小麥成熟胚高效再生基因型篩選及愈傷組織生理特性評價

湯 益，王志成，崔桂賓，孫風(fēng)麗，張 超，劉曙東，奚亞軍

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)小麥生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室，陜西楊凌 712100；2.陜西省寶雞市隴縣種子管理站，陜西隴縣 721200)

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小麥成熟胚高效再生基因型篩選及愈傷組織生理特性評價

湯 益1，王志成2，崔桂賓1，孫風(fēng)麗1，張 超1，劉曙東1，奚亞軍1

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)小麥生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室，陜西楊凌 712100；2.陜西省寶雞市隴縣種子管理站，陜西隴縣 721200)

為了提高小麥組織培養(yǎng)效率，篩選可用于遺傳轉(zhuǎn)化的小麥高效再生基因型，通過比較56個小麥品種(系)成熟胚組織培養(yǎng)的出愈率、胚性愈傷率、褐化率、分化率、實際成苗率和單位數(shù)量成熟胚的理論成苗率，對其組培能力進(jìn)行了鑒定，并研究了成熟胚愈傷組織形成過程中部分生理性狀的變化情況。結(jié)果表明，篩選出了XNCW2、魯麥14、寶豐228、XNCW4、徐州856、陜150、XNSQ42、XNSQ29、XNSQ04和新麥11共10個具有高頻再生能力的小麥品種(系)，實際成苗率均在20%以上，單位數(shù)量成熟胚的理論成苗率在5%以上。不同基因型小麥成熟胚的出愈率、胚性愈傷率、分化率、實際成苗率和單位數(shù)量成熟胚的理論成苗率的變異系數(shù)分別為14.94%、73.95%、84.89%、109.47%和156.54%，說明組織培養(yǎng)從脫分化到成苗的過程中對小麥基因型的依賴性逐漸增強。愈傷組織的SOD活性與胚性愈傷率和成苗率顯著正相關(guān)，表明SOD活性較強的愈傷組織再生能力較強；可溶性蛋白含量與褐化率極顯著正相關(guān)，表明可溶性蛋白含量更高的愈傷組織再生能力較弱。

小麥；成熟胚；再生；組織培養(yǎng)；生理指標(biāo)

小麥?zhǔn)俏覈饕Z食作物之一，轉(zhuǎn)基因技術(shù)是提高小麥產(chǎn)量、品質(zhì)和抗逆性的重要手段[1-2]，但小麥組織培養(yǎng)技術(shù)的瓶頸和高效再生材料的缺乏制約了小麥遺傳轉(zhuǎn)化的研究[3-4]。自1992年Vasil等[5]以幼胚的愈傷組織為材料將Gus和Bar基因轉(zhuǎn)入小麥中以來，由幼胚、花藥、幼穗和成熟胚等組織誘導(dǎo)而成的愈傷組織都曾作為小麥遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料[6-8]。但幼胚、花藥、幼穗等外植體受到取材時間和季節(jié)的限制，無法滿足轉(zhuǎn)基因?qū)κ荏w的大量需求，而以成熟胚為組織培養(yǎng)材料沒有取材時間和季節(jié)的限制，已成為小麥組織培養(yǎng)的理想材料[9-10]。成熟胚的處理方式[11-12]、外源植物激素的添加[8, 13]、不同的小麥基因型[14]都會對成熟胚愈傷組織的形成和分化造成影響。Bi等[14]研究發(fā)現(xiàn)，不同基因型小麥成熟胚的再生能力存在極大差異，成熟胚組織培養(yǎng)對基因型的依賴性極強。張東武等[13]利用不同的成熟胚處理方式和激素配比對小麥成熟胚進(jìn)行了誘導(dǎo)和再生，認(rèn)為成熟胚縱切和培養(yǎng)基的適當(dāng)激素配比對高效再生基因型的篩選有利。陳俊南等[15]從培養(yǎng)基入手，認(rèn)為不同基因型都有其最適宜的培養(yǎng)條件，培養(yǎng)基的不恰當(dāng)選擇對篩選結(jié)果影響較大。關(guān)于成熟胚高效再生基因型的篩選前人做了較多研究，但主要集中在對誘導(dǎo)和再生體系的優(yōu)化，可供利用的成熟胚高效再生基因型仍較少，成苗率不夠理想，需進(jìn)一步挖掘。

