青海固沙草根際微生態(tài)體系中微生物多樣性分析

李紅曉, 張殿朋, 郝雅蕎, 趙洪新,4

(1. 沈陽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 沈陽 110034;2. 北京市農(nóng)林科學(xué)院 植物保護環(huán)境保護研究所, 北京 100097;3. 浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 杭州 310018;4. 浙江省植物次生代謝重點實驗室, 杭州 310018)

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青海固沙草根際微生態(tài)體系中微生物多樣性分析

李紅曉1,2, 張殿朋2, 郝雅蕎1,3, 趙洪新1,3,4

(1. 沈陽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 沈陽 110034;2. 北京市農(nóng)林科學(xué)院 植物保護環(huán)境保護研究所, 北京 100097;3. 浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 杭州 310018;4. 浙江省植物次生代謝重點實驗室, 杭州 310018)

青海固沙草(Orinuskokonorica)是生長于干旱、高海拔極端環(huán)境,特產(chǎn)于青海的一種優(yōu)勢種禾本科植物。從青海固沙草根際采集土壤,對樣品中的微生物進行了分離鑒定及微生物多樣性分析。共分離得到純培養(yǎng)菌株 232株,隸屬于15個屬、23個種。數(shù)量和種類較多的是細菌,共112株,分別隸屬于9個屬的12個種,占可培養(yǎng)微生物的70%,單胞菌屬占絕大部分;其次為放線菌43株,6個種,占總微生物量的27%;另含有1株酵母菌和4株真菌。該根際微生態(tài)體系中,可培養(yǎng)微生物Simpson多樣性指數(shù)D=0.703,Shannon-Wiener指數(shù)H=13.877,Shannon-Wiener均勻度指數(shù)E=1.766,多樣性等級為Ⅰ級以上。該研究結(jié)果表明:青海固沙草極端生境微生態(tài)中的可培養(yǎng)微生物,不僅豐富多樣,而且具有對極端環(huán)境的應(yīng)變機制為尋找和開發(fā)極端生境微生態(tài)的功能微生物資源提供了參考。

青海固沙草(Orinuskokonorica); 可培養(yǎng)微生物; 微生物多樣性; 極端環(huán)境

0 引 言

微生物多樣性是群落生態(tài)組成水平的主要特征之一,是群落生態(tài)環(huán)境優(yōu)劣的重要指標(biāo)。物種多樣性越豐富,微生態(tài)系統(tǒng)受到外界干擾時的反饋調(diào)節(jié)能力越強,生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性就越高[1]。1904年德國微生物學(xué)家Lorenz Hiltner提出“根際(Rhizosphere)”的概念[2],指出根際微生物(Rrhizosphere microbe)的組成、數(shù)量與植物營養(yǎng)類型與分泌物密切相關(guān),而且植物對環(huán)境的適應(yīng)能力也與根際微生物組成相關(guān),形成了根際微生態(tài)體系內(nèi)微生物與植物相互依存、互相和諧共生的關(guān)系[3]。植物根脫落的細胞及分泌物含有各種氨基酸、有機酸、碳水化合物等,對微生物生長十分有利,使根際微生態(tài)體系內(nèi)的微生物數(shù)量比根際以外高幾倍、幾十倍甚至上千倍。根際微生態(tài)的微生物具有分解土壤中難溶性物質(zhì),增加礦質(zhì)元素吸收,分泌生長刺激素的特征,微生物代謝分泌物及分解環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì),被植物吸收利用,提高了植物的抗逆性,形成了土壤-植物-微生物之間的養(yǎng)分和礦質(zhì)元素良性循環(huán),實現(xiàn)了植物—微生物之間的互利機制[4],所以對植物根際微生態(tài)微生物組成的解析,不僅可以得到更多的微生物資源信息,還可探究特定植物與其根際微生物之間的依存關(guān)系,是環(huán)境微生物研究的重要方向之一。

