結直腸癌中CEACAM1、VEGF的表達及與血管生成的關系和意義

吳 濤，徐 亮，楊志惠

(西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，四川 瀘州 646000)

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結直腸癌中CEACAM1、VEGF的表達及與血管生成的關系和意義

吳 濤，徐 亮，楊志惠

(西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，四川 瀘州 646000)

目的 觀察癌胚抗原相關細胞黏附分子1(CEACAM1)、血管內皮生長因子(VEGF)在結直腸癌中的表達情況及與微血管密度(MVD)的關系和意義。方法 選擇90 例行手術切除治療結直腸癌患者的癌組織標本作為觀察組， 50例結直腸腺瘤患者的組織標本作為對照組，隨機從觀察組中選取10例距腫瘤邊緣>5 cm的正常結直腸黏膜組織標本作為正常組。采用免疫組織化學方法檢測3組組織標本中CEACAM1、VEGF表達情況，并記錄MVD值，對CEACAM1、VEGF表達情況與MVD關系進行相關性分析。結果 觀察組中CEACAM1 、VEGF陽性表達率和MVD值均明顯高于對照組和正常組(P均<0.05)。觀察組中CEACAM1、VEGF的陽性表達率及MVD值與腫瘤分化程度、淋巴結有無轉移、腫瘤臨床分期、腫瘤大小、腫瘤浸潤深度均有關系(P均<0.05)，與性別、年齡、腫瘤部位無明顯關系(P均>0.05)。線性相關性分析顯示，CEACAM1、VEGF和MVD均具有正相關性(P均<0.05)。結論 CEACAM1、VEGF的高表達及MVD的升高與結直腸癌的生物學行為和進展關系密切，通過調節(jié)CEACAM1、VEGF的表達可能抑制腫瘤的浸潤和轉移。

結直腸癌；癌胚抗原相關細胞黏附分子1；血管內皮生長因子；微血管密度；免疫組織化學技術

結直腸癌是臨床常見惡性腫瘤之一，病死率較高，這不僅與缺乏有效的早期診斷方面的生物學指標有關，還與不能阻斷腫瘤的浸潤和轉移有關。結直腸癌是富于血管的腫瘤，間質的血管生成是結直腸癌生物學進展的重要因素。目前關于其血管的生成有較為肯定的結論，但是相關影響因素研究較少。因此，研究影響結直腸癌間質血管生成的有關因素，對于尋找結直腸癌早期診斷的生物學指標、預后判斷的指標、靶向治療的指標十分必要。癌胚抗原相關細胞黏附分子1(CEACAM1)也稱CD66，其有抑癌的作用，但是近年來也有學者認為其在不同腫瘤中可能具有促癌變進展的作用[1]，其還可能具有多種生物學行為，如促進血管的新生等[2]。血管內皮生長因子(VEGF)是經典的血管生成促進因子，可以促進間質血管生成[3]。白細胞分化抗原34(CD34)是血管內皮的特異性標志物，其表達陽性可以標記血管密度(MVD)，臨床應用廣泛[4]。目前CEACAM1、VEGF的表達及對血管生成的作用在結直腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用研究較少，因此本研究探討了CEACAM1、VEGF在結直腸癌中的表達情況及與MVD的關系和意義，試圖為尋找結直腸癌早期診斷、預后判斷、靶向治療的指標提供支持。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選擇2011年1月—2012 年 12 月在本院住院的90 例行手術切除治療結直腸癌患者的癌組織標本作為觀察組，男50例，女40例；年齡29～83(54.3±11.6)歲，中位年齡55歲；高分化腺癌30例，中分化腺癌35例，低分化腺癌(包括黏液腺癌和黏液細胞癌)25例；無淋巴結轉移49 例，有淋巴結轉移41例(淋巴結轉移為術后病理報告中腸周淋巴結、系膜淋巴結及系膜動脈結扎處淋巴結)。另選取50例結直腸腺瘤患者的組織標本作為對照組，男26例，女24例；年齡16～78 (57.6±11.5)歲，中位年齡58歲。隨機從觀察組中選取10例患者距腫瘤邊緣>5cm的正常結直腸黏膜組織標本作為正常組，男6 例，女4例；年齡35～60(56.5±7.7)歲，中位年齡51歲。3組均排除伴風濕性免疫系統(tǒng)疾病、其他類型的惡性腫瘤者，應用免疫抑制劑及術前放化療者。