愈傷組織的生理狀況會表征其分化能力，這在其他作物中已有許多報道。張獻(xiàn)龍等[16]報道，棉花的胚性愈傷中較低的糖和淀粉含量、較高的可溶性蛋白含量可能代表更高的分化能力，前者為胚狀體的形成消耗了能量，后者為細(xì)胞分化打下物質(zhì)基礎(chǔ)。Cui等[17]在枸杞的愈傷組織中發(fā)現(xiàn)，適度的內(nèi)源H2O2可以促進(jìn)體細(xì)胞胚的形成，內(nèi)源H2O2相對較高的愈傷組織分化能力較強。Hao等[18]在燕麥中發(fā)現(xiàn)，胚性愈傷組織的超氧化物歧化酶(SOD)活性強于非胚性愈傷，丙二醛(MDA)含量低于非胚性愈傷組織。在小麥中，Yang等[19]報道了由成熟胚和幼胚產(chǎn)生的愈傷組織中多酚含量與分化率和再生率正相關(guān)，可溶性糖含量與分化率和再生率負(fù)相關(guān)。但目前關(guān)于小麥胚性愈傷組織生理特征的報道相對較少。

鑒于此，本試驗擬對56個小麥品種(系)的成熟胚進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)和分化，并對其愈傷組織的生理性狀進(jìn)行評價，以期進(jìn)一步探明小麥成熟胚高效再生基因型愈傷組織的生理特征，并篩選出小麥成熟胚高效再生基因型。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試的56份小麥品種(系)(表1)均由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院奚亞軍教授課題組提供。

1.2 小麥組織培養(yǎng)

1.2.1 種子滅菌

選取均勻飽滿的小麥種子，根據(jù)Chugh和Khurana[20]的滅菌方法，先用70%酒精處理5 min，無菌水漂洗5次，再用25%次氯酸鈉滅菌20 min，無菌水漂洗5次，封口膜封口后暗過夜浸泡10 h，次日再于4 ℃環(huán)境浸泡4 h，在超凈臺上再用25%次氯酸鈉消毒15 min，無菌水漂洗5次。

1.2.2 成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)和分化

用經(jīng)高溫滅菌冷卻處理后的鑷子從小麥種子中取出成熟胚后刮碎并接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(pH 5.8，MS +8 g·L-1瓊脂+30 g·L-1蔗糖+0.1 g·L-1水解酪蛋白+0.5 mg·L-12, 4-D+2.2 mg·L-1Picloram，每皿50個，3次重復(fù))，暗培養(yǎng)21 d誘導(dǎo)愈傷組織，溫度為24±1 ℃，統(tǒng)計出愈率，35 d后統(tǒng)計胚性愈傷率。挑選生長良好的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基(pH 5.8，MS + 8 g·L-1瓊脂+ 30 g·L-1蔗糖+ 1 mg·L-1KT)進(jìn)行光照培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光強12 000 lx，光照16 h·d-1，溫度為24±1 ℃，21 d后統(tǒng)計愈傷組織分化率和褐化率。

1.2.3 再生苗的生根誘導(dǎo)和移栽

待再生苗長至3～5 cm長時轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(pH 5.8，1/2 MS+8 g·L-1瓊脂+30 g·L-1蔗糖)，與分化培養(yǎng)相同條件下培養(yǎng)21 d，統(tǒng)計愈傷組織成苗率。

1.3 取材和性狀測定

取成熟胚誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d后的愈傷組織迅速放入液氮中，用于SOD、POD活性測定和可溶性蛋白、丙二醛含量測定。同時，另取同時期的愈傷組織測定鮮重、干重和含水量(每個基因型取20粒愈傷進(jìn)行測定)。SOD活性測定采用NBT光還原法[21]，POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[22]，可溶性蛋白含量、丙二醛(MDA)含量、鮮重、干重和含水量的測定采用高俊鳳等[23]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