根際微生物具有多方面作用,除與植物體形成互利共生關(guān)系以外,大多數(shù)根際微生物具有促植物生長和抑制植物病原菌的作用。促植物生長作用機制可總結(jié)如下:1)產(chǎn)生植物激素類,植物激素是植物本身產(chǎn)生的一種化合物,在很低的濃度下就能夠調(diào)節(jié)植物生長、發(fā)育和組織分化,許多細菌都發(fā)現(xiàn)具有產(chǎn)植物激素的能力,而大約有80%以上的從植物根際分離的細菌均具有產(chǎn)植物激素的能力,比如細胞分裂素、赤霉素、乙烯等;2)分泌某種酶調(diào)節(jié)植物生長和發(fā)育,如通過合成1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸鹽脫氨酶(ACC)減少乙烯的水平;3)增強非共生固氮作用,除共生固氮菌以外,一些非共生根際微生物也能增加植物對N營養(yǎng)的吸收能力;4)增加植物所需的磷和其他微量元素的溶解和吸收能力,磷是植物生長和發(fā)育的必需元素,微生物能促進植物根際對磷的吸收率,增加土壤中可利用磷的的量,許多根際細菌通過分泌活性磷酸酯酶(有利于有機磷釋放)溶解植物不能利用的礦物磷,或者產(chǎn)生有機酸而促使無機磷的釋放;5)合成嗜鐵素來增加植物根際可溶性鐵的含量。除了以上5種直接刺激植物生長的機制以外,根際微生物還能通過減少或阻止植物病原菌對植物的侵害作用來間接發(fā)揮作用輔助植物生長,主要抑菌機理體現(xiàn)在:1)抗生作用,根際微生物能產(chǎn)生大量的次級代謝產(chǎn)物,被稱為抗生素,在體外實驗中被作為具有生物活性物質(zhì)的指示劑;2)空間競爭和營養(yǎng)競爭;微生物按照其對環(huán)境的適應(yīng)性和對植物脫落物的特定性依附作用而迅速增殖，搶先占據(jù)生態(tài)位，控制了病原菌的生長和增殖；拮抗菌通過釋放嗜鐵素和磷酸酯酶溶解環(huán)境中植物和病原菌無法利用的鐵和磷等元素供植物利用，增加自身抵抗力。3)系統(tǒng)誘導(dǎo)抗性(ISR);根際微生物能誘導(dǎo)植物自身抗性的增強,研究表明誘導(dǎo)抗性與病原菌侵染過程中植物超微結(jié)構(gòu)和細胞化學(xué)結(jié)構(gòu)變化相關(guān)。

青海省位于我國青藏高原東北隅(31°39′-39°19′N,89°35′-104°4′E),全省面積約72萬km2,平均海拔4000m以上,屬高海拔的省份。禾本科(Gramineae)植物分布廣泛,野生禾本科植物有55屬,246種,31變種或亞種,青海特有種10種2變種[5-6]。草地植被組成每平方米牧草種類約為10～17 種,以旱生叢生禾草青海固沙草、芨芨草、疏花針茅等為優(yōu)勢種[7]。青海固沙草(Orinuskokonorica)是禾本科(Poaceae),畫眉草族(Eragrostideae),三齒稃亞族(Tridentinae),固沙草屬( Orinus)的1種多年生草本植物。1933年Hitchcock發(fā)現(xiàn)并命名[8]。1968年Tzvelev新增了1新種組合青海固沙草(O. kokonorica (Hao)Tzvel)[9],1994年趙南先等又在云南植物研究上報道了1 新種西藏固沙草( O. tibeticus N.X. Zhao)[10],至此, 整個固沙草屬記載6 個物種,均分布在青藏高原[11]。