1.2 試劑與方法 兔抗人CEACAM1多克隆抗體、VEGF購自美國Bioworlde公司，CD34、二抗、DAB試劑盒購自丹麥Dako 公司。采用Evision免疫組織化學染色法檢測各組組織標本中CEACAM1、VEGF、CD34的表達情況，其中CEACAM1采用胰腺癌作陽性對照，VEGF和CD34采用結腸癌作陽性對照。

1.3 結果判定標準 CEACAM1 以細胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞；VEGF以細胞漿和/或細胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞；CD34表達在血管內皮細胞，呈棕褐色顆粒染色為陽性。陽性表達率計算：每張切片隨機選擇10個區(qū)域，在40×10高倍鏡視野下選取陽性細胞密度高者計數，計數陽性細胞數占實質細胞的百分比。無陽性細胞表達為0分；陽性表達率小于1%為1分；陽性表達率表達1%～10%為2分；陽性表達率>10%～30%為3分；陽性表達率>30%～60%為4分；陽性表達率>60%為5分[5]。染色的強度按照無、弱、中、強分為0分、1分、2分和3分。將兩者標準分相乘表示陽性表達水平[6]：0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～7分為陽性()，≥8分為強陽性()。將()計為陽性表達，將(-)(+)()歸為陰性表達。微血管密度(MVD)的計數采用Weidner法[7]，以出現(xiàn)與鄰近的微血管明顯分離，染色(棕色)陽性的單個內皮細胞或者內皮細胞簇作為一個血管計數。在40倍顯微鏡下確定切片血管密度最高的區(qū)域, 即“熱點”，然后在200倍的顯微鏡下用計算機掃描統(tǒng)計,選擇血管密度最高的3個區(qū)進行微血管計數,然后取其平均MVD值作為微血管數。

1.4 統(tǒng)計學方法 實驗數據均應用SAS 6.12統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計數資料比較采用2檢驗，計量資料比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，并對數據進行線性相關性分析，均以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組CEACAM1和VEGF陽性表達率比較 CEACAM1和VEGF在正常黏膜中陰性表達；CEACAM1在觀察組和對照組中的陽性表達率分別為53.3%(48/90)和26.0%(13/50)，VEGF在觀察組和對照組中的陽性表達率分別為56.7%(51/90)和38.0%(19/50)。觀察組CEACAM1和VEGF陽性表達率均明顯高于對照組和正常組(P均<0.05)，對照組明顯高于正常組(P均<0.05)。

2.2 各組MVD比較 觀察組、對照組及正常組MVD分別為30.66±4.95，22.94±5.42，19.00±4.35。觀察組MVD明顯高于正常組、對照組(P均<0.05)，對照組明顯高于正常組(P<0.05)。

2.3 觀察組CEACAM1和VEGF表達與臨床病理特征的關系 CEACAM1、VEGF陽性表達率與腫瘤分化程度、淋巴結轉移、腫瘤的臨床分期、大小和浸潤深度顯著相關(P均<0.05)，與性別、年齡、部位無明顯關系(P均>0.05)。見表1。

2.4 觀察組MVD值與臨床病理特征的關系 MVD值與腫瘤分化程度、淋巴結有無轉移、腫瘤臨床分期、腫瘤大小、腫瘤浸潤深度均有關系(P均<0.05)，與性別、年齡、腫瘤部位均無明顯關系(P均>0.05)。見表2。

2.5 觀察組CEACAM1、VEGF表達與MVD相關性 線性相關性分析示，CEACAM1與MVD(r=0.47,P=0.0392)、VEGF與MVD(r=0.65,P=0.0012)均具有正相關性。見圖1及圖2。