愈傷組織的統(tǒng)計參考Yan等[24]的方法，出愈率=產(chǎn)生愈傷的成熟胚數(shù)/接種成熟胚數(shù)×100%，胚性愈傷率=產(chǎn)生胚性愈傷的成熟胚數(shù)/接種成熟胚數(shù)×100%，分化率=分化出綠芽的愈傷組織塊數(shù)/接種胚性愈傷數(shù)×100%，褐化率=發(fā)生褐化的胚性愈傷組織數(shù)目/接種胚性愈傷數(shù)×100%，實際成苗率=生根成苗的愈傷組織塊數(shù)/接種胚性愈傷數(shù)×100%，單位數(shù)量成熟胚的理論成苗率=胚性愈傷率×實際成苗率×100%(假設(shè)所有產(chǎn)生胚性愈傷的成熟胚都形成了理想的愈傷，且數(shù)量相同)。其他數(shù)據(jù)處理和分析采用Excel 2013和IBM SPSS Statistics 19軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試小麥品種(系)中的高頻再生基因型

不同小麥品種(系)的出愈率、胚性愈傷率、分化率、實際成苗率、褐化率、單位數(shù)量成熟胚的理論成苗率見表1。從整體上觀察成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)到分化成苗的整個過程發(fā)現(xiàn)，滿足需要的外植體數(shù)量在不斷降低，而變異系數(shù)在不斷增大。從單位數(shù)量成熟胚的理論成苗率看，XNCW2的再生能力最高，為27.38%；其次是魯麥14、寶豐228和XNCW4，這三個材料的理論成苗率都在10%以上；XNSQ04、XNSQ29、XNSQ42、新麥11、徐州856、XNQX6、XN1376、陜150共8個材料的理論成苗率都在5%以上；其余材料的理論成苗率在5%以下。從單位數(shù)量愈傷組織的實際成苗率看，XNCW2同樣表現(xiàn)最佳，為40.38%；其次是魯麥14、寶豐228、XNCW4、徐州856、陜150、XNSQ42、XNSQ29、XNSQ04和新麥11；這9個材料的實際成苗率在20%以上；XN1376、XNSQ31、XNQX6、XNCW3、XNQX1、XN8164、新麥13、XNCW5、汝陽2號和Q2f-4-13的成苗率在10%以上；其余材料的實際成苗率在10%以下。由此可見，無論是單位數(shù)量成熟胚的理論成苗率還是實際成苗率，XNCW2、魯麥14、寶豐228、XNCW4、XNSQ04、XNSQ29、XNSQ42、新麥11、徐州856、XNQX6、XN1376、陜150的再生能力表現(xiàn)較好，可以作為小麥遺傳轉(zhuǎn)化的候選材料。

表1 不同基因型小麥成熟胚的出愈率、胚性愈傷率、褐化率、分化率、實際成苗率和單位數(shù)量成熟胚的理論成苗率

(續(xù)表1 Continued table 1) %

2.2 供試小麥品種(系)愈傷組織生理性狀的差異分析

不同基因型小麥成熟胚愈傷組織生理性狀的特征見表2。鮮重、干重和含水量的平均值分別為0.046 2 g、0.003 8 g和91.62%，變異系數(shù)分別為73.14%、77.25%和1.55%；可溶性蛋白含量和MDA含量的平均值分別為1.71 μg·g-1FW和8.50 nmol·g-1FW，變異系數(shù)分別為33.47%和38.97%；SOD活性和POD活性分別為147.12 U·g-1FW和4 940.49 U·g-1FW·min-1，變異系數(shù)分別為67.77%和28.25%。

表2 不同小麥成熟胚愈傷組織的生理特性

表3 不同小麥成熟胚再生特性及愈傷組織生理性狀間的相關(guān)性分析

*和**分別表示在 0.05 和0.01水平上顯著相關(guān)。

* and ** mean the correlation is significant at 0.05 and 0.01 levels,respectively.