固沙草屬(Orinus)是禾本科具有重要經(jīng)濟價值的高山特有屬,具有較強的抗逆特性。目前有關(guān)青海固沙草的研究多集中在植物分類、牧草種植資源和對根際土壤的改良作用等方面[12-14]。本研究旨在了解青海固沙草根際微生物的群落結(jié)構(gòu),通過對其根際微生物多樣性分析及菌種研究現(xiàn)狀分析,探究青海固沙草根際微生態(tài)微生物與植物及土壤環(huán)境的相互關(guān)系,為深入研究高海拔優(yōu)勢種植物與其微生物的相互作用關(guān)系,開發(fā)微生物資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1) 供試植物。青海固沙草(Orinuskokonorica),采自青海省境內(nèi)G214自瑪多至西寧沿途的天然草地中的土礫質(zhì)荒漠草地,采集其根系及根際土壤。

2) 主要藥品及儀器。KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、Na Cl、KNO3、Fe2(SO4)3、蛋白胨、葡萄糖、虎紅、牛肉膏、可溶性淀粉、酵母提取物、瓊脂;PCR儀、高壓滅菌鍋、無菌操縱臺。

3) 培養(yǎng)基。馬丁培養(yǎng)基:KH2PO41 g ,MgSO4·7H2O 0.5 g,蛋白胨5 g,葡萄糖10 g,瓊脂20 g,孟加拉紅0.033 g;牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏5 g,蛋白胨10 g,Na Cl 5 g,瓊脂16 g;高氏改良Ⅱ號培養(yǎng)基:可溶性淀粉20 g,Na Cl 0.5 g,KNO31 g,Fe2(SO4)30.01 g,K2HPO40.5 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,瓊脂20 g,pH 7.2～7.4;YPD培養(yǎng)基:酵母提取物10 g,蛋白胨20 g,葡萄糖20 g,瓊脂16 g;PDA培養(yǎng)基:新鮮去皮土豆200 g,葡萄糖20 g,瓊脂16 g。以上均為1 L固體培養(yǎng)基的用量。

1.2 方法

1.2.1 可培養(yǎng)微生物的分離純化

可培養(yǎng)微生物多樣性采用平板涂布法[15],固沙草根際及土壤5g用無菌水分別稀釋10-2、10-3、10-4、10-5、10-65個濃度梯度均勻涂布于改良的高氏Ⅱ號、馬丁氏、YPD加硫酸鏈霉素、PDA和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,依據(jù)常規(guī)培養(yǎng)經(jīng)驗及采集地的特殊環(huán)境條件確定培養(yǎng)條件為10 ℃、25 ℃、28 ℃培養(yǎng)。將所有的單菌落分別挑取至相應(yīng)的培養(yǎng)基至純化,20%甘油于-80 ℃下保藏備用。

1.2.2 菌種鑒定

分離純化出的可培養(yǎng)微生物按照表1中的引物序列及PCR反應(yīng)條件分類鑒定,PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,樣品送與北京市中美泰和生物技術(shù)公司測序。

表1 PCR擴增基因片段及反應(yīng)條件

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

分子鑒定結(jié)果結(jié)合形態(tài)學(xué)特征分析,將確定為一屬的菌株合并一類,利用MEGA6.06軟件繪制簡單系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 多樣性分析

采用Simpson多樣性指數(shù)(D)、Shannon-Wiener指數(shù)(H)和Shannon-Wiener均勻度指數(shù)3個指標(biāo)衡量多樣性及相關(guān)指標(biāo),