3 討 論

結直腸癌發(fā)病與多種基因和蛋白的表達失調有關，其中血管生成的相關蛋白表達升高被認為在腫瘤形成和進展中有重要作用，如VEGF的生成和分泌增多。其次標記血管生成的相關蛋白如CD31、CD34等在腫瘤中的表達也升高，其對促進腫瘤進展有重要意義。近年學者也關注CEACAM1在腫瘤形成中的作用。

CEACAM1最初被認為是調節(jié)細胞黏附作用的重要黏附分子，主要通過鄰近細胞表達的N末端Ig區(qū)域進行調節(jié)[8]。近年龔道元等[1]研究認為CEACAM1的升高對腫瘤的診斷及進展有重要作用。Yurdakul等[9]研究顯示，CEACAM1在腫瘤組織的血管內皮中常有表達，認為其是腫瘤新生血管的標志物。申寶鳴等[10]報道腸癌患者血清CEACAM1水平明顯高于正常組，認為CEACAM1可能是早期診斷腸癌的指標。王媛媛等[11]認為，CEACAM1表達的上調與結腸癌發(fā)生發(fā)展密切相關。本研究結果顯示，觀察組CEACAM1陽性表達率明顯高于對照組及正常組，證實CEACAM1在結直腸癌中高表達，可能促進腫瘤的發(fā)生和進展；CEACAM1的表達與腫瘤分化程度相關，提示CEACAM1參與腫瘤細胞的分化過程，其高表達時，可以使細胞向成熟過程中的分化形成障礙，更多細胞停留于幼稚階段，此時細胞的異型性增大，腺管形成少，核的染色深，具有更明顯的侵襲性生物學行為；CEACAM1的表達與淋巴結轉移相關，提示CEACAM1可能促進腫瘤的淋巴道播散；CEACAM1的表達與腫瘤的大小和浸潤深度相關，提示CEACAM1高表達可以促使腫瘤生長，使腫瘤的侵襲能力及對周圍組織的破壞能力更強；CEACAM1的表達與腫瘤的臨床分期相關，由于臨床分期是臨床治療及預后判斷的直接依據之一，因此意味著CEACAM1與預后有關聯(lián)。本研究未發(fā)現(xiàn)CEACAM1的表達與性別、年齡、腫瘤部位有關，提示CEACAM1與結直腸腫瘤的發(fā)生關系不大，而與腫瘤發(fā)生后的進展有關，分析原因可能為CEACAM1是VEGF的一個結構效應器，其在血管內皮異常表達后，促使腫瘤細胞分泌VEGF。

表1 觀察組中CEACAM1和VEGF表達與臨床病理特征的關系 例(%)

表2 觀察組中MVD值與臨床病理特征的關系

圖1 CEACAM1和MVD相關分析圖

圖2 VEGF和MVD相關分析圖

VEGF是當今研究最多的血管生成因子，其可以誘導基質血管形成，也可以促進血管內皮細胞增殖，其表達與多種因子具有協(xié)同作用[12-13]。無論原發(fā)性腫瘤還是繼發(fā)性腫瘤，VEGF水平都與血管生成密切相關[14-15]，其可引起血管內皮細胞分裂、重塑，使血管內皮細胞枝芽狀生長，同時經血流沖擊形成管腔[16-17]。本研究結果顯示，觀察組VEGF陽性表達率和MVD值均明顯高于對照組和正常組，提示VEGF和MVD在正常結直腸黏膜上皮細胞不典型增生、癌變及腫瘤性進展中起重要促進作用；VEGF陽性表達率和MVD值與腫瘤分化程度、淋巴結有無轉移、腫瘤臨床分期、腫瘤大小、腫瘤浸潤深度均有關系，與性別、年齡、腫瘤部位均無明顯關系，提示血管生成參與腫瘤的進展過程。