2.3 供試小麥品種(系)各性狀的相關(guān)性

不同基因型小麥各性狀的相關(guān)性分析結(jié)果見表3。單位數(shù)量成熟胚的理論成苗率與胚性愈傷率、分化率和實際成苗率極顯著相關(guān)，與SOD活性顯著相關(guān)。與出愈率顯著相關(guān)的生理指標(biāo)只有愈傷組織的含水量(顯著負(fù)相關(guān)，r=-0.266)，與胚性愈傷率顯著相關(guān)的生理指標(biāo)有可溶性蛋白含量(顯著負(fù)相關(guān)，r=-0.269)、SOD活性(顯著正相關(guān)，r=0.335)和POD活性(顯著正相關(guān)，r=0.267)，與實際成苗率顯著相關(guān)的生理指標(biāo)只有SOD活性(顯著正相關(guān)，r=0.281)，沒有生理指標(biāo)與愈傷組織的分化率顯著相關(guān)。此外，與愈傷組織褐化率顯著相關(guān)的生理指標(biāo)有愈傷組織的含水量(顯著負(fù)相關(guān)，r=-0.281)和可溶性蛋白含量(極顯著正相關(guān)，r=0.561)。由此可見，愈傷組織的含水量、可溶性蛋白含量、SOD活性和POD活性都與小麥成熟胚的再生能力有關(guān)。

3 討 論

小麥成熟胚組織培養(yǎng)受到多種條件的制約，基因型差異是限制成熟胚組織培養(yǎng)的關(guān)鍵因素。本試驗通過對56個小麥基因型成熟胚組織培養(yǎng)特征和部分生理性狀進(jìn)行比較，共篩選出了XNCW2、魯麥14、寶豐228、XNCW4、徐州856、陜150、XNSQ42、XNSQ29、XNSQ04、新麥11共10個小麥高頻再生基因型，實際成苗率都在20%以上，最高可達(dá)40.38%，單位數(shù)量成熟胚的理論成苗率都在5%以上，最高可達(dá)27.38%，并初步得出小麥愈傷組織中SOD酶活性降低可能是影響其再生能力的原因之一。

在小麥成熟胚的組織培養(yǎng)中，不同基因型的出愈率、胚性愈傷率、分化率、實際成苗率和單位數(shù)量成熟胚的理論成苗率存在極大差異，由此可見，基因型影響成熟胚脫分化至成苗的整個過程，這與Mathias等[25]和Fennell等[26]的研究結(jié)果一致。同時，我們還注意到基因型影響成熟胚組織培養(yǎng)的過程是復(fù)雜的。從群體水平分析，從成熟胚愈傷組織的產(chǎn)生到再生苗形成的過程中，出愈率、胚性愈傷率、分化率、實際成苗率和理論成苗率依次降低，而變異系數(shù)則依次增加，表明基因型對單位數(shù)量成熟胚的理論成苗率影響最大，其次是實際成苗率，最后是分化率、胚性愈傷率和出愈率；在Yin等[27]的研究中，不同小麥的出愈率同樣遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于分化率或者成苗率，且脫分化率的變異也遠(yuǎn)小于分化率和成苗率的變異，說明在組織培養(yǎng)后期，成熟胚的組織培養(yǎng)對基因型的依賴性更強，基因型對成熟胚組織培養(yǎng)的影響更大。此外，與Yan等[24]的研究結(jié)果相同，成熟胚的胚性愈傷率、分化率和實際成苗率呈極顯著正相關(guān)，近一步說明小麥品種(系)成熟胚的脫分化與再分化是密切聯(lián)系的，對大多數(shù)小麥而言，胚性愈傷率越高，再生能力越強，分化成苗率越高。但特殊的小麥基因型也值得注意，例如XNCW1和百農(nóng)64，前者胚性愈傷率為39.76%，但其分化率和實際成苗率僅為7.46%，后者胚性愈傷率極低，只有5.30%，但其分化率可達(dá)48.59%，可見胚性愈傷率高的小麥其分化率不一定高。因此，不同基因型的小麥成熟胚在脫分化和再分化過程中的表現(xiàn)并不完全一致，基因型影響小麥成熟胚再生的過程是多變的。