E=H/log2S

式中:S為菌種數(shù);Pi為第i種的多度比例,可以用Pi=Ni/N求出;Ni是第i種的菌株數(shù);N是所有菌株數(shù)總和。

2 結(jié)果與分析

2.1 根際微生物分離鑒定結(jié)果

牛肉膏蛋白胨、PDA、YPD、高氏改良Ⅱ號、馬丁5種培養(yǎng)基分別分離得到51、19、50、74、38株,共232株。經(jīng)分子鑒定后,已確定物種中細菌占總數(shù)70%(112株),其中單胞菌屬53株,1株嗜麥芽窄食單胞菌,其余為鞘氨醇單胞菌;假單胞菌31株,其中6株惡臭假單胞菌,1株綠膿假單胞菌;節(jié)桿菌屬13株;泛菌屬9株,全部為成團泛菌;地桿菌屬3株;類芽孢桿菌1株;枯草芽孢桿菌1株;表皮短桿菌1株;抗生素溶桿菌1株。放線菌占總數(shù)27%(43株),其中鏈霉菌屬22株,分別為細黃鏈霉菌16株、栗褐鏈霉菌2株、藍微褐鏈霉菌2株、三色鏈霉菌1株、雙重輪紋鏈霉菌1株。酵母菌1株,占總數(shù)1%,為蘭久浩酵母。真菌4株占總數(shù)2%,分別為高山被孢霉、外生菌根菌、大孢枝孢和細極鏈格孢。從微生物的種類及含量等方面分析，青海固沙草根際微生物種類豐富，囊括了真菌、細菌、放線菌和酵母菌在內(nèi)的4種微生物，從含量上分析，單胞菌屬和鏈霉菌屬占據(jù)絕大多數(shù)，這兩種菌在生物防治領(lǐng)域的應(yīng)用上已有研究并效果良好，推測這兩種菌在青海這種極端環(huán)境下為植物的生長和抗病方面起到了一定的促進作用。

圖1 青海固沙草根際細菌群落結(jié)構(gòu)圖

圖2 青海固沙草根際放線菌群落結(jié)構(gòu)圖

2.2 根際微生物的多樣性分析

根據(jù)2.2.4中的多樣性衡量指標(biāo)計算其數(shù)據(jù)分別為,Simpson多樣性指數(shù)D=0.703,Shannon-Wiener指數(shù)H=13.877,Shannon-Wiener均勻度指數(shù)E=1.766。Simpson多樣性指數(shù)主要關(guān)注局域均勻生境下的某物種數(shù)目的比例，Shannon-Wiener多樣性指數(shù)主要指種類的豐富度和平均度，Shannon-Wiener均勻度指數(shù)是指一個生境中全部物種個體數(shù)目的分配狀況，它反映的是各物種個體數(shù)目分配的均勻程度。Simpson多樣性指數(shù)比Shannon-Wiener指數(shù)對物種均勻度更敏感,而Shannon-Wiener指數(shù)對物種豐富度更敏感,所以二者結(jié)合才能更好的呈現(xiàn)出合理的多樣性解釋,該多樣性指數(shù)結(jié)果表明,青海固沙草根際微生物豐富度按照王兵等人劃分的等級標(biāo)準(zhǔn)[16]屬Ⅰ級以上,而Shannon-Wiener指數(shù)越高,生態(tài)系統(tǒng)的物種越豐富,生態(tài)系統(tǒng)越穩(wěn)定,充分證明了青海固沙草根際含有豐富且均勻的微生物群落,相信這也與逆境環(huán)境下植物的生長有密切關(guān)系。

2.3 根際微生物系統(tǒng)發(fā)育樹分析

結(jié)合菌落形態(tài)及顯微鏡檢結(jié)果,參照Waalwijk等人[17]的方法將分子鑒定得到的序列剪切和對比后,菌株形態(tài)學(xué)相似、保守區(qū)序列相似度在99%以上的視為同一種類,保留其一。分析得到的25株典型微生物用MEGA6.06中的NJ(Neighbor-joining)方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3。其中112株細菌隸屬于9個屬12種,43株放線菌均屬于鏈霉菌屬共包含6種,一株酵母菌為Guehomyces pullulans,4株真菌分別屬于4個不同的種。充分印證了該生態(tài)系統(tǒng)的微生物物種的豐富度和均勻度,有待進一步探究此結(jié)果與特殊環(huán)境下植物的生長的關(guān)系,為后期研究做鋪墊。

