄糖、乳糖、蔗糖等)各10 mL,121 ℃滅菌,用于糖發(fā)酵試驗;葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基:蛋白胨 5 g、葡糖糖5 g、磷酸氫二鉀2 g、蒸餾水1 000 mL,每支試管5～10 ml培養(yǎng)基,121 ℃滅菌,用于甲基紅和V.P實驗;明膠液化培養(yǎng)基:牛肉膏蛋白胨液100 mL、明膠12～18 g、pH值7.6,用于明膠液化試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 沈撫灌渠底泥的采集

用采集器取沈撫灌渠三寶屯段的底泥,置無菌紙袋中,于4 ℃冰箱保存,24 h內(nèi)取樣分菌。

1.2.2 污染土壤懸液的制備

取1 g底泥土壤樣品加入到裝有99 ml的無菌水的 250 mL錐形瓶中搖勻浸泡,25 ℃、120 r/min振蕩2 h制成土壤懸液(三角瓶中放入玻璃珠,充分懸浮土壤)后,再靜止沉淀2 h,取外觀為棕褐色液體的上清液作為菌源。

1.2.3 石油降解菌的富集培養(yǎng)

采用不斷提高原油濃度梯度的方法對菌株進行富集培養(yǎng)。37 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)7 d,反復(fù)移取10 mL富集后的菌液到含有原油的無機鹽培養(yǎng)基中。如此反復(fù)培養(yǎng)3次,待培養(yǎng)液混濁后,就可能得到以原油為唯一碳源的菌株。

1.2.4 石油降解菌株的形態(tài)學(xué)觀察

對已篩選得到的5株細菌分別進行單染色、革蘭氏染色、芽孢染色、鞭毛染色、莢膜染色等,觀察其形態(tài)、革蘭氏染色結(jié)果以及芽孢、鞭毛、莢膜的有無。

1.2.5 石油降解菌的生理生化反應(yīng)

各種微生物具有的酶系統(tǒng)不盡相同,對營養(yǎng)基質(zhì)的分解能力也不一樣,因此分解產(chǎn)物都或多或少的有區(qū)別,可以用來鑒別細菌。用生化試驗的方法檢測細菌對各種基質(zhì)的利用及其代謝產(chǎn)物,從而鑒別細菌的種屬。細菌的生理生化反應(yīng)在菌株的分類鑒定中有很大作用。將分離得到的5株細菌進行生理生化反應(yīng)鑒定[12]。

1.2.5.1 糖發(fā)酵試驗

取分別裝有葡萄糖和乳糖的發(fā)酵培養(yǎng)液試管各4支,以無菌操作分別接種少量菌苔至各相應(yīng)試管中,將裝有培養(yǎng)液的杜氏小管倒置放入試管中,置37 ℃恒溫箱中培養(yǎng),觀察結(jié)果。

與對照管比較,若接種培養(yǎng)液保持原有顏色,其反應(yīng)結(jié)果為陰性,表明該菌不能利用該種糖,記錄用“-”表示;如培養(yǎng)液呈黃色,反應(yīng)結(jié)果為陽性,表明該菌能分解該種糖產(chǎn)酸,記錄用“+”表示。培養(yǎng)液中的杜氏小管內(nèi)有氣泡為陽性反應(yīng),表明該菌分解糖能產(chǎn)酸并產(chǎn)氣,記錄用“+”表示;如杜氏小管內(nèi)沒有氣泡為陰性反應(yīng),記錄用“-”表示。

1.2.5.2 乙酰甲基甲醇試驗(V.P.試驗)

某些細菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)液中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸,丙酮酸縮合,脫羧成乙酰甲基甲醇,后者在強堿環(huán)境下,在空氣中被氧化為二乙酰,二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物,稱V.P.(+)反應(yīng)。

以無菌操作分別接種少量菌苔至以上相應(yīng)試管中,空白對照管不接菌,置37 ℃恒溫箱中,培養(yǎng)24～48 h。

取出以上試管,振蕩2 min。另取5支空試管相應(yīng)標記菌名,分別加入3～5 ml以上對應(yīng)管中的培養(yǎng)液,再加入40%NaOH溶液10～20滴,并用牙簽挑入約0.5～1 mg微量肌酸,振蕩試管,以使空氣中的氧溶入,置37 ℃恒溫箱中保溫15～30 min后。若培養(yǎng)液呈紅色,記錄為V-P試驗陽性反應(yīng)(用“+”表示);若不呈紅色,記錄為V-P試驗陰性反應(yīng)(用“-”表示)。

1.2.5.3 甲基紅試驗(M.R.試驗)

腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖,在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸,進一步分解中,由于糖代謝的途徑不同,可產(chǎn)生乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物,可使培養(yǎng)基pH值下降至pH值4.5以下,使甲基紅指示劑變紅。

將V.P.試驗留下的培養(yǎng)液中,各加入2～3滴甲基紅指示劑,注意沿管壁加入,仔細觀察培養(yǎng)液上層,若培養(yǎng)液上層變成紅色,即為陽性反應(yīng);若仍呈黃色,則為陰性反應(yīng),分別用“+”或“-”表示。

1.2.5.4 硫化氫試驗

某些細菌能分解含硫的氨基酸,產(chǎn)生硫化氫,硫化氫與培養(yǎng)基中的鐵鹽反應(yīng),形成黑色的硫化鐵沉淀,為硫化氫試驗陽性。

1.2.5.5 明膠液化實驗

明膠在25 ℃以下可維持凝膠狀態(tài),以固體狀態(tài)存在,而在25 ℃以上時明膠就會液化。有些微生物可產(chǎn)生一種成為明膠酶的胞外酶,水解這種蛋白質(zhì),而使明膠液化,甚至在4 ℃仍能保持液化狀態(tài)。

