OPN和MMP-9在膽管癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中的作用

李志鋒，劉進(jìn)忠，石榮亞，趙小利，張利萍

(河北省保定市第一醫(yī)院，河北 保定 071000)

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OPN和MMP-9在膽管癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中的作用

李志鋒，劉進(jìn)忠，石榮亞，趙小利，張利萍

(河北省保定市第一醫(yī)院，河北 保定 071000)

目的 探討骨橋蛋白(OPN)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)在膽管癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。方法應(yīng)用免疫組化SP法檢測OPN和MMP-9在60例膽管癌和30例正常膽管組織中的表達(dá)情況，通過兩者與膽管癌臨床病理特征的關(guān)系了解其在膽管癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中的作用，并分析兩者相關(guān)性。結(jié)果 OPN在膽管癌、正常膽管組織中陽性表達(dá)率分別是65.0%(39/60)，26.7%(8/30)；MMP-9在膽管癌、正常膽管組織中陽性表達(dá)率分別是71.7%(43/60)和33.3%(10/30)；OPN和MMP-9在膽管癌組織表達(dá)陽性率均明顯高于在正常膽管組織，且與腫瘤浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.05)；Spearman相關(guān)分析顯示OPN、MMP-9在膽管癌組織中陽性表達(dá)呈正相關(guān)性(r=0.319，P=0.012)。結(jié)論 OPN和MMP-9在膽管癌組織中高表達(dá)，與腫瘤浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能在膽管癌的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了協(xié)同作用，可作為膽管癌重要的生物學(xué)參考指標(biāo)。

膽管癌；腫瘤浸潤；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；OPN；MMP-9

膽管癌是指發(fā)生在左右肝管匯合部至膽總管下端的惡性腫瘤，近年來發(fā)病率逐步增高。膽管癌由于高發(fā)病率和高死亡率，嚴(yán)重危害人類健康。浸潤和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤基本的生物學(xué)特征，也是腫瘤患者主要死亡原因。膽管癌的發(fā)病、浸潤、侵襲轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的多基因異常調(diào)控的過程。骨橋蛋白(OPN)是一種鈣結(jié)合磷酸化糖蛋白，通過與受體結(jié)合對細(xì)胞的黏附、遷移等過程進(jìn)行調(diào)節(jié)，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤等病理過程?；|(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)是一種蛋白水解酶,可特異性降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。本研究采用免疫組化SP法檢測基質(zhì)OPN和MMP-9在膽管癌中的表達(dá)，探討其在膽管癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。

1 臨床資料

1.1 一般資料 收集2010年10月—2015年8月我院60例膽管癌手術(shù)患者臨床病歷資料，男34例，女26例；年齡35～76歲，平均63.8歲；其中高分化29例，中分化19例，低分化12例；腫瘤浸潤T1、T2共33例，T3、T4共27例；其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者32例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者28例。所有患者術(shù)前均未行放、化療等相關(guān)抗癌治療。同時選取距膽管癌2 cm正常膽管組織30例作為對照。

1.2 方法及試劑 標(biāo)本取材后經(jīng)中性福爾馬林固定,石蠟包埋,常規(guī)行4 μm厚度連續(xù)切片。石蠟組織切片經(jīng)脫蠟水化，抗原修復(fù)，血清封閉，滴加稀釋的一抗，4 ℃恒溫過夜，滴加二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化、脫水、透明、封片、鏡檢。兔抗人OPN單克隆抗體和鼠抗人MMP-9單克隆抗體購于福州邁新生物技術(shù)有限公司，SP通用型免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒均購于福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.3 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) OPN、MMP-9陽性表現(xiàn)為胞質(zhì)可見清晰的淺黃色、黃色或棕黃色顆粒。根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)所占比例及著色情況綜合評分。著色強度：不顯色或顯色不清為0； 淺黃色為1分；黃色為2分；棕黃色為3分。陽性細(xì)胞百分率：陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)<5%，0分；5%～35%，1分；36%～65%，2分；>65%，3分。兩項得分相加，0～2分為陰性，≥3為陽性。每份標(biāo)本置高倍鏡下選取10個不同視野，每個視野計數(shù)100個腫瘤細(xì)胞，由兩位高年資病理醫(yī)師獨立觀片后盲法判讀。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料的比較采用2檢驗，當(dāng)某一個理論數(shù)1

2 結(jié) 果

2.1 OPN和MMP-9在膽管癌、正常膽管組織中的表達(dá) OPN和MMP-9在膽管癌組織表達(dá)陽性率均明顯高于在正常膽管組織組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 OPN和MMP-9在膽管癌、正常膽管組織中的表達(dá) 例(%)