圖3 青海固沙草根際微生物簡單系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié) 論

根際是指土壤中圍繞著植物根的一個狹窄的區(qū)域,是植物根系與土壤微生物之間相互作用所形成的獨特的微生態(tài)環(huán)境,也是植物-土壤-微生物相互作用的場所。植物根際富含糖類、有機酸、核苷酸、生長素等有機分泌物和根際脫落物,為根際微生物的生長繁殖提供了堅實的營養(yǎng)來源和物質(zhì)基礎(chǔ),以致根際與根際外土壤相比有著數(shù)量更大、生物活性更強的微生物區(qū)系[18]。其次,細菌對各種根分泌物的利用率和敏感性遠遠超過放線菌、真菌等,所以細菌是數(shù)量最多的一類根際微生物。本研究中細菌總數(shù)占可培養(yǎng)微生物的70%,足以證明了細菌對根際營養(yǎng)物質(zhì)的強烈利用率和根際定植力。楊尚東等也總結(jié)證明了土壤中可培養(yǎng)微生物數(shù)量均表現(xiàn)為:細菌>放線菌>真菌[19]。青海固沙草根際微生物共包括15個屬的23個種,顯示出較為豐富的微生物種群多樣性,且由于根系分泌物的選擇作用和環(huán)境因素,主要以假單胞菌、單胞菌和鏈霉菌屬為主,占分離得到菌總數(shù)的78.4%。

迄今為止,分離得到的純培養(yǎng)微生物約有10萬種,據(jù)估計只占地球上實際存在的微生物總數(shù)的20%,而在人類僅開發(fā)利用了已發(fā)現(xiàn)微生物種數(shù)的1%[20]。運用可培養(yǎng)法獲得的微生物種類在土壤微生物中只占有極小的一部分, 只有將可培養(yǎng)與未培養(yǎng)方法結(jié)合起來才能真正反映微生物的多樣性。自1904年根際概念提出的100多年以來,有關(guān)根際微生物的研究不斷發(fā)展。人們能從基因水平上了解微生物多樣性,并證實環(huán)境中的微生物比預(yù)想的更加豐富。其研究方法大致可分為傳統(tǒng)和現(xiàn)代兩大類,前者包括菌群培養(yǎng)計數(shù)、菌體觀察鑒別及土壤生物過程強度測定等,其最大弊端是大量的不可培養(yǎng)微生物[21-22];而現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用極大地推動了根際微生物的研究,比如變性梯度凝膠電泳(DGGE)、溫度梯度凝膠電泳(TGGE)、末端限制性片段長度多態(tài)性(T-RFLP),以及擴增rDNA限制酶分析(ARDRA)等[23-26]。肖煒等人同時應(yīng)用PCR-DGGE和rRNA分析法對昆明鹽礦古老巖鹽沉積中的原核生物多樣性進行了深入探究,結(jié)果表明昆明鹽礦古老巖鹽沉積含有大量未知的、未培養(yǎng)或不可培養(yǎng)的原核生物, 純培養(yǎng)所得菌株并非該環(huán)境中的優(yōu)勢類群,在原核生物物種組成和豐度上, 已培養(yǎng)與此前的純培養(yǎng)研究結(jié)果也存在一定差異[27]。因此,只有結(jié)合使用兩類方法才能較全面地認識根際微生物真實的多樣性,有必要應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)和多項分類系統(tǒng),并結(jié)合植物學(xué)、土壤學(xué)、礦物學(xué)等基礎(chǔ)研究手段,闡明微生物多樣性與植物生長、代謝產(chǎn)物、礦物風(fēng)化和污染物高效修復(fù)技術(shù)等的相互關(guān)系, 對土壤-植物-微生物之間的關(guān)系探究具有深遠意義。