目前已經(jīng)有許多關(guān)于小麥高效再生基因型篩選的研究，大多以分化率或者成苗率作為篩選條件，而忽略了成熟胚的脫分化過程[13,28]。從本研究結(jié)果分析，雖然不同基因型小麥成熟胚的出愈率相對較大且變異較小，相對于分化率和成苗率對小麥最終成苗的結(jié)果影響要小，但愈傷組織基數(shù)的降低會影響胚性愈傷數(shù)目，從而影響最終成苗數(shù)，因此出愈率和胚性愈傷率在評價小麥再生能力時也是不可缺少的。此外，本研究采用了單位數(shù)量成熟胚的理論成苗率，即假設(shè)所有產(chǎn)生胚性愈傷組織的成熟胚都形成了理想愈傷，且愈傷數(shù)目相同，統(tǒng)計胚性愈傷率和實際成苗率，單位數(shù)量成熟胚的理論成苗率即為胚性愈傷率與實際成苗率的乘積，兼顧了成熟胚的脫分化能力和愈傷組織的再分化能力，同時還代表了單位數(shù)量成熟胚的理論成苗數(shù)，具有實際意義。相關(guān)分析表明，單位數(shù)量成熟胚的理論成苗率與胚性愈傷率、分化率和實際成苗率均呈極顯著正相關(guān)，且使用單位數(shù)量成熟胚的理論成苗率理論上可得到最多數(shù)量的再生苗，因此單位數(shù)量成熟胚的理論成苗率可以作為成熟胚再生能力的鑒定指標(biāo)。

小麥愈傷組織形成過程中伴隨著一系列的生理生化變化，內(nèi)源生理因素對小麥成熟胚愈傷組織的形成影響較大。本研究中，愈傷組織的可溶性蛋白含量和褐化率極顯著正相關(guān)，說明愈傷組織中過高的可溶性蛋白含量不利于愈傷組織的再生和分化。SOD活性與胚性愈傷率、實際成苗率和理論成苗率呈顯著正相關(guān)，說明SOD活性的上升有利于胚性愈傷組織的形成和再分化，這與Cui等[17]和Hao等[18]的研究結(jié)果相符。此外，外源物質(zhì)如植物生長調(diào)節(jié)劑[27]、H2O2[17]、除草劑等[28]的添加也會影響內(nèi)源生理因素從而影響愈傷組織的分化，因此，內(nèi)源生理指標(biāo)的變化表征愈傷組織的再生能力還有待進(jìn)一步研究。

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Evaluation of Regeneration and Physiological Characteristics of Callus from Mature Embryo of Wheat

TANG Yi1, WANG Zhicheng2, CUI Guibin1, SUN Fengli1,ZHANG Chao1, LIU Shudong1, XI Yajun1

(1.College of Agronomy, Northwest A&F University/Key Laboratory of Wheat Biology and Genetic Improvement on Northwestern China, Ministry of Agriculture, Yangling, Shaanxi 712100, China;2.Seed Management Department of Longxian County, Longxian, Shaanxi 721200, China)

To screen wheat genotypes for better tissue culture using mature embryo, mature embryos of 56 wheat cultivars were scraped and used as explants for regeneration capacity analysis by comparing callus rate, embryogenic callus rate, browning rate, differentiation rate, actual seedling rate, and theoretical seedling rate. The physiological characteristics of embryonic callus were also evaluated. The results showed wheat genotypes including XNCW2, Lumai 14, Baofeng 228, XNCW4, Xuzhou 856, Shaan 150, XNSQ42, XNSQ29,XNSQ04,and Xinmai 11 have high regeneration frequency with the actual seedling rate above 20% and theoretical seedling rate above 5%. The coefficient variation of callus rate, embryogenic callus rate, differentiation rate, actual seedling rate, and theoretical seedling rate were 14.94%, 73.95%, 84.89%, 109.47%, and 156.54%, respectively, which means wheat genotype plays an increasingly important role in tissue culture from dedifferentiation to seedling formation. High superoxide dismutase (SOD) activity is probably positive for embryogenic callus formation and differentiation because SOD activity of callus was significantly positive correlated with embryogenic callus rate and seedling rate. However, callus with more soluble protein has weaker regeneration ability, because soluble protein content is positively correlated with browning rate.

Wheat; Mature embryo; Regeneration; Tissue callus; Physiological characteristics

時間：2016-10-08

2016-01-24

2016-09-07

陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃項目(2015KTZDNY01-08)；國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(2008ZX080022003)

E-mail：378698952@qq.com

奚亞軍(E-mail：xiyajun11@126.com)

S512.1；S336

A

1009-1041(2016)10-1307-08

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20161008.0932.012.html