2.2 OPN和MMP-9在膽管癌組織中表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 膽管癌組織中，OPN、MMP-9陽性表達(dá)與患者性別、年齡及腫瘤分化程度無相關(guān)性(P>0.05)，而與腫瘤浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，OPN和MMP-9在膽管癌組織T3-T4中陽性率高于T1-T2(P<0.05)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組(P<0.05)。見表2。

2.3 OPN和MMP-9在膽管癌組織中相關(guān)性 在60例膽管癌組織標(biāo)本中，OPN和MMP-9均表達(dá)陽性為32例，OPN陽性而MMP-9陰性為7例，OPN陰性MMP-9陽性為11例，OPN和MMP-9均為陰性10例。Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，膽管癌組織中OPN與MMP-9的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.319，P=0.012)。

表2 OPN和MMP-9在膽管癌組織中表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 例

3 討 論

OPN是一種含特有RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)序列的鈣結(jié)合磷酸化糖蛋白，在人體腎臟、平滑肌、胎盤、骨基質(zhì)等不同組織細(xì)胞中均有發(fā)現(xiàn)。OPN有兩種受體，一種是鈣依賴性的整合素受體，OPN通過特有RGD序列位點與整合素受體結(jié)合；還有一種為CD44受體。OPN通過與其受體結(jié)合，可增強細(xì)胞趨化、黏附、遷移功能，抑制細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)重塑和血管生成，促使腫瘤的浸潤和侵襲轉(zhuǎn)移[1]。

目前，已有大量研究表明[2-4]，OPN在胃癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌等多種實體瘤中異常高表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生、浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。李天然等[5]觀察OPN轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)對高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞(MHCC97-H)增殖、侵襲能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng) OPN 轉(zhuǎn)染的BMSCs細(xì)胞對 MHCC97-H細(xì)胞侵襲具有明顯的促進(jìn)作用。Wang等[6]通過RT-PCR及免疫組化方法對結(jié)腸癌組織研究發(fā)現(xiàn)，OPN的高表達(dá)顯著增加了結(jié)腸癌的淋巴轉(zhuǎn)移與血行浸潤，與腫瘤TNM的分期呈正相關(guān)，同時OPN mRNA高表達(dá)患者的生存期明顯低于OPN mRNA低表達(dá)患者，因此認(rèn)為OPN mRNA在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展中有促進(jìn)作用，可以成為結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨立預(yù)測因素。本研究中OPN在膽管癌組織過表達(dá)，與膽管癌細(xì)胞浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，預(yù)示OPN在膽管癌的浸潤、侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用，

MMP-9是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白水解酶家族成員之一，主要由巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和某些惡性腫瘤細(xì)胞合成分泌。MMP-9作為蛋白水解酶, 可對Ⅳ、Ⅴ型膠原和彈性蛋白構(gòu)成的細(xì)胞基質(zhì)(ECM)進(jìn)行降解和破壞，為腫瘤提供轉(zhuǎn)移的通道，加強腫瘤細(xì)胞黏附能力，并參與新血管形成，促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[7]。MMP-9通過降低腫瘤細(xì)胞之間的黏附性，提高腫瘤細(xì)胞的浸潤和游走能力，促使腫瘤細(xì)胞突破基底膜向周圍浸潤轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。

在許多惡性腫瘤組織中均可檢測到MMP-9呈高表達(dá), 其表達(dá)與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[8-10]。盧建軍等[11]應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法檢測MMP-9在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)MMP-9在子宮內(nèi)膜癌組織中特異性高表達(dá)。張鳳梅等[12]通過免疫組織化學(xué)SP方法檢測MMP-9在胃癌和正常胃黏膜組織中的表達(dá)，結(jié)果表明MMP-9在胃癌組織呈高表達(dá)，且表達(dá)水平與癌組織分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性，因此認(rèn)為MMP-9在胃癌浸潤、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，MMP-9在膽管癌組織中異常高表達(dá)，表達(dá)水平與膽管癌浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，即隨著腫瘤浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移增加，MMP-9表達(dá)陽性率升高。

本實驗中Spearman雙變量相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，OPN和MMP-9在膽管癌組織表達(dá)成正相關(guān)，二者表達(dá)陽性率升高具有一致性，因此認(rèn)為，OPN和MMP-9在膽管癌的發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移中具有協(xié)同促進(jìn)作用。其可能機(jī)制是OPN通過PI3K/Akt信號途徑激活核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)，提高尿激酶型纖溶酶激活物分泌，促使 MMP-9表達(dá)升高，引起細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜降解，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移[13]。

綜上所述，OPN和MMP-9表達(dá)水平與膽管癌的腫瘤浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，預(yù)示兩者可能在膽管癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，聯(lián)合檢測兩項指標(biāo)有助于膽管癌生物學(xué)行為的判斷和預(yù)后的評估。同時為膽管癌的靶向治療提供了新的研究方向。

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劉進(jìn)忠，E-mail：504693127@qq.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.33.031

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1008-8849(2016)33-3733-03

2016-03-05