土壤微生物多樣性與植物土傳病害抑制水平密切相關(guān),其中根際微生物具有重要的作用[28]。青海固沙草根際分離的微生物,如芽孢桿菌,由于芽孢的特殊結(jié)構(gòu),不僅具有穩(wěn)定高效的抗菌作用,還是植物根際促生菌;抗生素溶桿菌有效控制魔芋軟腐病, 還可增產(chǎn)14.30%[29];叢枝菌根真菌與植物共生可以增強植物的抗逆性、抗病性及耐病能力[30];鏈霉菌參與聚ε-L-賴氨酸(ε-PL)的生物合成[31],使該菌對細菌、酵母菌及真菌等均有良好的抑制效果,且已證實為對人體無害的營養(yǎng)物質(zhì),在人體內(nèi)只降解為人體必需氨基酸[32];鞘氨醇單胞菌,近年來被認為是一類具有代謝多樣性的微生物資源,與單胞菌和芽孢桿菌混合使用可以將濃度為200μg·L- 1的MC-RR完全降解[33]。成團泛菌是泛菌屬的模式菌株,同時是人類的條件致病菌,研究表明,成團泛菌中基因yhfK可調(diào)控其對植物致病性,能夠在玉米上引起細菌性干莖腐病[34];目前對蘭久浩酵母的研究主要集中在其嗜冷耐低溫方面,其在逆境時可以通過海藻糖的含量、Tps1酶活、Tps1基因的相對表達量以增強細胞組分抵抗極端惡劣環(huán)境的能力[35];高山被孢霉是α-亞麻酸、二高-γ-亞麻酸、花生四烯酸和二十碳五烯酸的主要生產(chǎn)菌株[36];外生菌根菌可增加895楊對礦質(zhì)營養(yǎng)的吸收[37];大孢枝孢是番茄煤污病的致病菌,目前尚未報道對此病有預(yù)防措施;極細鏈格孢菌的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)在2008年已經(jīng)成功的建立[38],其還對水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌鰻弧菌有良好的抑菌效果,李冬梅更是首次從中分離了其8種代謝物質(zhì)[39]。

綜上分析,青海固沙草根際微生物共包含15個屬的23種微生物種類,具有很好的物種豐富度和均勻度;其次,通過以往報道總結(jié)了該根際微生物對環(huán)境的營養(yǎng)固定與吸收,進而促進植物生長、生物抗菌活性、極端環(huán)境下的應(yīng)變機制等各方面的作用,證明了植物與微生物之間的互利共生關(guān)系;第三,自青海固沙草根際分離得到的微生物在極端環(huán)境生長不僅有極強的生存適應(yīng)能力,還在促生長、對污染物的修復(fù)和環(huán)境優(yōu)化等方面各具特色,為極端環(huán)境功能微生物的尋找和篩選提供有益信息。

[ 1 ]劉振國,李鎮(zhèn)清. 退化草原冷蒿群落13年不同放牧強度后的植物多樣性[J]. 生態(tài)學(xué)報, 2006,26(2):475-480.

[ 2 ]HILTNER L. über neuere Erfahrungen und probleme aufdem Gebiete der Bodenbakteriologie unter besonderer Berücksichtigung der Gründüngung und Brache[J]. Arb DLG, 1904,98:59-78.

[ 3 ]ANTON H, MICHAEL R, MICHAEL S. Lorenz Hiltner, a pioneer in rhizosphere microbial ecology and soil bacteriology research[J]. Plant and soil, 2008,312(1/2):7-14.

[ 4 ]徐文靜,靳曉東,楊秋生. 植物根際微生物的影響因素研究進展[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014,43(5): 6-12.

[ 5 ]卜海燕,任青吉,徐秀麗,等. 青藏高原東部高寒草甸54種禾本科植物種子的萌發(fā)特性[J]. 植物生態(tài)學(xué)報, 2006,30(4):624-632.

[ 6 ]才紅梅,吳阿迪. 青海省土礫質(zhì)荒漠草地分布及基本特征[J]. 青海草業(yè), 2011,20(2):16-19.

[ 7 ]辛玉春. 青海省溫性草原類草地的分布特征[J]. 青海草業(yè), 2014,23(1):35-42.

[ 8 ]HITCHCOCK A S. New grasses from Kashmir[J]. WAS, 1933,23:134-136.

[ 9 ]TZVELEV N N. Planta asiae centralium[J]. Aedibus: Nauka, 1968,4:43.