將被檢菌穿刺接種于明膠培養(yǎng)基,于20 ℃培養(yǎng)7 d,逐日觀察明膠液化現(xiàn)象。如室溫高,培養(yǎng)基自行溶化時,可與冰箱內(nèi)放置30 min,然后取出觀察結(jié)果,不再凝固時為陽性。

1.2.6 石油降解率的測定

采用紫外分光光度計法[13]。將篩選到的菌種接種于牛肉膏蛋白胨水培養(yǎng)基上培養(yǎng)1～2 d后,加少量無菌水制成菌懸液,接種于帶有無機鹽及石油的培養(yǎng)基中,于37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)。分別測定0 d、5 d、10 d、15 d的OD600值,以不加菌的含油培養(yǎng)基為對照,每一組為3次重復(fù)。

石油降解率=(對照吸光度-培養(yǎng)液吸光度)/對照吸光度×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 石油降解菌的分離結(jié)果

經(jīng)過瓊脂營養(yǎng)培養(yǎng)的富集培養(yǎng)和無機鹽培養(yǎng)基的篩選純化后,共分離純化得到5株細菌,分別命名為sf-1、sf-2、sf-3、sf-4、sf-5,并進行了一系列的生理生化實驗及石油降解率的測定。

2.2 石油降解菌的形態(tài)觀察鑒定

在電子顯微鏡下對5株石油降解菌進行初步的形態(tài)觀察鑒定,其結(jié)果見表1。

表1 菌株的形態(tài)觀察鑒定

2.3 石油降解菌的生理生化反應(yīng)結(jié)果

5株石油降解菌的生理生化反應(yīng)結(jié)果見表2。

表2 5株菌株的生理生化特性

其中包含3株革蘭氏陽性菌;2株革蘭氏陰性菌,其中革蘭氏陰性菌sf-1能利用葡萄糖和乳糖,并產(chǎn)生一種胞外酶分解明膠使明膠液化,與含硫氨基酸發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生氣體。

2.4 石油降解菌的降解活性

土壤底泥分離出的5株細菌均能在不同程度上降解原油,降解率隨培養(yǎng)時間增加不斷提高,但是菌株的生長受到限制,反而有衰退的趨勢,原因可能是石油的存在限制了菌株的生長甚至是對菌株本身有一定的傷害,其次是私有分解過程中產(chǎn)生的某些物質(zhì)是細菌所不能利用的,致使菌株不聲張反而有死亡的跡象。由表4可以看出sf-5菌株在培養(yǎng)15 d時的石油降解活性最高,其他依次為sf-4菌株、sf-1菌株、sf-3菌株、sf-2菌株,說明分離的菌株具有一定的石油降解的能力。

表3 5株菌株的石油降解活性

表4 5株菌株的石油降解率

3 結(jié) 論

沈撫污灌渠底泥中存在著一些土著的石油降解菌株,在實驗室條件下通過富集培養(yǎng)和分離純化,共篩選出5株菌株且分離的5株菌均為細菌,其中1種為球菌,其余4種為桿菌。石油降解率測定表明,5株細菌,均具有石油降解能力,但降解能力明顯存在差異,降解效果依次為sf-5、Sf-4、sf-1、sf-3和sf-2。sf-5菌株的降解效果最為明顯,降解率達48.2%。所以,sf5是一株極具開發(fā)利用價值的石油降解菌。

盡管分離出的菌株具有清除石油污染的能力,但污染物的復(fù)雜性及污染環(huán)境的不確定性,與實驗室條件下的降解能力可能存在差異。實驗室的條件較單一且易控制,而菌株作用的土壤環(huán)境確是復(fù)雜多變且不可控制的,所以,降解菌株對于石油的降解能力,還必須在自然環(huán)境條件下進行馴化,才能發(fā)揮其降解能力,達到更好的清除污染效果。下一步的實驗就是模擬自然環(huán)境的條件,檢測微生物降解石油的能力,為能否用于土壤修復(fù)做進一步的評估。

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The separation and purification of aerobic type oil degradation bacteria and degradation ability of detection in Shen Fu irrigation system

RENChunying1,2,WANGHaisheng2,BUNing1,ZHAOHongxin1,3

(1. College of Life Science, Shenyang Normal University, Shenyang 100034, China; 2. Plant Protection Environmental Protection Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100097, China; 3. College of Life and Science, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China; 4. Key Laboratory of Plant Secondary Metabolism of Zhejiang Province, Hangzhou 310018, China)

Mining environment of oil degradation bacteria for oil pollution to soil environmental governance, it is very has the potential to not bring secondary pollution is one of the methods of biological removal of oil pollution. From this study through the fushun petroleum wellblock of irrigation water in the sediment sampling, the inorganic salt medium to add 1% of the crude oil as sole carbon source, 5 strains were isolated from oil as sole carbon source of bacteria, oil analysis showed that the degradation rate of 5 strains of bacteria have a certain ability of oil degradation, oil degradation rate is respectively: they followed by sf-5>sf-4?sf, sf-1-3>sf-2, especially sf-5 strains in the highest oil degradation activity to train 15 d, is the most development potential of oil degradation bacteria strains.

oil degradation bacteria; the oil degradation rate; physiological and biochemical; Shen Fu irrigation system

2015-11-30。

遼寧省科技廳科學(xué)事業(yè)公益基金資助項目(2014003020)。

任春英(1990-),女,河北衡水人,沈陽師范大學(xué)碩士研究生; 通信作者: 趙洪新(1967-),男,遼寧鐵嶺人,浙江理工大學(xué)教授,博士。

1673-5862(2016)02-0222-05

Q939.96

A

10.3969/ j.issn.1673-5862.2016.02.020