線性相關性分析顯示，觀察組中CEACAM1和MVD、VEGF和MVD均具有正相關性，提示CEACAM1、VEGF均對MVD具有促進作用，由于MVD直接反映間質血管密度及血管生成情況，因此CEACAM1、VEGF與MVD的相關性也反映出CEACAM1、VEGF對間質血管生成的促進作用，即CEACAM1、VEGF高表達時，可以在一定程上促進MVD高表達，從而使腫瘤間質血管生成更明顯，腫瘤細胞生長更活躍，腫瘤體積增大，侵襲性更強。腫瘤血管生成涉及較多的調節(jié)機制及作用，CEACAM1可能是始動因子，其直接調節(jié)血管生成的作用可能不大，而是通過對VEGF的調節(jié)，使血管生成作用更明顯、更直接。VEGF不僅可以直接啟動血管新生，而且還可以通過對其他相關因子的調節(jié)啟動血管生成，如VEGF可以通過ST2/eNOS信號通路刺激內源性NO產生，進而促進血管生成，同時使血管壁的通透性增強。在體外研究中，VEGF能誘導內皮細胞的增殖，同時促進內皮細胞的遷移，加速毛細血管的網格形成，有效促進血管的形成及血管功能的重建[18]。目前針對血管生成的靶向治療使臨床治療效果明顯增加。

綜上所述，CEACAM1、VEGF的高表達及MVD的升高與結直腸癌的生物學行為和進展關系密切，本實驗結果雖然無大樣本及相關臨界指標來進行預后的評估指導，但顯示CEACAM1、VEGF和MVD在預后評估中有關聯(lián)性，可以在以后繼續(xù)進行大樣本量的觀察及隨訪，以期為判斷結直腸腫瘤的生物學行為和預后提供更合理的指標，為靶向藥物治療尋找新的途徑。

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Expression of CEACAM1 and VEGF in colorectal carcinoma and its relationship with angiogenesis

WU Tao, XU Liang, YANG Zhihui

(The Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan, China)

Objective It is to observe the expressions of cancer embryo antigen-related cell adhesion molecules 1 (CEACAM1) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in colorectal cancer, and investigate their relationship and significance with micro-vascular density (MVD). Methods 90 cases of cancer tissue specimens of colorectal cancer patients with routine surgical resection were selected as the observation group, 50 cases of adenoma specimens of colorectal adenoma patients were selected as the control group, and 10 cases of normal colorectal mucosa tissue from the tumor edge >5 cm were randomly selected form the observation group as normal group. The expression of CEACAM1 and VEGF in the tissues specimens in the 3 groups were detected by immunohistochemical method, and the MVD value was record, the relationship between the expression of CEACAM1 and VEGF with MVD were analyzed. Results The positive expression rate of CEACAM1 and VEGF, and the value of MVD in the observation group were significantly higher than those in the control group and the normal control group (allP<0.05). The positive expression rate of CEACAM1 and VEGF, and the value of MVD were significantly associated with the differences of clinical pathological features as degree of tumor differentiation, lymph node metastasis, tumor staging, tumor size, and depth of tumor invasion (allP<0.05), but were not correlated with ages, sex and neoplasm location (allP>0.05). Linear correlation analysis showed that there was a positive correlation between CEACAM1 and MVD, VEGF and MVD in the observation group (allP<0.05). Conclusion The higher expression of CEACAM1 and VEGF, and the higher value of MVD is closely related to the biological behavior and progression of colorectal cancer, the regulate’s associated study of CEACAM1 and VEGF may influence invasion and metastasis, may offer new target index on treatment. The regulation on CEACAM1 and VEGF expression may inhibit the invasion and progression of tumor.

colorectal adenocarcinoma; cancer embryo antigen-related cell adhesion molecules 1; vascular endothelial growth factor; micro-vascular density; immunohistochemical method

吳濤，男，碩士研究生，副主任醫(yī)師，研究方向為胃腸外科。

徐亮，E-mail:xul1104@163.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.33.006

R735.37

A

1008-8849(2016)33-3666-04

2016-07-10