[10]趙南先,李名非. 西藏禾本科植物新分類群與新記錄種[J]. 云南植物研究, 1994,16(3):228-230.

[11]蘇旭,岳偉,劉建全. 青藏高原固沙草屬種質(zhì)資源收集和保存[J]. 植物分類與資源學(xué)報, 2013,35(3): 343-347.

[12]劉玉萍,蘇旭,周勇輝,等. 固沙草屬的分類現(xiàn)狀及主要存在的問題[J]. 草地學(xué)報, 2015,23(3):453-456.

[13]鐵生年,馬曉芳,王寧峰. 青藏高原沙漠化地區(qū)植物特性與分布狀況分析[J]. 價值工程, 2015,34(26):163-167.

[14]辛玉春. 青海天然草地牧草營養(yǎng)成分分析[J]. 青海草業(yè), 2011,20(1):26-31+9.

[15]陸俊錕. 華南三地紅樹林土壤微生物區(qū)系及PGPR 多樣性研究[D]. 南寧: 廣西大學(xué), 2008.

[16]王兵,鄭秋紅,郭浩. 基于Shannon-Wiener指數(shù)的中國森林物種多樣性保育價值評估方法[J]. 林業(yè)科學(xué)研究, 2008(2):268-274.

[17]WAALWIJIK C, BAAYEN R P, DE KONING J R A, et al. Ribosomal DNA analyses challenge the status of fusarium sections liseola and elegans[J]. Sydowia, 1996,48(1):90-104.

[18]陸雅海,張福鎖. 根際微生物研究進展[J]. 土壤, 2006,38(2):113-121.

[19]楊尚東,吳俊,譚宏偉,等. 南方紅壤區(qū)西南樺和馬尾松人工林土壤微生物活性及細菌多樣性比較[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報, 2014,23(3):415-422.

[20]沈萍,陳向東. 微生物教程[M]. 北京:高等教育出版社, 2006:3-10.

[21]林先貴,胡君利. 土壤微生物多樣性的科學(xué)內(nèi)涵及其生態(tài)服務(wù)功能[J]. 土壤學(xué)報, 2008,45(5):892-900.

[22]林先貴. 土壤微生物分子生態(tài)學(xué)與經(jīng)典生物學(xué)的和諧發(fā)展[C]∥中國土壤學(xué)會第十一屆全國會員代表大會暨第七屆海峽兩岸土壤肥料學(xué)術(shù)交流研討會論文集(下). 北京:中國土壤學(xué)會, 2008:1.

[23]HELENA L P, ESTHER J, ANTONIO M B. PCR-DGGE assessment of the bacterial diversity in Spanish-style green table-olive fermentations[J]. Int J Food Microbiol, 2015,205(16):47-53.

[24]KRISHNA K. KADALI, ESMAEIL S, et al. RNA-TGGE, a tool for assessing the potential for bioremediation in impacted marine ecosystems[J]. J Mar Eng Technol, 2015,3(3):968-980.

[25]BLAUD A, DIOUF F, HERRMANN A M, et al. Analysing the effect of soil organic matter on bacterial communities using T-RFLP fingerprinting: different methods, different stories[J]. Biol Fert Soils, 2015,51(8):959-971.

[26]沙月霞. 污染土壤微生物多樣性研究方法的比較[J]. 寧夏農(nóng)林科技, 2014,55(3):24-28.

[27]肖煒,彭謙,劉宏偉,等. 昆明鹽礦古老巖鹽沉積中的原核生物多樣性[J]. 微生物學(xué)報, 2007,47(2):295-300.

[28]GARBEVA P,VAN V J A,VAN E J D. Assessment of the diversity and antagonists towards rhizoctonia solani AG3 of Pseudomonas species in soil from different agricultural regimes[J]．Microbiol RES, 2004,47(1):51-64.

[29]姬廣海,吳亞鵬,白學(xué)慧,等. 抗生素溶桿菌對魔芋軟腐病和根際微生物多樣性的影響[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2009,31(3):499-503.

[30]AKKOPRU A, DEMIR S. Biological control of Fusarium wilt in tomato caused by Fusarium oxysporumf sp. lycopersici by AMF glomus intraradices and some rhizobacteria[J]. J Phytopathol, 2006, 153(9):544-550.

[31]HIDEO H, MUNENORI T, MASAYUKI S, et al. Biosynthesis of poly(ε-L-lysine)s in two newly isolated strains ofStreptomycessp.[J]. Appl Microbiol Biot, 2006,73(2):321-331.

[32]CHANG S S, LU W Y, PARK S H, et al. Control of foodborne pathogens on ready-to-eat roast beef slurry byε-polylysine[J]. International journal of food microbiology, 2010,141(3):236-241.

[33]徐慧敏,閆海,馬松,等. 鞘氨醇單胞菌USTB-05對微囊藻毒素的生物降解[J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2014,34(5):1316-1321.

[34]曹慧英,張力群,朱振東,等. 成團泛菌對玉米自交系PS056致病性基因fK的克隆[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011,44(2):299-306.

[35]ZHANG Xue, HUA Mingxia, SONG Chunli, et al. Occurrence and diversity of marine yeasts in antarctica environments[J]. J Ocean U China, 2012,11(1):70-74.

[36]JI Xiaojun, ZHANG Aihua, NIE Zhikui, et al. Efficient arachidonic acid-rich oil production by Mortierella alpina through a repeated fed-batch fermentation strategy[J]. Bioresource Technol, 2014,170: 356-360.

[37]宋微,吳小芹,葉建仁. 6種外生菌根真菌對895楊礦質(zhì)營養(yǎng)吸收的影響[J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科版), 2011,35(2):35-38.

[38]萬英,張大軍,黃云,等. 以G418為篩選標(biāo)記的極細鏈格孢菌(Alternariatenuissima)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系的建立[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008,36(29):12602-12604.

[39]李冬梅,武昕,季欣岑,等. 植物內(nèi)生真菌AlternariatenuissimaSY-P-07次級代謝產(chǎn)物的研究[J]. 中國藥學(xué)雜志, 2014,49(6):464-468.

Analysis of microbial diversity of root microecosystem ofOrinuskokonorica

LIHongxiao1,2,ZHANGDianpeng2,HAOYaqiao1,3,ZHAOHongxin1,3,4

(1. College of Life Science, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China; 2. Institution of Plant and Environment Protection, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Science, Beijing 100097, China; 3. College of Life and Science, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China; 4. Key Laboratory of Plant Secondary Metabolism of Zhejiang Province, Hangzhou 310018, China)

The diversity and abundance of culturable microbiome in the root microecosystem ofOrinuskokonorica, a typical and representative plant in Qinghai area, was investigated in this study. Total 232 cultured microorganisms belonged to 15 genera and 23 species were isolated and identified. 112 bacteria, which was 70% cultured microorganisms, belong to 9 genera and 12 species. 43 actinomycetes which was 27% cultured microorganisms, belong to 6 species, and 1 yeast strain and 4 fungi strains were found. The microbial Simpson diversity index,D=0.703, Shannon-Wiener index,H=13.877, Shannon-Wiener Evenness index,E=1.766, and the level of species diversity was Ⅰ. These results are shown that culturable microorganisms isolated from the root microecosystem ofOrinuskokonoricais a very rich diversity of microbial taxa and has the mechanism for adapting extreme environment.

Orinuskokonorica; cultured microorganisms; microbial diversity; extreme environment

2015-12-20。

遼寧省科技廳科學(xué)事業(yè)公益研究基金資助項目(2014003020)。

李紅曉(1989-),女,河北邯鄲人,沈陽師范大學(xué)碩士研究生; 通信作者: 趙洪新(1967-),男,遼寧鐵嶺人,浙江理工大學(xué)教授,博士。

1673-5862(2016)02-0227-07

Q938.1

A

10.3969/ j.issn.1673-5862.2016.02.021